坛紫菜体细胞的连续克隆培养和悬滴培养

随着用于分离海藻体细胞和原生质体工具酶的增多,近几年来,海藻单离细胞和原生质体的培养取得了较大进展,特别是对一些经济海藻如海带、紫菜的原生质体培养,国内外均进行了大量研究。严兴洪等把坛紫菜叶状体体细胞的复杂发育分化趋势初步归结成八类,并且建立了坛紫菜叶状体体细胞的分化模型。阐明坛紫菜叶状体体细胞的发育分化规律,不仅能为利用坛紫菜体细胞直接快速采苗,改进传统采苗工艺的新技术提供科学的理论依据,而且对于开展坛紫菜体细胞与其它紫菜间的细胞融合的正确选材以及细胞融合以后的杂种筛选等研究均具较大意义。为此,我们对坛紫菜叶状体体细胞进行了连续数代克隆培养。单个细胞培养在高等植物中已获成功,但在海藻细胞培养中还未见报道,探讨单个细胞培养途径,对开展海藻细胞工程研究具重要价值。结果报告如下:

人骨髓基质干细胞的单细胞克隆培养与鉴定

背景:骨髓基质干细胞缺乏特异的表面识别分子,其鉴定一直是研究中的难题。目的:探索人骨髓基质干细胞培养条件,获得体外克隆化培养的成人骨髓基质干细胞,并对其进行表型分析及分化潜能鉴定。方法:外科手术取髂骨术中抽取骨髓,采用密度梯度离心法初步分离骨髓基质干细胞,用极限稀释法进行克隆化培养;流式细胞仪对克隆化培养的骨髓基质干细胞进行细胞表面标志检测,并进行体外成软骨、成骨及心肌细胞诱导,免疫组织化学及RT-PCR检测成软骨、成骨及心肌细胞表达,确定其表型及分化潜能。结果与结论:单个细胞来源骨髓基质干细胞在体外1:3传代一般可以传28代左右,24代以前生长状态良好;经流式细胞仪检测,骨髓基质干细胞表达CD29,CD44,CD106,不表达CD14,CD34,CD45,HLA-DR;骨髓基质干细胞体外可向成骨、成软骨及心肌细胞分化,提示体外克隆化培养的骨髓基质干细胞能维持良好的成体干细胞生物学特性。

单克隆培养法分离、培养胶质瘤干细胞

目的观察单克隆培养法从人脑胶质瘤细胞系SHG44中分离、培养肿瘤干细胞的结果。方法取对数生长期SHG44细胞,用无血清培养基进行肿瘤干细胞的分离培养及单克隆培养,免疫荧光染色法对分化前后的肿瘤球行CD133、神经巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白质(GFAP)、小管蛋白β-Tubulin染色,MTT法检测肿瘤干细胞的增殖情况,流式细胞术检测CD133阳性细胞比例。结果单克隆分离培养的细胞球表达CD133及Nestin干细胞标记物,分化后表达星形胶质细胞GFAP及神经元β-Tubulin标记物,细胞球生长约第5天增殖率达到峰值。结论单克隆培养法可成功分离培养出胶质瘤干细胞,分化前后的细胞球可表达干细胞标记物、神经胶质细胞及神经元标记物,肿瘤球具有较强的增殖及分化能力,并含有一定数量的CD133阳性细胞。

人外周血T淋巴细胞亚群的克隆培养与分析研究

人T细胞克隆培养始于70年代末,目前国内尚未见报告。本文是简化的一步法获得成功。培养体系中,PHA 2μl/ml,2-ME 5×10^(-5)M/ml,SRBC 0.1%为最佳条件。在 T 克隆中,E-玫瑰花结形成细胞数为90.9%,OKT-4阳性率51.3%,OKT-8为44.1%,OKT-4:OKT-8之比为1.2:1。培养7例淋巴瘤细胞(T 淋巴瘤3例,B 淋巴瘤4例),均可获得克隆成功。这一克隆体系将应用于 T 细胞系的建株,评价各类病人及婴幼儿的 T细胞功能以及用于研究中药对细胞免疫功能的影响等。

新鲜取材的人体肿瘤标本在软琼脂中直接克隆培养(简报)

我们在利用人癌细胞系进行克隆形成试验的基础上,摸索了一些适用于新鲜取材的人体肿瘤标本克隆培养的条件,成功地对26例恶性肿瘤细胞克隆生长进行了评价。其方法如下: 实验标本来自本院外科和门诊手术肿瘤患者。其中卵巢癌实体肿瘤9例,卵巢癌腹水13例,肺癌胸水例,转移性胃癌腹水1例,都经病理学或细胞学检查确诊。实体肿瘤标本剪碎后在胶原酶和脱氧核糖核酸酶溶液中进行单细胞消化,分离。胸腹水细胞离心后,用氯化铵去除红细胞。

肾上腺毛细血管内皮细胞的克隆培养及应用

目的 建立系统的毛细血管内皮细胞长期克隆培养体系。方法 通过分离牛肾上皮质，培养毛细血管内皮细胞井对其进行克隆鉴定。并对其在内皮细胞抑制素活性检测的应用方面进行研究。结果 成功分离井克隆培养了毛细血管内皮细胞，应用研究显示内皮细胞抑素能明显抑制毛细血管内皮细胞的生长，并且在一定范围浓度内呈剂量依赖性，到达一定浓度后，这种抑制作用则不再随浓度的升高而增强。VI-Ⅱ因子相关抗原的免疫组化检测为阳性反应，核周胞质出现黄绿色的明亮荧光环。结论 通过对内皮细胞的培养方法进行研究的基础上，改进毛细血管内皮细胞的培养方法，建立系统的克隆培养体系，对进一步研究毛细血管内皮细胞提供了有力的支持。

克隆培养能帮助拯救受困的种系吗

克隆培养能帮助拯救受困的种系吗＠李易克隆培养能帮助拯救受困的种系吗李易译王立校１９７５年当贝那什克在圣迭戈动物园启动一项冷冻濒危种系细胞的计划时，他设想他的同事将利用该收集物解决像动物中遗传相似的复杂问题。他绝未料到科学家们有一天可能从这个“冷冻动物园”提...

共和党人试图扩充克隆培养禁令

共和党人试图扩充克隆培养禁令＠洪昀共和党人试图扩充克隆培养禁令洪昀译金可校克林顿总统提议的宣布人的克隆为非法的法律上周刚一到达国会，就引起共和党人不满是很明显的。众议院和参议院保守的共和党人指望推行一个更强硬的法律永久禁止不仅是以繁殖为目的的人的克隆，而且...

体外琼脂克隆培养对胎肝干细胞分化的影响

目的 探讨和建立体外扩增胚胎肝干细胞并抑制其分化的培养条件及方法.方法 胶原酶结合机械消化法制备14 d胎龄大鼠胎肝干细胞悬液.将细胞随机分为两组.一组接种至Ⅰ型胶原包被的培养板中,常规贴壁培养.另一组细胞则接种至软琼脂培养基中进行悬浮培养.倒置显微镜下观察两组细胞的生长.培养2周后收集两组细胞,电镜观察两组细胞超微结构的差异,流式细胞仪检测其CD90.1＋、CD49F＋等干细胞标志物表达特征,碱性磷酸酶染色检测其分化状态的差异.结果 悬浮培养的胎肝干细胞具有高核浆比、胞浆内细胞器不发达等超微结构特征,并高表达CD90.1、CD49F等干细胞标志物,碱性磷酸酶染色阳性;而常规贴壁培养的胎肝干细胞则在培养过程中显示出显著的分化特征.结论 琼脂克隆培养的胎肝干细胞较有血清贴壁培养分化程度低,在琼脂克隆培养条件下能增殖形成具有显著干细胞特征的克隆球.

骨髓基质干细胞的单克隆化培养和多向分化的实验研究

目的通过对骨髓基质干细胞(marrow stromal cells,MSCs)的单克隆化培养、鉴定和扩增,获得从一个单细胞扩增出的大量均质MSCs,并研究其多向分化能力。方法无菌条件下获取大鼠骨髓细胞,在培养的过程中挑出相应的单细胞克隆。将挑出的单细胞克隆与饲养细胞混合培养,快速进行扩增和细胞表面标志的鉴定,并进一步行增殖和细胞分化实验。结果在含有特定饲养层细胞的培养条件下,单克隆来源的MSCs能在抑制分化的状态下大量扩增,并保持细胞的均质性;而且在这种培养条件下,MSCs的增殖能力明显增强,并能成功被诱导向软骨、神经样细胞分化。结论通过骨髓细胞的单克隆培养,获得了均质和多向分化潜能的MSCs,为进一步更精确的研究MSCs的生物学特性提供了基础。

体外克隆化传代培养人年轻恒牙牙髓干细胞的研究

目的:观察克隆化传代培养10代以上人年轻恒牙牙髓干细胞的形态及特性。方法:体外分别采用传统传代法和克隆化传代法培养人年轻恒牙牙髓干细胞,流式细胞仪分别检测两种培养方法传代第10代细胞表面抗原stro-1的表达。细胞连续性克隆化传代培养。结果:克隆化传代培养的第10代细胞表面抗原stro-1阳性率高于传统传代培养的细胞(P<0.05)。所培养的细胞具有干细胞的形态特征,呈集落型生长。目前细胞已稳定传代22代。结论:克隆化传代培养能有效提纯人年轻恒牙牙髓干细胞,细胞能稳定传代20代以上并保持干细胞特性。

上海地区户尘螨的分离培养及Der p 2基因的克隆与表达

克隆化培养上海地区户尘螨,获得不同编码序列的重组Der p 2变应原进行当地人群血清特异性IgG分析,探讨其应用价值。从过敏性疾病患者床褥采集分离户尘螨,采用封闭式培养系统进行培养,分离培养单个孕螨获得克隆化的螨群。用RT-PCR的方法扩增不同螨克隆的Der p 2编码基因,插入原核表达载体pET-19b在大肠杆菌内进行表达,所获得的蛋白经Dot blot和ELISA检测其抗原性及与人群血清IgG的反应水平。结果显示,成功对户尘螨种群进行克隆化培养。获得14个核苷酸多样性位点,对应的两个不同序列的重组Der p 2蛋白与鼠单抗1D8的亲和力不同,但与上海地区人群IgG结合力相似(r=0.864)。检测不同地区尘螨主要变应原的序列多样性,有助于开发更有针对性的疫苗组分,以及特异性保护性IgG的筛选。

草履虫单克隆培养种群增长趋势比较研究

【目的】筛选行之有效的草履虫(Paramecium)单克隆培养方法。【方法】结合形态学与SPSS统计学方法对7种单克隆培养方法下的草履虫种群增长趋势进行比较研究。【结果】采用稻草培养法、大米培养法、莴笋叶榨出汁培养法、熟鸡蛋黄培养法、马铃薯培养法、玉米培养法、酸奶培养法等不同草履虫单克隆培养法培养的草履虫在单克隆培养过程中存在明显的时空量化关系及与之相关联的生殖方式。【结论】马铃薯培养法培养效果最差,而莴笋叶榨出汁培养法培养效果最好;生殖方式直接影响草履虫的种群增长趋势。草履虫的单克隆培养不仅应该选择行之有效的方法,还应掌握虫体在培养过程中的时空量化关系,以保证对草履虫材料的足量需求。

人NK细胞克隆化培养条件的初步探讨

为探讨NK细胞克隆化培养的条件,我们首先将人外周血单个核细胞经rhIL-2诱导,使NK细胞得以扩增后,去除T细胞,得到相对纯化的NK细胞。经有限稀释,在饲养细胞及rhIL-2、PHA及LCM等培养条件下,获得NK细胞的单个克隆并进行鉴定。结果表明,每96孔板可获4-16个CD3^-CD56^+NK克隆,每个克隆的细胞数最多可达2.35×10~4,存活约3-5周。以丝裂霉素C(25μg/ml)作为饲养细胞抑制剂,以rhIL-2 200u/ml、PHA 10μg/ml及10％LCM培养,可获得较多的克隆和细胞数。

人小涎腺成纤维样单克隆细胞的成骨分化

目的:探索人小涎腺成纤维样单克隆细胞的体外培养、扩增方法,鉴定其性质,研究向成骨细胞分化的潜能。方法:组织块贴壁法原代培养人小涎腺细胞,收集成纤维样细胞,用96孔板稀释铺板法克隆培养,免疫荧光和RT-PCR检测细胞表型,并进行成骨诱导分化,通过骨钙素、一型胶原免疫细胞化学染色及碱性磷酸酶、茜素红钙结节染色鉴定成骨分化。结果:成功的在体外扩增培养出人小涎腺成纤维样单克隆细胞,免疫荧光证实细胞表达CD13、CD29、CD106和CD44,RT-PCR显示CK18、α-SMA、vimentin、CD106、nestin基因表达与人骨髓间充质干细胞相似。成骨诱导8天后,碱性磷酸酶表达阳性率100%,19天后骨钙素和一型胶原大量表达,并形成钙结节。结论:所建立的分离培养体系能够获得大量人小涎腺成纤维样单克隆细胞,免疫表型类似于间充质干细胞。在成骨诱导培养条件下具有良好的向成骨细胞分化的潜能。

全克隆在肿瘤干细胞研究中的应用和局限性

全克隆指细胞在体外通过克隆培养法形成的一种紧密规则的克隆。具体方法是使单细胞悬液重新繁衍成新的细胞群体，其中紧密、规则、具备连续传代能力的是全克隆。研究已证实全克隆来源于干细胞．而近年来的肿瘤干细胞（TSC）研究发现肿瘤组织中存在小部分细胞在克隆培养中形成全克隆，其具有自我增殖、分化的能力，并具有很强的成瘤性．

克隆羊的技术又获突破

克隆羊的技术又获突破＠燕燕克＼隆＼羊＼的＼技＼术＼又＼获＼突＼破燕燕用克隆技术制造出多莉的英国科学家们又成功地复制出加入人类基因的雌性绵羊宝莉，这意味着将来作为医疗用途的人蛋白质和血液的供应可以源源不断。英国爱丁堡罗斯林研究所的科学家们把人的基因放到成年羊...

分泌抗霍乱弧菌单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立和应用

霍乱是一种严重危害人民健康的肠道传染病,发病急,传播快。长期来,人们对本病的控制作了大量工作。但迄今用于霍乱特异性诊断的血清和预防用菌苗均为多克隆抗体和复杂的菌体抗原。

CD8a＋DC新基因的克隆，功能鉴定与药物研发

目的：分离小鼠脾脏CD8α＋树突状免疫细胞（LDC）的特异基因，了解这些基因与抗原递逞功能的哭系。找到LDC的特异表面标志和特异功能基因。利用LDC特异基因产物作为自身免疫疾病、病毒性疾病和肿瘤的免疫治疗手段，从中筛选出有效的候选药物。方法：从60只小鼠脾脏LDC中纯化出10ug左右的总RNA，以对应的MDC细胞RNA为对照，采用减数抑制杂交法（Suppression Subtractive Hybridization，SSH）建立了特异性针对LDC的减数cDNA文库。从该文库中克隆了100多个序列，从中筛选出LDC特异的14个基因，用半定量PCR证实这些基因在LDC中高表达，而在MDC中则表达较低。体外实验采用DC细胞系DC2．4来验证从LDC文库中分离的基因能够在该细胞系表达。21个序列的RT-PCR结果阳性。为了解基因在DC中的作用，选择了12个基因进行RNA干扰实验。设计出特异的siRNA，插入到载体pSilencer1．0内，转化后酶切鉴定并测序，然后将siRNA质粒分别电转化到DC2．4细胞，经G418持续筛选，再用稀释法挑单克隆培养，每个基因最少挑6个以上的单克隆细胞扩大培养。最后用RT-PCR和实时PCR鉴定6个克隆的基因抑制率。挑选抑制率在80--90％以上的siRNA亚克隆细胞系进行基因功能鉴定。功能鉴定采用的是抗原递逞实验，将siRNA亚克隆细胞，DC2．4细胞和空质粒转化的DC2．4细胞分别与OVA可溶性抗原，吸附在乳胶颗粒表面的OVA抗原，乳胶颗粒和空白对照等培养过夜，用针对OVA抗原的25D1．16等单抗标记细胞，用流式细胞仪检测DC细胞表面的OVA抗原等。体内功能实验方法是，将这些克隆与病毒培养后，输入小鼠体内，用流式细胞仪检测受DC递逞的病毒抗原刺激后小鼠T细胞产生1，干扰素的能力。结果：基因14、79、94等的siRNA亚克隆细胞的25D1．16的表达明显低于对照细胞（P〈0．01）。基因14等的siRNA亚细胞克隆刺激小鼠T细胞产生干扰素的能力显著降低（P〈0．01）。结论：基因14、79、94等和LDC的抗原递逞功能密切有关，使用这些基因的siRNA可以降低LDC的免疫功能，具有免疫治疗功效，是良好的治疗自身免疫耐受，减少移植物免疫排斥的候选药物。相反，运用这些基因和其产物可以提高细胞免疫功能，对肿瘤治疗具有价值。