Pim-3基因转染对心肌缺氧／复氧损伤的保护作用

目的：克隆原癌基因Pim-3并构建其GFP表达质粒，探讨Pim-3对心肌细胞遭受缺氧／复氧损伤时所起的保护作用。方法：采用RT-PCR从Wistar大鼠心肌组织中提取并克隆Pim3基因，经酶切和连接反应构建GFP表达质粒，分别为pEGFP-N2-Pim-3质粒和pEGFP-N2（空载质粒），经脂质体转染人原代培养的心肌中，随机分为七组，分别为对照组、对照＋pEGFP-N2组、对照＋pEGFP-N2-Pim-3组、缺氧复氧损伤组、缺氧复氧损伤＋pEGFP-N2组、缺氧复氧损伤＋pEGFPN2-Pim-3组、缺氧预适应处理组。实验结束时全自动生化仪检测培养液中乳酸脱氢酶（LDH）活性、四唑盐（MTT）比色试验测定细胞存活率、TUNEL法与P1-An-nexin V法测定心肌细胞凋亡、流式细胞仪测定心肌细胞线粒体膜电位（△ψm），并且测定Pim-3 mRNA及蛋白表达水平（RT-PCR、Western-blotting法）的改变。结果：经酶切证实和测序鉴定，成功克隆大鼠Pim-3基吲，并且细胞转染效率达15％；在缺氧复氧损伤后，pEGFP-N2-Pim-3转染组较pEGFP-N2转染组／未转染组的LDH值明显降低（p〈0．01），细胞存活率则明显升高（P〈0．01），凋亡细胞明显减少（P〈0．01），线粒体膜电位（△皿m）则明显升高（P〈0．01）；电镜结果表明转染了pEGFP-N2-Pim-3的心肌细胞线粒体膜大都完整，嵴清晰，较之pEGFP-N2转染组／未转染组损伤明显减轻；RT-PCR和Western-blotting结果显示，Pim-3在正常组几乎不表达，缺氧复氧损伤组明显升高（p〈0．01），缺氧预处理组的表达则比缺氧复氧损伤组更为升高（P〈0．05）。结论：外源性Pim-3基因转染人心肌细胞，对心肌细胞的缺氧／复氧损伤具有明显的保护作用。