克罗诺阪崎肠杆菌微滴数字PCR定量方法的建立

为建立克罗诺阪崎肠杆菌的微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)快速定量检测方法,针对克罗诺阪崎肠杆菌的特异性单拷贝PapC基因设计引物探针,进行特异性、灵敏度和重复性实验,本文通过对纯菌液进行检测,比较平板计数法、实时PCR和ddPCR方法的定值效果。结果表明,所建立的克罗诺阪崎肠杆菌ddPCR检测方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性。克罗诺阪崎肠杆菌纯菌液中最低定量限为104 CFU/mL,最低检出限为16 CFU/mL。不同浓度的纯菌液的测定,ddPCR与平板计数的测定值结果偏差小于10%,比实时PCR方法的定值结果更加准确。因此,本研究建立的ddPCR方法能够快速、准确、灵敏、特异地定量检测克罗诺阪崎肠杆菌。

乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)能力验证PCR技术的探索

为提高实验室检测克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的能力,本文依据NIFDC-PT-384乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验能力验证作业指导书、GB4789.40-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验》,探索传统生化方法和PCR技术相结合的检测克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的方法。结果表明,样品CODE12未检出克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌),样品CODE19检出克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌),结果均为满意。本实验室具备检验克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的能力,PCR技术很好地印证了传统生化实验的结果。

进口乳制品中克罗诺阪崎肠杆菌分离株耐药性研究

目的对进口乳制品中克罗诺阪崎肠杆菌分离株的耐药性进行研究。方法采用纸片扩散法对99株克罗诺阪崎肠杆菌分离株和1株标准菌株进行药敏性试验,共选择7大类20种抗生素。结果所测试的100株菌株对美洛西林、亚胺培南、美罗培南、庆大霉素、阿米卡星、卡那霉素、妥布霉素、氯霉素、头孢吡肟、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢他啶、环丙沙星和诺氟沙星敏感;对苯唑西林产生耐药;对头孢噻吩、氨苄西林、头孢唑啉、和四环素具有不同程度的耐药性,耐药率分别为65.0%、17.0%、3.0%和2.0%;对头孢唑啉、头孢噻吩、氨苄西林、头孢曲松和四环素中介率分别为25.0%、23.0%、6.0%、2.0%和1.0%;13株对3种抗生素耐药,4株表现多重耐药性。结论进口乳制品中克罗诺阪崎肠杆菌分离株对所测试的大多数抗生素敏感,但对苯唑西林全部耐药,对部分抗生素出现较高的耐药和多重耐药性,因此克罗诺阪崎肠杆菌的耐药性应引起广泛的社会关注。

阪崎克罗诺肠杆菌致病性机理研究进展

阪崎克罗诺肠杆菌是一种革兰氏阴性无芽孢肠道杆菌,可导致新生儿和免疫功能不全的婴幼儿严重脑膜炎、菌血症和坏死性结肠炎,是一种非常重要的食源性条件致病菌。目前,国内外对阪崎克罗诺肠杆菌的致病性及其致病机理的研究报道非常有限。本文通过阪崎克罗诺肠杆菌外膜蛋白A、脂多糖、生物膜、宿主细胞骨架、铁获得机制、海藻糖的存在、超广谱β-内酰胺酶的产生和细胞间相互作用等方面对阪崎克罗诺肠杆菌的致病性机理进行综述。

百里醌对阪崎克罗诺肠杆菌的抑制作用

为探究百里醌对阪崎克罗诺肠杆菌的抑制作用及可能的抑制机理,检测了百里醌对阪崎克罗诺肠杆菌的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentrations,MIC)及对其生长动力学模型的影响,并测定百里醌处理后阪崎肠杆菌胞内ATP浓度、胞内pH值、膜电位、细胞膜完整性的变化,最后利用场发射扫描电子显微镜观察细胞形态的改变。结果表明:百里醌对阪崎克罗诺肠杆菌的MIC为0.3~0.6 mg/m L;百里醌使阪崎克罗诺肠杆菌的生长迟滞期延长,最大生长速率减小;百里醌影响了阪崎克罗诺肠杆菌细胞膜的通透性,表现为:质量浓度为MIC和2×MIC的百里醌使细胞内ATP浓度由6.52μmol/L分别降低为0.27μmol/L和0.17μmol/L,胞内pH值分别由5.69降低为5.22和4.99,细胞膜完整菌体比例分别降低至80%和22%,引起细胞膜膜电位超极化;场发射扫描电子显微镜观测表明百里醌使阪崎克罗诺肠杆菌细胞膜褶皱,菌体干瘪。综上所述,百里醌是通过影响细胞膜通透性和改变细胞形态抑制阪崎克罗诺肠杆菌。这些结果表明百里醌有潜力作为控制阪崎克罗诺肠杆菌的天然抑菌剂应用于食品中。

50种植物源化合物对阪崎克罗诺肠杆菌的抑菌活性评价

阪崎克罗诺肠杆菌(Cronobacter sakazkaii)是一种食源性条件致病菌,它能够引起菌血症、坏死性小肠结肠炎和新生儿脑膜炎等多种疾病。本研究选取50种植物源化合物,检测其在含C.sakazkaii培养基中抑菌圈直径及最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC),旨在评价植物源化合物对C.sakazakii的抑菌作用并筛查优选高效抑菌剂。结果表明:使C.sakazakii ATCC 29544培养基产生可见抑菌圈的植物源化合物有40种,其中7种(香芹酚、百里醌、百里酚、肉桂醛、柠檬醛、原儿茶醛和原儿茶酸)的抑菌圈平均直径不小于13 mm;在本研究选取的50种植物源化合物中,百里酚和香芹酚对C.sakazakii有着最强的抑制作用,对9株C.sakazkaii的MIC均为0.1~0.2 mg/m L;百里醌、肉桂醛、柠檬醛和原儿茶醛对C.sakazkaii有良好的抑菌效果,对C.sakazkaii的MIC为0.30~1.25 mg/m L;阿魏酸、绿原酸、丁香酸、硫辛酸、原儿茶酸、表儿茶素、咖啡酸、丹皮酚和菊苣酸的MIC为2.50~5.00 mg/m L。以上结果表明,部分植物源化合物对C.sakazakii有良好的抑菌作用,有潜力作为天然抑菌剂应用于食品加工、流通、贮藏过程中,从而发挥其控制C.sakazakii的作用。

反式肉桂醛与温和加热结合对复原婴幼儿牛乳中阪崎克罗诺肠杆菌的抑杀作用

研究反式肉桂醛与温和加热结合对复原婴幼儿牛乳中阪崎克罗诺肠杆菌的抑杀作用。将3种阪崎克罗诺肠杆菌的混合菌株(浓度约6.6(lg(CFU/m L)))接种于含有不同质量分数反式肉桂醛(0、0.1%、0.2%、0.3%和0.4%)的复原婴幼儿牛乳样品中,将样品置于25、45、50、55℃培养,并在不同的时间点对样品中存活的阪崎克罗诺肠杆菌涂布计数。为探究反式肉桂醛与温和加热结合的抑杀机制,实验利用LIVE/DEAD?细菌活性检测试剂盒和场发射扫描电子显微镜探究细胞膜完整性及细胞形态。结果表明:0.4%的反式肉桂醛在25℃处理90 min、45℃处理20 min、50℃处理10 min及55℃处理10 min使复原婴幼儿牛乳中阪崎克罗诺肠杆菌总数降低至检出限以下。与反式肉桂醛及温和加热单独作用相比,反式肉桂醛结合温和加热对阪崎克罗诺肠杆菌有显著的抑杀效果(P<0.05),并且随温和加热温度的升高及反式肉桂醛质量分数的增加,效果更加明显。温和加热与反式肉桂醛结合会影响细胞膜的通透性并使细胞破碎瓦解。以上结果表明:反式肉桂醛与温和加热结合有潜力在冲调乳粉过程中应用,从而降低阪崎克罗诺肠杆菌的感染风险。

阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)分子检测方法研究进展

阪崎肠杆菌(现克罗诺杆菌属)是一种重要的食源性条件致病菌,因其能通过污染婴幼儿配方食品导致严重的新生儿脑膜炎、菌血症和小肠结肠炎等疾病,而受到广泛的关注。其分子生物学检测方法克服了传统检测方法实验操作繁琐、耗时长等问题。目前常用的分子生物学方法主要有普通PCR、实时荧光定量PCR、环介导恒温扩增、探针方法等。

食品中克罗诺杆菌(原阪崎肠杆菌)双重PCR检测方法研究

根据克罗诺杆菌(Cronobacter spp.)16S rRNA基因以及局部大分子合成(MMS)操纵子特异序列设计2对引物,经反应体系和条件优化,建立了双重PCR检测方法。特异性检测结果显示,Cronobacter spp.菌株PCR扩增均可见2条特异性条带,而其他菌株PCR扩增均为阴性。纯菌检测双重PCR的灵敏度为6.3×103 CFU.mL-1,而相对应单重PCR的灵敏度分别为6.3×101 CFU.mL-1和6.3×103 CFU.mL-1;人工污染的食品样品(奶粉、牛奶、鸡肉)在经过24 h增菌后,检测限均可达100 CFU.mL-1或100 CFU.g-1。在鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)存在的条件下,双重PCR的检测限没有受到影响。表明本试验建立的双重PCR检测方法具有很好的特异性和灵敏度,能克服食品样品基质及杂菌的干扰,可应用于食品中Cronobacter spp.的检测。

环境因子对阪崎克罗诺肠杆菌生物膜形成的研究

目的研究阪崎克罗诺肠杆菌生物膜的形成特性。方法采用结晶紫染色法检测生物膜形成量,考察培养时间、培养温度以及初始pH值3个环境因子对阪崎克罗诺肠杆菌生物膜形成的影响。结果结果表明培养时间、培养温度以及初始pH值对生物膜形成影响较大,且各阪崎克罗诺肠杆菌的最佳成膜条件分别为:阪崎克罗诺肠杆菌CICC21550最适温度为30℃,最适PH为7,最佳培养时间为36h;阪崎克罗诺肠杆菌CICC 21562最适温度为30℃,最适pH为5,最佳培养时间为48 h;阪崎克罗诺肠杆菌CICC 21544最适温度为42℃,最适pH为7,最佳培养时间为24 h;阪崎克罗诺肠杆菌CICC 21563最适温度为30℃,最适pH为7,最佳培养时间为36 h。结论 4株阪崎克罗诺肠杆菌的生物被膜成膜能力由强及弱依次为阪崎克罗诺肠杆菌CICC 21550、21544、21563、21562。本研究为阪崎克罗诺肠杆菌生物膜相关研究提供理论参考。

反式肉桂醛对阪崎克罗诺肠杆菌抑制作用的研究

为寻求安全有效的阪崎克罗诺肠杆菌（Cronobacter sakazakii,C.sakazakii）的控制方法,该文探究了植物源化合物反式肉桂醛（Trans-cinnamaldehyde,TC）对C.sakazakii的抑制作用及可能的作用机制。试验检测了TC对C.sakazakii的最小抑菌浓度（MIC）及其对C.sakazakii生长曲线的影响;利用LIVE/DEAD细菌活性检测试剂盒、激光共聚焦显微镜和场发射扫描电镜,重点分析了TC对C.sakazakii细胞膜完整性及细胞形态的影响;通过构建复原婴幼儿配方乳模型检测TC在4℃、25℃和37℃对C.sakazakii的抑制作用,充分考虑了TC的实际应用效果。结果表明：TC对C.sakazakii最小抑菌浓度为0.4~1.0 mg/m L并可有效延长C.sakazakii的生长延滞期;浓度为MIC和2MIC的TC使C.sakazakii细胞膜完整性降低至60%和46%并可使其细胞膜皱缩、菌体干瘪;浓度为0.4%（V/V）的TC可在90 min（25℃）和60 min（37℃）使复原婴幼儿配方乳中C.sakazakii的数量降低至检出限以下。本研究结果表明TC有潜力作为天然的抗菌物质应用于奶粉等食品中,从而有效地预防和减少阪崎克罗诺肠杆菌引起的相关食源性疾病。

百里酚和香芹酚对阪崎克罗诺肠杆菌的抑制作用

为探究百里酚和香芹酚对阪崎克罗诺肠杆菌的抑制作用及机理。测定百里酚、香芹酚对阪崎克罗诺肠杆菌最小抑菌浓度(MIC),研究两种物质对阪崎克罗诺肠杆菌生长曲线、膜电位、胞内pH、胞内ATP、细胞膜完整性的影响,利用场发射扫描电镜观测细胞形态的变化。结果表明:百里酚和香芹酚对阪崎克罗诺肠杆菌具有良好的抑制作用,两者对9株阪崎克罗诺肠杆菌的最小抑菌浓度均在0.1~0.2 mg/m L之间。百里酚和香芹酚均可使阪崎克罗诺肠杆菌细胞膜出现超极化,浓度为4MIC的百里酚和香芹酚分别使菌株的胞内p H由5.45降低至4.96和4.97,胞内ATP浓度由0.584降低为0.048和0.027μmol/L,细胞膜完整性分别下降85.0%和88.1%。场发射扫描电镜结果显示,百里酚和香芹酚均能够导致菌体出现干瘪皱缩,细胞膜出现孔洞甚至裂解。结果显示,百里酚和香芹酚对阪崎克罗诺肠杆菌均具有良好的抑制效果,其作用机理可能与细胞膜的通透性及细胞形态有关。百里酚和香芹酚虽然互为同分异构体,但二者对阪崎克罗诺肠杆菌的抑制作用并未表现出明显的规律性差异。

原儿茶醛对阪崎克罗诺肠杆菌毒力因子的抑制作用

探究植物源活性物质原儿茶醛对阪崎克罗诺肠杆菌泳动运动能力、生物被膜形成能力、黏附和侵入Caco-2细胞能力及9种与菌体相关毒力基因转录的影响。结果表明,原儿茶醛对6株阪崎克罗诺肠杆菌实验菌株的最小抑菌质量浓度(minimal inhibitory concentrations,MIC)和最小杀菌质量浓度均为2 mg/mL,对阪崎肠杆菌ATCC29544亚抑制浓度分别为1/200、1/100 MIC和1/50 MIC。亚抑制浓度的原儿茶醛能够抑制阪崎克罗诺肠杆菌在琼脂软平板中泳动运动能力;减弱菌体在12℃和25℃下不同时间段(24、48、72 h)生物被膜的形成能力;降低细菌黏附及侵入Caco-2细胞能力;下调9种与菌体相关毒力基因的转录量。研究结果表明原儿茶醛能够抑制阪崎克罗诺肠杆菌多种毒力因子,其有潜力作为抗生素补充剂或抗毒性物质预防及控制阪崎克罗诺肠杆菌引起的相关感染。

phoP调节子对阪崎克罗诺肠杆菌环境耐受力的影响

为研究克阪崎罗诺肠杆菌中phoP基因与环境耐受力的关系,采用Red同源重组方法构建阪崎克罗诺肠杆菌的phoP基因缺失菌株,并从生长曲线、酸碱耐受、温度耐受等方面,研究phoP基因缺失前后阪崎克罗诺肠杆菌环境耐受力的变化。结果表明:phoP基因缺失菌株的生长速度明显延缓,该基因的缺失减弱了菌对外界酸碱和高温的耐受性,并缩短了热致死时间;phoP基因缺失菌株抵御胆盐环境的能力亦有所下降,与野生型菌株相比,它在4%、8%、12%胆盐溶液环境中的存活率分别降低了19.93%(P<0.05)、40.73%(P<0.01)和45.84%(P<0.01)。此外phoP基因缺失菌株对渗透压的耐受力与野生株相比也显著降低(P<0.05)。综合以上结果表明,phoP基因有助于阪崎克罗诺肠杆菌应对外界环境刺激。

柠檬醛对阪崎克罗诺肠杆菌环境压力耐受能力及抗生素敏感性的影响

探究柠檬醛对阪崎克罗诺肠杆菌(Cronobacter sakazakii)环境耐受能力及对抗生敏感性的影响.首先测定柠檬醛对C.sakazakii的亚抑制浓度;随后使用亚抑制浓度的柠檬醛作用C.sakazakii,探究柠檬醛对菌体干燥、热、渗透压、酸、胆盐耐受能力的影响;同时,研究利用E-test?法检测柠檬醛作用后的菌体对抗生素氨苄西林和头孢西丁敏感性的变化;最后利用逆转录实时定量聚合酶链式反应,分析柠檬醛对C.sakazakii环境耐受相关基因转录的影响.结果表明:质量浓度为31.250μg/L的柠檬醛对阪崎克罗诺肠杆菌的生长没有影响,本研究选择31.250μg/L和15.625μg/L为柠檬醛的亚抑制浓度;亚抑制浓度的柠檬醛使菌体耐干燥、耐渗透压、耐热、耐酸、耐胆盐的能力显著降低,且呈现质量浓度依赖性;并且,亚抑制浓度的柠檬醛增强了菌体对氨苄西林和头孢西丁的敏感性;逆转录实时聚合酶链式反应结果表明,柠檬醛降低了与阪崎克罗诺肠杆菌环境耐受能力相关的多个基因的转录水平.综上所述,柠檬醛可降低阪崎克罗诺肠杆菌的多种环境压力耐受并增强菌体对抗生素的敏感性,本研究将为柠檬醛应用于食品生产加工过程中控制阪崎克罗诺肠杆菌奠定理论基础,也为天然活性物质控制食源性致病菌提供新的思路.

食品工业中阪崎克罗诺杆菌生物膜形成的影响因素与控制策略研究进展

阪崎克罗诺杆菌是一种食源性条件致病菌,它可以引起不同年龄段人群的感染,对于新生儿和免疫功能不全的婴幼儿的威胁尤为严重,引起的症状包括坏死性小肠结肠炎、菌血症、脑膜炎和术后骨髓炎等。在食品生产环境以及设备表面由阪崎克罗诺杆菌形成的生物膜是持久性污染食品的重要来源。因此本文主要综述了在食品工业中阪崎克罗诺杆菌流行病学、生物膜形成的机制以及生物膜控制的策略,旨在为建立安全的无生物膜食品生产环境体系,控制阪崎克罗诺杆菌所致食品的潜在污染以及临床感染提供理论指导。

克罗诺杆菌检测方法研究进展

克罗诺杆菌(Cronobacter spp.)是一类重要的食源性致病菌,其引起的奶粉安全事件和新生儿致病问题受到了社会的高度重视。随着对该菌研究的深入和现代分类技术的不断发展,克罗诺杆菌的分类经历了从种到属的变化。但是截至目前,克罗诺杆菌的污染源和致病机制仍不清楚,为了防止易感人群的大规模疾病暴发,对于该菌的检测和预防尤为重要。本文对克罗诺杆菌的生化检测和分子检测的发展历程及存在问题进行综述,以期为该菌的研究提供参考。

食品中3M^TM克罗诺杆菌属分子检测系统评价研究

目的用不同来源的克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)、非目的菌、人工染菌食品样品,考核评估3M^TM分子检测系统对克罗诺杆菌属的检出限、灵敏度、特异性和准确度,以及与国标法(GB 4789.40-2016)检验结果的一致性。方法用3M^TM分子检测系统(molecular detection system,MDS)对实验室保存的50株已确认克罗诺杆菌属、40株非目的菌株进行检测,确定该试剂盒的检出限、灵敏度和特异性;对240份人工污染不同浓度目的菌样品,用3M^TM MDS和国标法同时检验,分析方法的准确度和检验结果的一致性。结果3M^TM MDS对50株不同来源的克罗诺杆菌属的检测灵敏度为100%,平均检出限为1.79×10^3 CFU/mL;对40株非目的菌检测结果均为阴性,特异性为100%。用3M^TM MDS与国标方法对人工污染10^1、10^0、10^-1 CFU/100 g克罗诺杆菌属FC718的240份不同来源乳粉、糊精、乳清和乳糖样品进行检测,结果一致性均大于95%,方法准确度为97.5%。结论3M^TM MDS方法具有低检出限、高灵敏和特异性特点,在不同食品样品基质中,检验结果呈现良好的准确度,与国标方法检验结果具有高度一致性,是一项适合基层、企业推广的快速、可靠方法。

基于C14-HSL探讨阪崎肠杆菌中信号分子与其生长机制关系

研究37℃阪崎克罗诺肠杆菌(Cronobacter sakazakii)CICC21550在生长过程中信号分子C14-HSL浓度变化的拟合曲线,结合细菌生长的宏观模型,进一步从微观角度探究C.sakazakii的生长机制。结果表明:C.sakazakii CICC21550在对数生长初期已检出C14-HSL信号分子,在细菌生长的稳定期达最大值,随后呈逐渐下降趋势,具有明显的密度依赖性。C14-HSL信号分子的最大浓度Ymax为8.535,最大生成速率μmax为0.825。

乳粉中阪崎肠杆菌检测能力验证结果与分析

目的提升实验室检测乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的速度和准确性。方法依据GB4789.40-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验》和经优化的SN/T1632.3-2013《出口奶粉中阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)检验方法第3部分:荧光PCR方法》以及能力验证作业指导书对乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)进行检测和结果判断。结果通过实时荧光PCR法的快速初筛,初步判断样品CODE29为阴性,样品CODE95为阳性;再经显色平板分离和VITEK2生化鉴定,结果显示:样品CODE29检出肺炎克雷伯杆菌、弗氏柠檬酸杆菌和大肠埃希氏菌;样品CODE95检出阪崎肠杆菌和大肠埃希氏菌。结论本次乳粉样品中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检测能力验证结果合格,为提高相关微生物实验室的检测能力提供参考。