结合CRISPR/Cas12b与LAMP技术的乳粉中克罗诺杆菌属的检测

将CRISPR/Cas12b与环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法相结合,应用于乳粉中克罗诺杆菌属的检测。通过基因组比较寻找克罗诺杆菌菌株基因内部的候选保守序列,针对克罗诺杆菌属特异性关键基因序列设计LAMP引物和向导RNA靶向序列,对其进行条件优化、特异性检测,并用人工污染样品对体系的灵敏度、重复性进行验证。结果表明该方法具有良好的特异性,方法的灵敏度达到了0.1 pg/μL;人工污染样品可检测到初始菌量<10 CFU/g的样品,方法检出限为<10 CFU/100 g。将该方法应用于51份市售乳粉样品以及52份模拟生产环境样品的检测,结果与传统国标方法一致,并且大幅缩短了实验时间。该方法可用于乳粉中克罗诺杆菌属的快速检测。

婴幼儿食品中克罗诺杆菌属的分离鉴定及耐药性分析

通过传统方法对婴幼儿食品中克罗诺杆菌属进行分离鉴定,共分离得到43株克罗诺杆菌属。分别用7种抗生素对分离菌株的药物敏感性进行检测,43株分离株除了对氨苄西林和呋喃妥因(耐药率均为4.65%)、头孢曲松和头孢噻肟(耐药率均为2.33%)耐药外,对氯霉素的(耐药率51.16%)的耐药率最高。

乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)能力验证PCR技术的探索

为提高实验室检测克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的能力,本文依据NIFDC-PT-384乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验能力验证作业指导书、GB4789.40-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验》,探索传统生化方法和PCR技术相结合的检测克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的方法。结果表明,样品CODE12未检出克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌),样品CODE19检出克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌),结果均为满意。本实验室具备检验克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的能力,PCR技术很好地印证了传统生化实验的结果。

婴幼儿乳粉加工环境中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)监控方案的构建

克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)作为婴幼儿配方乳粉中的A类致病菌备受关注。该菌耐干燥,可长期存在于婴儿奶粉生产环境中。婴儿配方奶粉加工、运输及销售等环节都有可能污染克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌),因此控制婴幼乳粉加工环境中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的污染尤为重要。本文结合标准法规要求和婴幼儿配方乳粉企业环境监测的经验,构建出加工过程环境中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)监控基础方案,包括区域划分、采样方案、检测方法、预防措施和纠正措施等,可帮助企业科学有效地控制克罗诺杆菌属的污染风险。

阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)分子检测方法研究进展

阪崎肠杆菌(现克罗诺杆菌属)是一种重要的食源性条件致病菌,因其能通过污染婴幼儿配方食品导致严重的新生儿脑膜炎、菌血症和小肠结肠炎等疾病,而受到广泛的关注。其分子生物学检测方法克服了传统检测方法实验操作繁琐、耗时长等问题。目前常用的分子生物学方法主要有普通PCR、实时荧光定量PCR、环介导恒温扩增、探针方法等。

婴儿配方粉中克罗诺杆菌属菌株的分子溯源技术

克罗诺杆菌属菌株水平上的快速准确的鉴定和区分对于控制由该属引起的食源性疾病的监控、预防和控制具有十分重要的意义。同时,对于分子流行病学的研究也是至关重要的。越来越多的基因分型方法已经被用于克罗诺杆菌属内菌株的分子分型。为了切断克罗诺杆菌属菌株的传播途径和快速确定感染源,本综述主要针对目前克罗诺杆菌属菌株的分子分型方法进行了较为详细的探讨。简要介绍了克罗诺杆菌属分子分型方法的最新研究进展,以便发生乳粉污染克罗诺杆菌属菌株时能够快速溯源,防止食物中毒事件的进一步蔓延。

婴幼儿配方粉中克罗诺杆菌属菌株检测方法研究进展

2008年,阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)被重新命名并被划分成一个新的属即克罗诺杆菌属(Cronobacter spp.),是人和动物肠道内寄生的一种革兰氏阴性无芽孢杆菌,也是一种重要的食源性条件致病菌。2012年,克罗诺杆菌属被进一步重新分类并包括7个种。该属菌株能引起严重的新生儿脑膜炎、坏死性小肠结肠炎和菌血症,严重的可引起神经系统后遗症和死亡。目前,国内外的多篇报道证明婴儿配方粉是其主要的传染源和传播媒介。因此,准确和快速鉴定克罗诺杆菌属菌株是预防和控制该病原菌的重要举措。本综述简要介绍了截止目前克罗诺杆菌属菌株的主要检测方法,期望能为我国检测机构提供一定的借鉴和帮助。

江西省婴儿配方羊乳粉生产加工过程肠杆菌科和克罗诺杆菌属污染情况调查

目的了解江西省婴儿配方羊乳粉生产加工过程中肠杆菌科和克罗诺杆菌属的污染情况,分析其污染来源.方法采集江西省4家企业的婴儿配方羊乳粉及其加工过程中的原辅料、中间产品、包装材料、工具、环境、设备等样品,采用国家标准规定的方法进行肠杆菌科和克罗诺杆菌属检测.结果肠杆菌科的检出率(25.83%)明显高于克罗诺杆菌属检出率(0.80%),其中中间产品肠杆菌科检出率最高(96.55%)、其次是终产品(69.57%);克罗诺杆菌属污染主要是环境,其次是工具和人员相关样品.结论除了包装材料外,江西省婴儿配方羊乳粉生产加工各环节均存在微生物污染,应注意加强原辅料、环境、工具及人员卫生操作意识等多个环节的卫生控制,保障我省婴儿配方羊乳粉终产品的食品安全.

太原市克罗诺杆菌属污染情况调查分析

克罗诺杆菌属在20世纪80年代以后受到人们广泛重视,目前国际上将克罗诺杆菌属共分为了7个种[1]:阪崎克罗诺杆菌(C.sakazakii),丙二酸盐阳性克罗诺杆菌(C.malonaticus),都柏林克罗诺杆菌(C.dublinensis),苏黎世克罗诺杆菌(C. turicensis),穆汀斯克罗诺杆菌(C.muytjensii),普遍克罗诺杆菌(C. universalis),调料克罗诺杆菌(C. condiment)。

RAPID'Sakazakii Agar克罗诺杆菌属显色培养基的性能评价

依据RSA快速筛选方法及GB 4789.40方法,在特异性、检测灵敏度、样品种类、培养条件等方面对伯乐公司RAPID'Sakazakii Agar克罗诺杆菌属显色培养基的性能进行评价。结果显示,该培养基特异性和选择性好,具有高检出率、易观察、易配制、使用方便等特点,可以作为一种选择性培养基在微生物检测行业推广使用。

克罗诺杆菌属快速检测体系的建立

以克罗诺杆菌属具有代表性的2株模式菌株(丙二酸盐阳性克罗诺杆菌和阪崎肠杆菌)为实验对象,建立了一套集一步法DNA提取和快速实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)法检测为一体的速测技术体系。通过优化,建立的快速real-time PCR程序可将扩增时间由普通程序的82 min缩短至27 min 18 s。建立的一步快速DNA提取流程,取样后仅需12 min热循环反应即可直接获取DNA,简便快捷。与传统方法的对比结果显示,快提法与传统煮沸法对纯菌液和人工污染培养前6 h的样品灵敏度一致;对人工污染样品培养7、8 h时,快检法的灵敏度比传统方法低1个数量级。本研究建立的微生物速测技术快速、简便且具有较高灵敏度,在口岸食源性病源微生物现场快速检测方面具有较好的应用前景。

荧光重组酶介导等温扩增快速检测食品中克罗诺杆菌属

目的建立快速简便的荧光重组酶介导等温扩增法(recombinase-aided amplification,RAA)检测克罗诺杆菌属,以满足口岸快速通关及监管需要。方法根据克罗诺杆菌属ompA基因保守区设计特异性引物、探针,通过引物两两组合结合探针筛选出扩增效率及灵敏度最佳的引物组合,优化反应温度及引物探针浓度,确定最佳反应条件。将建立的荧光RAA法应用于食品基质及实际样品检测,同时与GB 4789.40—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验》进行比对验证。结果克罗诺杆菌属荧光RAA最佳反应温度为39℃,最佳引物、探针终浓度均为400 nmol/L。建立的荧光RAA法特异性强,纯菌灵敏度达到10^(2) CFU/mL。加标食品基质婴儿奶粉及婴儿米粉在改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素(modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycin medium,mLST-Vm)增菌只需2 h,即可检测原始浓度达到10-2CFU/mL的克罗诺杆菌属。荧光RAA法只需20~30 min完成扩增,5 min即可观察结果,速度及灵敏度明显高于国家标准方法。结论荧光RAA法简便、快速、无需大型仪器,可用于口岸或其他场所进行克罗诺杆菌属的快速检测与监控。

食品中3M^TM克罗诺杆菌属分子检测系统评价研究

目的用不同来源的克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)、非目的菌、人工染菌食品样品,考核评估3M^TM分子检测系统对克罗诺杆菌属的检出限、灵敏度、特异性和准确度,以及与国标法(GB 4789.40-2016)检验结果的一致性。方法用3M^TM分子检测系统(molecular detection system,MDS)对实验室保存的50株已确认克罗诺杆菌属、40株非目的菌株进行检测,确定该试剂盒的检出限、灵敏度和特异性;对240份人工污染不同浓度目的菌样品,用3M^TM MDS和国标法同时检验,分析方法的准确度和检验结果的一致性。结果3M^TM MDS对50株不同来源的克罗诺杆菌属的检测灵敏度为100%,平均检出限为1.79×10^3 CFU/mL;对40株非目的菌检测结果均为阴性,特异性为100%。用3M^TM MDS与国标方法对人工污染10^1、10^0、10^-1 CFU/100 g克罗诺杆菌属FC718的240份不同来源乳粉、糊精、乳清和乳糖样品进行检测,结果一致性均大于95%,方法准确度为97.5%。结论3M^TM MDS方法具有低检出限、高灵敏和特异性特点,在不同食品样品基质中,检验结果呈现良好的准确度,与国标方法检验结果具有高度一致性,是一项适合基层、企业推广的快速、可靠方法。

基于CRISPR/Cas12b的乳粉中克罗诺杆菌属检测

目的:开发一种基于CRISPR/Cas12b的克罗诺杆菌属分子检测方法。方法:以克罗诺杆菌菌属特异性基因序列为候选区域,针对区域设计扩增引物和向导RNA靶向序列,对其进行条件优化、特异性检测、反应体系优化,并用人工污染样品对体系的灵敏度、重复性进行验证。结果:该方法的特异性很好,方法的灵敏度达0.01 ng/μL,在人工污染样品中可检测到初始菌量<10 CFU/g的样品,方法检出限<10 CFU/100 g。对市售的51份乳粉样品进行检测,结果与传统国标方法一致。结论:建立的CRISPR/Cas12b方法可用于乳粉中克罗诺杆菌属的快速检测。

克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的分离与鉴定能力验证结果与分析

目的通过能力验证,提高实验室对克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的检测能力。方法依据GB4789.40-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验》中的第一法,对能力验证样品进行检验,对分离出的可疑菌落进行生化鉴定,同时用BIOLOG鉴定系统对可疑菌落进行鉴定。结果编号G785和编号V995的2个能力验证样品皆检出克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)。结论本次能力验证获得满意结果,证明本实验室具备克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的检测能力。本次能力验证实验过程中,在以国标法检测的同时,辅以BIOLOG进行鉴定,与传统生化鉴定结果互为印证,提高了检测结果的准确性,对以后的检测工作具有一定的参考价值。

等温扩增技术在克罗诺杆菌属快速检测中的研究进展

环介导等温扩增技术、重组酶聚合酶等温扩增技术、滚环扩增技术和依赖解旋酶扩增技术作为常用的4种等温扩增技术,被广泛应用于克罗诺杆菌的快速检测中。通过分析不同技术的原理并以近5年的具体应用为例,从增菌时间、检出限、鉴定时间、目标菌群、目的基因这几个方面进行系统比较,希望能对企业和监管部门在食品安全控制方面提供相关理论支持。最后提出缩短目标菌富集时间,结果直观易读,多重技术融合将是未来快速检测技术的发展重要方向。

食品中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检测能力验证结果与分析

目的:通过参加中国检验检疫科学研究院测试评价中心组织ACAS-PT1091食品中克罗诺杆菌属检测能力验证项目,提升实验室内部检测克罗诺杆菌属的时效性和准确性。方法:将国标法(GB 4789.40-2016)结合VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定系统进行检测,同时采用BAX system Q7病原微生物快速检测系统分别进行分析。结果:样品21-M262和21-N690均检出克罗诺杆菌属,21-N690样品中含有干扰菌大肠埃希氏菌,样品21-M262中含有干扰菌弗氏柠檬酸杆菌和大肠埃希氏菌,检测结果均满意。结论:两种检测方法结果一致,BAX System Q7病原微生物快速检测方法相比国标法更加便捷和灵敏,两种方法交互验证,效率更快、准确度更高。

某实验室参加食品检验用克罗诺杆菌属标准(样)品协作标定结果与分析

为对食品检验用克罗诺杆菌属标准(样)品克罗诺杆菌属菌的含量水平进行考察,锻炼和提高实验室对克罗诺杆菌属的检验能力,实验室按作业指导书要求进行样品的前处理及培养,计数参照GB 4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落计数检验》,对10份编号分别为CODE 1至CODE 10的球状西林瓶装样品使用TSA琼脂平板进行计数,并从每件样品的TSA琼脂平板上挑取1个菌落进行生化鉴定。通过此次协作标定,标准(样)品克罗诺杆菌属含量在10^(3) CFU/球水平,该实验室检测能力得到了有效锻炼和提高。

克罗诺杆菌属食品分离株种水平鉴定方法比较研究

目的研究食品中分离克罗诺杆菌属种的鉴定方法,旨在建立稳定、可靠的种的鉴定方法。方法本研究选择三种鉴定方法,包括生化鉴定(VITEK 2 Compact)法、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)、全基因组测序,通过比较分析三种方法对19株克罗诺杆菌属的鉴定结果,阐述三种鉴定方法的优缺点及其适用性。结果本研究中19株克罗诺杆菌属的鉴定结果显示,VITEK 2 Compact对阪崎克罗诺杆菌和丙二酸盐克罗诺杆菌的鉴定准确率只有67%和66%,而MALDI-TOF MS和全基因组测序的鉴定结果一致,因此可以判定MALDI-TOF MS能够快速、准确、高通量对克罗诺杆菌属进行种的鉴定。但是MALDI-TOF MS受限于数据库,不能鉴定到亚种的水平。结论本研究结果提示VITEK 2 Compact法不适用于克罗诺杆菌属种的鉴定;全基因组测序鉴定结果准确可靠;MALDI-TOF MS可以实现快速、高通量、准确的鉴定,仍需要进一步研究克罗诺杆菌属3个亚种的蛋白指纹图谱特点,丰富蛋白指纹图谱数据库,使其能够准确鉴定克罗诺杆菌属的7个种和3个亚种。

基于gyrB基因的克罗诺杆菌属菌株PCR快速检测方法的建立

43株克罗诺杆菌属菌株和5株肠杆菌属菌株的gyrB基因被克隆并测序,根据已测序的结果设计了一对特异性引物.经优化后的PCR反应体系只能扩增到43株克罗诺杆菌属菌株的目的片段(438 bp),而无法扩增出其他30株非克罗诺杆菌属菌株.通过系统生物学试验评价得出:该PCR方法的基因组DNA检测灵敏度是1.41 pg/PCR.将56 cfu阪崎克罗诺杆菌菌株ATCC 29544人工污染到3种不同的婴幼儿配方粉中,经人工增菌培养(37℃)6 h后即可扩增到目的片段.将该方法应用于25份实际样品的检测中,结果有3份样品扩增到目的片段.但是经传统的国家标准方法进行检测,只有2份样品检测到克罗诺杆菌属菌株.该方法的建立为快速准确鉴定食品中克罗诺杆菌属菌株提供了一种非常有用的技术手段.