两种培养方法用于乳腺癌SK-BR-3细胞克隆形成实验的对比研究

目的观察平板克隆形成实验(PCF)和软琼脂克隆形成实验(SACF)用于乳腺癌SK-BR-3细胞学研究的价值。方法接种1×103～6×104个细胞于12.5 cm2培养瓶(设4个平行样本),分别利用PCF和SACF培养,计数形成克隆数、计算克隆形成率。结果 PCF克隆形成率为0.50%～10.64%,其中接种密度≥1.6×103/cm2者细胞间迅速汇合、难以分辨形成的克隆;SACF克隆形成率为0%～0.33%,接种密度<6.4×102/cm2者无克隆形成。PCF克隆形成率显著高于SACF(P<0.05)。结论检测SK-BR-3细胞对药物或其他治疗方式的敏感性时采用PCF优于SACF。

软琼脂克隆形成实验评价药物体外抑瘤性与成瘤性

目的:分别采用肿瘤细胞系和转化细胞系摸索软琼脂克隆形成实验的适宜条件,并对冬凌草甲素(oridonin,ORI)的抑瘤性和没食子酸乙酯(ethyl gallate,EG)促瘤性进行评价。方法:1)摸索实验条件:采用6孔板固态培养法,按不同密度(每孔500~20 000个)将肿瘤细胞系(Hela,K562和Hep G2)和转化细胞系(Bhas 42)与软琼脂混合铺板,计数克隆形成率。2)Hep G2细胞分别与质量浓度为0.016、0.08、0.4、2、10、50μg·mL^(-1)的ORI溶液混合后铺板;Bhas 42细胞预先经质量浓度为0.3、1、3μg·mL^(-1)的EG溶液处理后,镜下观察细胞达到转化状态后,与软琼脂混合铺板培养。经培养后观察给药处理对克隆形成率的影响。3)利用流式细胞仪分析ORI和EG对细胞周期的影响。结果:细胞接种密度为每孔1 000个左右时,利用肿瘤细胞和转化细胞开展软琼脂克隆形成实验效果较好。ORI作为抑瘤药物在低浓度条件可显著降低Hep G2细胞的克隆形成率(P<0.01),且对细胞增殖有抑制作用。EG随给药浓度增加可显著升高Bhas 42的克隆形成率(P<0.01),但对细胞增殖影响不显著。结论:软琼脂克隆形成实验以克隆形成率为检测指标,可较为简便而灵敏地检测药物引起的抑瘤性和促瘤性。该实验结果与细胞周期分析结果相互印证。两者的有机结合,可用于药物对细胞增殖及成瘤性的影响的初步分析。

hASCs的单克隆培养及干细胞相关标志物表达的实验研究

目的通过对人体脂肪组织来源干细胞(hASCs)进行单克隆培养,以获得单克隆hASCs。并比较不同克隆干细胞相关标志物的表达。方法①临床手术切取脂肪组织,经胶原酶消化法原代培养,细胞培养并传至第2代后,有限稀释法进行克隆形成实验。②针对获得的单克隆hASCs,用流式细胞仪检测不同克隆CD29、CD34、CD44、CD54、CD106、ABCG2的表达。结果①通过克隆形成实验共获得10个单克隆细胞群,并成功扩增到第9代后冻存。②不同克隆细胞群体具有相似的成纤维细胞样形态,但增殖活力各异。③干细胞相关标志检测显示:各个群体均高表达CD29(92.9±7.4%)、CD44(94.6±6.8%),低表达ABCG2(2.5±1.4%),但CD34、CD54和CD106的表达在不同群体间有明显差异。结论酶消化法获得hASCs是含有不同分化潜能干细胞以及其他多种细胞的混合群体。用单克隆培养的方法可能获得纯化的单一细胞群,不同的克隆之间的表面抗原表达既有共性和又有差异,这种差异可能与不同克隆间分化潜能的不同相关。

酵母LAG1同源的人类长寿保障新基因LASS2的克隆和功能研究

目的 分离和克隆肝癌相关基因。方法 我们用高通量功能筛选和RACE(rapidamplificationofcDNAends)方法从人肝cDNA文库中克隆到一个与酵母长寿保障基因LAG1高度同源的人类新基因LASS2 (homosapienslongevityassurancehomologue 2ofyeastLAG1)。结果 LASS2在正常人肝组织和肾组织中高表达 ,其表达谱不同于早先在人中克隆到的另一个与酵母LAG1高度同源的人类长寿保障基因LAG1Hs- 1。放射杂交基因定位显示LASS2位于人类染色体 1q11,酵母双杂交和GST结合实验发现LASS2蛋白能与细胞中的几个膜相关受体或转运体相互作用 ;另外 ,LASS2在体外对人肝癌细胞的克隆形成具有抑制作用 ,提示该基因可能参与细胞的生长调控。结论 LASS2是一个新的肝癌相关基因。

miR-154对前列腺癌细胞功能影响的实验研究

目的研究miR-154在对前列腺癌组织中的表达及其对前列腺癌细胞生物学功能的影响。方法采用RT-PCR方法检测前列腺癌和癌旁正常组织样本中miR-154的表达。运用细胞增殖实验(CCK-8法)、克隆形成实验及细胞周期分析评估上调miR-154对前列腺细胞系DU145和PC-3的作用。结果与癌旁正常前列腺组织相比,miR-154在前列腺癌组织中的表达水平显著下调。体外实验中,miR-154过度表达能显著抑制癌细胞的生长,细胞克隆形成数明显降低。流式细胞术检测发现癌细胞的生长受到抑制,在G0/G1期比率明显升高,而上调miR-154可以使前列腺癌细胞阻滞在G1期,而抑制细胞的增殖。结论 miR-154可以影响前列腺癌细胞的增殖功能,有望成为前列腺癌治疗的新靶点。

改良TRIzol法提取肿瘤细胞琼脂克隆的总RNA

琼脂克隆形成实验是肿瘤研究领域中一种重要的体外实验,可用于筛选转化细胞、评价肿瘤细胞药物敏感性[1]等。有研究表明,琼脂克隆形成实验筛选的肿瘤细胞具有肿瘤干细胞的特性[2],有更强的致瘤性和转移能力[3]。

蛇床子素对胃BGC-823细胞的体外放疗增敏作用的实验研究

目的:研究中药单体蛇床子素(Ost)对胃BGC-823细胞的体外放疗增敏作用。方法:采用MTT法检测单药及联合放疗对BGC-823细胞的作用;细胞克隆形成实验检测Ost对BGC-823细胞的放疗增敏作用;流式细胞术分析Ost及放疗对BGC-823细胞的细胞周期及细胞凋亡的影响。结果:Ost对BGC-823细胞具有增殖抑制作用;低细胞毒剂量的Ost(15μg/ml)对BGC-823细胞具有放疗增敏作用,经单击多靶模型拟合后,Ost联合放疗组细胞存活曲线较单纯放疗组左移,D0、Dq值变小,放疗增敏比SER=1.64。结论:低细胞毒剂量的Ost(15μg/ml)对BGC-823细胞具有放疗增敏作用,其机制可能与增加放疗诱导的细胞凋亡,引起放疗敏感时相G1期细胞阻滞,减少放疗相对抗拒时相S期细胞比例相关。

一种分离人表皮角质形成细胞的新方法

目的:探索一种简单快速无需分开表皮和真皮即可分离得到人表皮角质形成细胞(KC)并进行体外培养的方法。方法:取皮肤组织切碎后,先用含分散酶和Ⅰ型胶原酶的消化液37℃浸泡60 min,然后加入胰酶消化30 min,再加入DNA酶继续消化5 min以获得单个细胞;加入含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中和消化,用100μm细胞过滤器过滤,离心后,用含10 mmol/L Rock蛋白激酶抑制剂的DMEM培养基(含10%FBS)培养,3 d后换成Cn T07培养基。每2 d换液1次,培养过程中,观察细胞生长状态。结果:与传统分散酶分离表皮KC方法相比,用该方法分离得到的表皮KC数量较多,第1代以克隆形式生长并且生长较快;传代后细胞呈角质细胞形态,主要表达未分化的角质蛋白K5,生长曲线和形成单细胞克隆能力和传统分离的表皮KC相近,并稍优于传统方法。采用新方法成功地从带毛发的头皮组织分离出大量的表皮KC并表达正常的角质蛋白。结论:该法得到的表皮KC形态、生长状态及形成单克隆的能力都接近或优于传统方法。该方法简单高效,具有较高的实用价值,尤其为以后临床上大量分离患者的表皮KC用于细胞治疗奠定基础。

热化放三联因子对Hela细胞杀伤效应的实验研究

本文以体外培养的宫颈癌Hela细胞系为模型,以细胞克隆形成实验及细胞周期相分布测定为指标,观察了高温、顺铂及放射线对细胞的杀伤效应。结果表明:①从细胞克隆形成实验所得存活分数(SF)证明热化或热放二联因子较热、化、放任何单一因子对细胞的杀伤效应大,且热化优于热放。热化放三联因子应用时,杀伤作用更大。②从流式细胞仪测定的细胞周期时相分布表明,Hela细胞周期时相对热化因子较敏感,剂量小时,S+G_2/M增殖期细胞增加,呈激惹反应;剂量大时,S+G_2/M增殖期细胞减少,呈抑制反应。热放组于24小时无明显改变,96小时S+G_2/M增殖期细胞呈轻度增加现象。

子宫颈鳞状细胞癌中超保守核糖核酸339的表达及其临床病理意义

目的分析子宫颈鳞状细胞癌(CSCC)中超保守核糖核酸339(uc.339)的表达水平及其临床病理意义,探讨uc.339对宫颈癌细胞增殖的影响和相关机制。方法收集102例CSCC标本的临床特征。通过实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测uc.339在CSCC组织中的表达水平,分析uc.339与临床病理特征的关系。通过MTT实验和克隆形成实验分析uc.339对细胞增殖的影响。采用生物信息学预测uc.339下游靶基因;采用qRT-PCR验证uc.339对靶基因微小RNA-339-5P(miR-339-5P)的影响;采用双荧光素酶报告实验验证uc.339对miR-339-5P的调控作用;采用回复实验证实uc.339对miR-339-5P调控及对宫颈癌细胞增殖的影响。结果qRT-PCR实验结果表明,CSCC组织中uc.339的表达水平高于癌旁正常宫颈组织,差异有统计学意义(P<0.05)。uc.339的表达与肿瘤大小(Pearson′s R=7.909)和病理分级(Pearson′s R=-4.859)显著相关(P<0.05),与患者年龄、人乳头瘤病毒(HPV)感染、淋巴结转移和TNM分期无相关性(P>0.05)。MTT实验提示过表达uc.339可促进宫颈癌细胞增殖,而降低uc.339表达则抑制了细胞的增殖,差异有统计学意义(P<0.05)。细胞克隆形成实验表明,过表达uc.339宫颈癌细胞克隆形成数目多于Scramble对照,降低uc.339表达宫颈癌细胞克隆形成数目低于si-对照,差异均有统计学意义(P<0.05)。生物信息学预测显示miR-339-5P是uc.339的靶基因;在宫颈癌细胞中过表达uc.339后,miR-339-5P表达水平下降,而降低uc.339表达后,miR-339-5P表达水平则升高,差异有统计学意义(P<0.05)。双荧光素酶报告实验证实uc.339与miR-339-5P特异性结合,并可负性调控miR-339-5P的表达。回复实验提示过表达miR-339-5P能消除uc.339对宫颈癌增殖的促进作用,而降低miR-339-5P的表达则能进一步激发宫颈癌细胞的增殖活性。结论CSCC中uc.339表达水平上调,可能是一个新的致癌基因。uc.339通过抑制miR-339-5P表达促进CSCC细胞的增殖。

白花蛇舌草石油醚部位对子宫内膜癌细胞的抑制作用

目的:探究白花蛇舌草石油醚部位体外对子宫内膜癌细胞增殖的抑制作用及机制。方法:白花蛇舌草石油醚部位处理子宫内膜癌Ishikawa细胞株,倒置相差显微镜观察细胞生长状态;MTT法检测细胞存活率;平板克隆形成实验检测癌细胞克隆形成能力;PI染色,流式细胞仪检测细胞周期。结果:白花蛇舌草石油醚部位对体外培养的人子宫内膜癌细胞具有明显的细胞毒性,其IC50值为32.917μg·m L-1。该药物显著抑制Ishikawa细胞增殖以及细胞的克隆形成能力,而且作用效果具有明显的剂量依赖效应。该部位可使细胞周期阻滞在G1期。结论:白花蛇舌草石油醚部位体外抗人子宫内膜癌活性显著,可能为该中药材发挥抗癌作用的主要活性成分,其机制可能与阻滞细胞周期的进展有关。

Cdc20基因突变对APC^(min/+)小鼠胚胎成纤维细胞生长的影响

目的观察Cdc20AAA/+APCmin/+基因型小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)的生物学性状,探讨Cdc20基因突变对MEFs生长的影响及机制。方法制作Cdc20AAA/+APCmin/+基因型、Cdc20AAA/+基因型、APCmin/+基因型和野生型(WT)小鼠胚胎成纤维细胞,绘制生长曲线、进行平板克隆形成实验,比较各种基因型MEFs生长特性的改变。各种基因型MEFs核型分析染色体个数,并检测有丝分裂姐妹染色单体分离情况及是否存在染色体不稳定。结果 Cdc20AAA/+APCmin/+基因型MEFs生长速度快于APCmin/+基因型(P<0.01)。Cdc20AAA/+APCmin/+基因型MEFs克隆形成能力明显增强。Cdc20AAA/+APCmin/+MEFs中可见姐妹染色单体的提前分离,且染色体数目异常要多于APCmin/+MEFs,大多数为38对。结论 Cdc20AAA/+基因突变促进APCmin/+小鼠胚胎成纤维细胞生长及增殖,使其呈现肿瘤细胞的生长特性,其机制可能与染色体不稳定有关。

RNAi抑制CAR基因对人肺鳞癌细胞系NCI-H520裸鼠皮下移植瘤生长的影响

目的:建立RNAi抑制柯萨奇病毒腺病毒受体(coxsackievirus and adenovirus receptor,CAR)基因表达的肺鳞状细胞癌NCI-H520稳定表达细胞系,将CAR基因沉默的NCI-H520细胞移植于裸鼠体内构建移植瘤模型,观察裸鼠体内成瘤率及对瘤体生长等方面的影响。方法:将针对CAR mRNA序列设计的小干扰RNA重组质粒分别以脂质体转染至NCI-H520细胞,并经G418抗性筛选得到稳定细胞系;用平板克隆形成实验观察RNAi抑制CAR基因表达对NCI-H520细胞增殖的影响;通过动态观察瘤体的生长,进一步验证CAR对肺癌的增殖是否有促进作用。结果:筛选出抑制CAR基因表达效果最佳的一组shRNA,并建立了能稳定而有效抑制CAR基因表达的肺鳞癌NCI-H520细胞系。平板克隆形成实验显示,shRNA-2抑制CAR基因表达后NCI-H520细胞的增殖能力有所下降,但其差异无统计学意义(P>0.05);且在肿瘤形成实验中,实验组瘤重显著低于对照组(P<0.01)。结论:裸鼠肺癌移植瘤模型构建成功,为今后肺癌的研究奠定基础。利用RNAi有效抑制了CAR基因的表达,并抑制NCI-H520细胞在裸鼠体内瘤体的生长,CAR有望成为肺癌基因治疗的靶点之一。

半枝莲体外抗子宫内膜癌活性的研究

目的:研究半枝莲不同极性部位体外抗子宫内膜癌细胞Ishikawa的活性作用。方法:采用MTT法检测半枝莲不同极性部位对子宫内膜癌细胞Ishikawa的增殖抑制作用;采用平板克隆形成实验检测活性最强部位对Ishikawa细胞克隆形成能力的影响;应用流式细胞仪检测活性最强部位对Ishikawa细胞周期分布的影响。结果:半枝莲不同极性部位对子宫内膜癌细胞Ishikawa均有不同程度的抑制作用,其中氯仿部位的抑制作用最强(IC50=146.494μg/ml)。随着供试药物浓度的升高,细胞克隆形成能力降低;半枝莲氯仿部位对Ishikawa细胞表现为S期、G2/M期阻滞作用。结论:半枝莲氯仿部位是半枝莲抗子宫内膜癌细胞Ishikawa的最主要有效部位。

绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白的表达可促进NIH3T3细胞增殖

目的研究外源性绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白(ex JSRV Env)对NIH3T3小鼠成纤维细胞增殖的影响。方法构建含完整的外源性绵羊肺腺瘤病毒囊膜基因(ex ISRV-env)的重组质粒pc DNA4/myc-His/ex JSRV-env,并鉴定其正确性。采用脂质体转染技术pc DNA4/myc-His/ex JSRV-env瞬时转染NIH3T3细胞,利用反转录PCR和Western blot法检测Env的表达,利用CCK-8法和平板克隆形成实验检测Env表达对NIH3T3细胞增殖的影响。结果成功构建了含ex JSRV-env的重组真核表达质粒pc DNA4/myc-His/ex JSRV-env;以重组质粒瞬时转染NIH3 T3细胞,检测到JSRV Env蛋白的表达,CCK-8法和平板克隆形成实验结果表明转染pc DNA4/myc-His/ex JSRV-env的细胞增殖速度显著高于对照组(空白及阴性)细胞。结论 NIH3T3细胞表达的JSRV Env蛋白可促进NIH3 T3细胞的增殖。

REGγ敲除对细胞浸润的抑制作用

研究蛋白酶体激活因子REGγ对免疫细胞浸润能力的影响,分别腹腔注射李斯特菌于野生型和REGγ敲除小鼠,通过存活率检测、克隆形成、流式细胞术和苏木精-伊红染色实验研究,发现REGγ敲除小鼠表现为较低的存活率和李斯特菌清除能力.REGγ敲除显著抑制了中性粒细胞和单核细胞向感染部位的浸润.表明REGγ敲除后免疫细胞不能募集至感染部位,导致细菌未能被有效清除而在体内大量繁殖,最终引发败血症的发生,降低小鼠的存活率.

低温等离子体对骨肉瘤细胞MG63的作用及机制研究

目的探讨低温等离子体对人骨肉瘤细胞株MG63的杀伤作用及其可能作用机制。方法采用MTT法和克隆形成实验测定低温等离子体对人骨肉瘤细胞株MG63的增殖抑制作用,显微镜下观察低温等离子体对MG63细胞形态的影响,流式细胞术检测细胞凋亡,Western bolt检测凋亡相关蛋白的表达变化。结果显微镜观察结果显示低温等离子体可以诱导骨肉瘤MG63细胞发生皱缩,在MTT和克隆形成实验中都显示出低温等离子体对骨肉瘤细胞MG63具有明显的增殖抑制效果并且呈剂量依赖性,流式细胞分析显示低温等离子体是通过诱导细胞凋亡而引起细胞增殖抑制。Western blot法显示低温等离子体可以诱导凋亡蛋白的表达,并且呈剂量依赖性。结论低温等离子体对MG63细胞株具有显著的杀伤作用,可能与诱导细胞凋亡有关。

柯萨奇病毒腺病毒受体在肺癌中的表达和意义

目的:明确柯萨奇病毒腺病毒受体(CAR)在正常肺组织、癌旁组织及肺癌组织中的表达情况以及在体外CAR失表达对人肺鳞状细胞癌NCI-H520细胞增殖与侵袭迁移的影响。方法:收集肺癌手术切除新鲜标本100例及其对应的癌旁组织和正常肺组织,应用免疫组织化学、Western blot和RT-PCR法检测CAR蛋白和mRNA的表达情况;在体外运用RNAi技术建立稳定的低表达CAR的人肺鳞状细胞癌NCI-H520细胞系,用平板克隆形成实验和Transwell侵袭及迁移实验观察RNAi抑制CAR基因表达对NCI-H520肺癌细胞增殖与侵袭迁移的影响,并通过建立动物模型动态观察瘤体的生长。结果:免疫组织化学结果显示,CAR阳性率为48%。Western blot法检测CAR蛋白和RT-PCR检测CAR mRNA在肺癌组织中明显高于正常肺组织和癌旁组织。筛选得到三组CAR基因表达受到抑制的NCI-H520稳定细胞系。半定量RT-PCR和Western blot结果显示,三组稳定细胞系中CAR mRNA和蛋白质表达均有不同程度的下降,其中shRNA-2抑制作用最强。平板克隆形成实验显示,shRNA-2抑制CAR基因表达后,NCI-H520细胞的增殖能力有所下降(P>0.05),Transwell侵袭及迁移实验显示,NCI-H520细胞侵袭迁移能力明显下降(P<0.05)。动物模型结果显示,抑制CAR的表达,则动物体内移植瘤的生长就会缓慢。结论:CAR与肺癌形成和进展有关,并能够促进肺癌细胞的侵袭和迁移活动。裸鼠肺癌移植瘤模型构建成功,为以后肺癌的研究奠定基础。利用RNAi有效抑制了CAR基因的表达,并抑制NCI-H520细胞在裸鼠体内瘤体的生长,CAR有望成为肺癌基因治疗的靶点之一。

含缬酪肽蛋白在上皮性卵巢癌组织中的表达及其临床意义

目的:观察上皮性卵巢癌(EOC)组织中含缬酪肽蛋白(VCP)的表达情况及其与EOC患者临床病理特征的关系,为EOC的分子治疗提供依据。方法:采用免疫组织化学法检测94例EOC组织标本、13例卵巢交界性肿瘤组织标本、36例卵巢良性肿瘤组织标本和8例正常卵巢组织标本中VCP的表达情况。分析VCP阳性表达率与EOC患者各临床病理参数(年龄、FIGO分期、病理类型、组织学分级、是否有淋巴结转移、是否有腹水和术前CA125水平)的关系。采用免疫荧光技术和Western blotting法检测人卵巢上皮HOSEpiC细胞和人EOC SKOV-3细胞中VCP表达;将SKOV-3细胞分为对照组(未经CB-5083处理)和处理组(经CB-5083处理),划痕实验分析2组SKOV-3细胞迁移率,平板克隆形成实验分析2组SKOV-3细胞克隆形成率,免疫荧光法分析2组SKOV-3细胞中VCP表达情况,Western blotting法检测2组SKOV-3细胞中VCP、NF-κB/P65、IκBα和p-IκBα蛋白表达水平。结果:EOC、交界性卵巢肿瘤、良性卵巢肿瘤和正常卵巢组织中VCP阳性表达率组间比较差异有统计学意义(P<0.05);VCP表达与患者FIGO分期、组织学分级和是否有淋巴结转移有关联(P<0.05),而与患者年龄、病理类型、是否有腹水及术前CA125水平无关联(P>0.05)。SKOV-3细胞中VCP表达水平高于HOSEpiC细胞(P<0.05),处理组SKOV-3细胞迁移率低于对照组(P<0.05),处理组克隆形成率低于对照组(P<0.05),处理组SKOV-3细胞中VCP和NF-κB/P65蛋白表达水平低于对照组(P<0.05),p-IκBα蛋白表达水平高于对照组(P<0.05)。结论:VCP在EOC组织和细胞中呈高表达,VCP高表达可促进肿瘤的迁移和增殖。

阻断BMK1通路可通过调控BNIP3和BNIP3L抑制肿瘤干细胞

肿瘤干细胞（CSCs）具有干细胞相关的许多特性,并被认为可操控肿瘤的发生。尽管靶向CSCs具有开发新药物的巨大潜力,但由于目前缺乏有效的药物靶点和合适的药理学制剂,其发展仍有很大障碍。Song等的研究结果表明,BMK1的磷酸化不仅与胚胎干细胞和诱导性多能干细胞有关,也与CSCs有关。通过表达MEK5D激活BMK1,可增强CSCs的自我更新（微球体形成实验证实之）、增殖（克隆形成实验证实之）和成瘤能力,而BMK1抑制剂XMD8-92能抑制上述过程。