核糖核酸酶barnase基因的克隆策略研究

比较了目前报道的两种克隆barnase基因的方法——barnase基因的单独克隆和barstar抑制剂基因保护下的barnase基因克隆.分别利用4种质粒进行barnase基因的单独克隆时,得到的阳性克隆数量少.对其中15个阳性克隆进行了测序分析,结果有5个克隆出现碱基缺失,1个克隆出现碱基增加,其余9个克隆则出现氨基酸突变,均未得到氨基酸序列完全正确的克隆.进一步分析表明这些突变的位点大多直接与保持barnase蛋白的活性位点相关.而在克隆barnase基因之前,预先将barstar基因连同其自身启动子加载于待克隆载体上,随后再进行barnase基因克隆时则容易得到与报道的barnase基因序列完全一致的阳性克隆.分析认为由于barnase基因单独存在时有一定数量的蛋白表达,宿主菌大肠杆菌无法忍受而通过某种方式造成其barnase发生相应突变而无法实现barnase基因的单独克隆.因此有必要利用barstar基因的保护来进行barnase基因相应的克隆和遗传操作.