本科生基因工程实验课程基因克隆构建方案

将常用于Gateway克隆系统中的对大肠杆菌具有毒性ccdB基因引入载体,提高基因克隆成功率。构建基因克隆过程中,含有ccdB基因的原始载体在大肠杆菌中不能正常生长,无法形成细胞克隆,避免空载的假阳性克隆产生。通过分组比较实验、启发引导的教学设计,可以让学生充分领会酶切、重组、连接等生物工程相关操作,加深学生对理论课程的理解。该基因克隆方法的改进能够满足实验教学的需要,也适用于科研工作中的基因克隆效率的提高。

细胞角蛋白19基因的克隆构建与重组表达

目的:构建肿瘤标志物细胞角蛋白19(CK19)基因的原核表达载体,并在大肠埃希菌中进行表达,以获取低成本、高产量、高纯度的CK19蛋白。方法:根据基因库CK19的基因序列,设计多条用于基因拼接的DNA引物,利用PCR技术扩增CK19基因,用基因重组技术将该片段克隆到质粒p ET28a中,PCR和DNA测序鉴定。将重组质粒CK19-p ET28a转化大肠埃希菌BL21中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,使用镍柱亲和层析纯化蛋白,并用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹鉴定。结果:成功扩增出CK19基因片段,克隆到表达载体后经菌落PCR和DNA测序鉴定正确。重组质粒CK19-p ET28a在大肠埃希菌中经诱导和纯化后获得纯度较高目的条带,蛋白质印迹结果证明目的蛋白有反应性。结论:成功构建了肿瘤标志物CK19原核表达载体,经过诱导表达和蛋白纯化获得了高纯度有活性的目的蛋白。

猪瘟病毒C株全长cDNA感染性克隆的构建及病毒拯救

【目的】建立猪瘟病毒研究技术平台,为进一步研究猪瘟病毒C株在细胞中的增殖机制及猪瘟病毒标记疫苗奠定基础。【方法】本试验以猪瘟病毒C株为研究材料,经RT-PCR扩增获得涵盖全长的6个片段,用合适的酶切位点连接,成功构建了C株全长感染性克隆pAC-CS。体外转录得到RNA,然后将其分别转染BHK-21和SK6细胞。拯救的病毒通过上清传代(常规病毒传代)和带毒细胞传毒繁殖。【结果】通过RT-PCR、免疫过氧化酶单层细胞试验和兔体发热试验检测,表明病毒拯救成功。经比较以电转的方式转染SK6的效果较好。通过带毒细胞传代,至12代时病毒滴度稳定达104TCID50.mL-1,而上清传代至第3代时用免疫过氧化酶单层细胞试验(IPMA)不能检测出病毒。【结论】成功构建了猪瘟病毒C株感染性克隆;拯救C株时以SK6细胞电转较好;带毒细胞传代培养C株有利于获得较高滴度的病毒。

正链RNA病毒感染性克隆的构建策略及影响因素

利用全长cDNA构建感染性克隆是拯救RNA病毒的基础和关键,也是反向遗传技术的核心。文章综述了构建正链RNA病毒感染性克隆的基本思路和关键技术,总结了影响克隆感染性的因素,并对感染性克隆技术的应用做一简述。

西尼罗I型病毒亚克隆的构建及其鉴定

目的构建西尼罗病毒基因组的cDNA亚克隆,为西尼罗病毒全长cDNA克隆的研发和应用打下基础。方法根据基因组中限制性酶切位点的分布设计4对引物,QIAamp RNA抽提试剂盒提取西尼罗病毒培养细胞BHK-21的总RNA,长片段RT-PCR技术扩增目的基因片段。将目的基因片段与pMD18-T载体进行连接,转化入感受态细胞E.coli DH5α,进行蓝白斑筛选后得到阳性克隆,将重组质粒进行PCR和测序鉴定。结果获得的目的基因片段经PCR和测序结果表明西尼罗病毒功能基因正确地克隆进入载体。结论成功获得西尼罗I型病毒功能基因的cDNA亚克隆,可应用于西尼罗病毒全长cDNA克隆的制备。

FR 02全长基因的克隆表达载体的构建及转化苹果

从铁胁迫诱导的拟南芥植株根中克隆了全长的FR 02(Fe3+-螯合物还原酶)基因,并将FR 02基因构建到了植物高效表达载体pCB 302中。通过农杆菌介导的转化和PCR及Southern b lot检测证明FR 02基因正向的插入了苹果基因组中。以破坏生长点的茎尖为外植体的苹果基因转化方法转化率高达10.8%。FR 02全长基因的成功克隆、构建和转化为高铁、抗黄化苹果和其他高铁作物新品种的培育开辟了一条新路。

高温超氧化物歧化酶基因的克隆及真核重组转移载体pVL-sod的构建

从高温塘泥中分离得到一株耐高温菌株,推定其属于Geobacillus属,根据该属已知的超氧化物歧化酶基因(sod)序列,用PCR的方法扩增得到该菌的sod基因。序列分析表明,该基因全长1236bp,编码411个氨基酸。本试验构建了用于家蚕杆状病毒表达的重组转移载体pVL-sod,为下一步在家蚕杆状病毒中高效表达超氧化物歧化酶奠定了基础。

构建逆转录病毒pQCXIH-HA-FBXL11表达质粒及稳定转染细胞

目的:构建pQCXIH-HA-FBXL11逆转录病毒表达质粒,鉴定表达,在牙髓间充质干细胞建立过表达FBXL11的稳定转染细胞。方法:以牙髓干细胞的cDNA为模板,利用PCR方法扩增目的基因FBXL11,PCR产物纯化回收、连接、酶切、测序鉴定,构建pQCXIH-HA-FBXL11质粒。利用FuGENE6转染293T细胞,蛋白质免疫印迹法和实时荧光定量PCR法在蛋白及mRNA水平检测HA-FBXL11的表达。利用逆转录病毒感染牙髓间充质干细胞。结果:成功构建了逆转录病毒表达质粒pQCXIH-HA-FBXL11,蛋白及mRNA水平检测证实其在293T细胞可以有效的表达。成功建立了过表达HA-FBXL11的牙髓间充质干细胞稳定转染细胞。结论:通过构建pQCXIH-HA-FBXL11表达质粒及在牙髓间充质干细胞建立过表达FBXL11稳定转染细胞,为进一步研究FBXL11对间充质干细胞的功能调控奠定了基础。

真核重组质粒pCDNA3.1-Flag-PTEN 和原核重组质粒pGEX-6P-1-GST-PTEN构建

目的:构建人第10号染色体缺失的磷酸酶(PTEN)真核重组质粒pCDNA3.1-Flag-PTEN和原核重组质粒pGEX-6P-1-GST-PTEN,研究PTEN融合质粒生物学效应。方法:根据基因库中PTEN序列,设计并合成相关引物。用基因重组技术将目的片段插入pCDNA3.1-Flag和pGEX-6P-1-GST空载质粒中,通过PCR和DNA测序,鉴定插入基因序列。将pCDNA3.1-Flag-PTEN转染到HEK 293细胞,将pGEX-6P-1-GST-PTEN转到E.coli BL-21中,通过Western blotting和考马斯亮蓝染色法分别检测PTEN蛋白的表达。结果:PCR显示目的基因插入成功;DNA测序显示插入序列与目的基因序列完全一致,无位点突变;Western blotting和考马斯亮蓝染色法证实融合质粒可以在生物体内正确表达。结论:成功构建PTEN相关真核和原核融合质粒并正确表达,为PTEN在帕金森疾病中的机制研究奠定了基础。

构建逆转录病毒PBabepuro-Bcl-2表达质粒及稳定转染细胞株

目的:构建pBabepuro-Bcl-2逆转录病毒表达质粒,鉴定表达,在小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3中建立过表达Bcl-2稳定转染细胞。方法:以人上皮细胞的cDNA为模板,利用X-tremeGENE HP(Roche)转染293T细胞,蛋白质免疫印迹法在蛋白水平检测表达,利用逆转录病毒感染NIH3T3细胞。结果:成功构建了逆转录病毒表达质粒pBabepuro-BCl-2,蛋白水平检测证实其在293T细胞可以有效地表达,成功建立了过表达Bcl-2的NIH3T3稳定转染细胞。结论:通过构建pBabepuro表达质粒及在NIH3T3建立过表达Bcl-2稳定转染细胞,为进一步研究Bcl-2的功能调控奠定了基础。

大肠杆菌LTKA63突变体的构建及重组LTKA63免疫佐剂活性机理的研究

目的 构建大肠杆菌不耐热肠毒素A亚单位（heat-labile enterotoxin subunitA，LTA）基因减毒突变体LTKA63及其原核表达系统，探讨重组LTKA63（rLTKA63）粘膜免疫佐剂活性的机制。方法采用高保真PCR从大肠杆菌44815株基因组DNA中扩增LTA基因，利用定位突变技术构建LTKA63突变体，T-A克隆后测序。采用无His-tag的原核表达载体pET-15b。构建LTKA63原核表达系统，通过SDS-PAGE鉴定表达产物。采用三色流式细胞术确定rLTKA63激活T细胞途径。结果从大肠杆菌44815株DNA模板中扩增获得预期大小的LTA基因条带。与报道的LTA序列比较，所克隆的LTA基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99．03％～99．61％和98．33％～99．22％。LTA基因定位突变后获得序列正确的LT-KA63突变体。rLTKA63表达量占细菌总蛋白的15％左右。rLTKA63作用后Th1和Th2细胞较阴性对照组分别增加21．9％和36．2％。结论本文成功地构建了LTKA63原核表达系统，所表达的rLTKA能同时激活Th1和Th2细胞。

PENK基因过表达克隆载体构建及其功能意义

目的构建人前脑啡肽(homo sapiens proenkephalin,PENK)基因过表达克隆载体,研究其功能意义。方法用HIV载体质粒与PENK基因连接,构建成功后用双酶切及测序验证PENK克隆重组体的成功构建。用293Ta包装慢病毒后转染HT1080以测定慢病毒滴度。用PENK-HIV慢病毒颗粒转染PC12细胞,同步设立对照组(未转染PENK),对两组细胞转染后48h采集图片并经行细胞计数,收集细胞,用RT-PCR检测各组中PENK mRNA表达变化。结果 PENK克隆载体酶切及测序结果都验证了克隆构建成功。PENK-HIV慢病毒成功转染PC12细胞48h后,对照组细胞数为88.60±2.55,而PENK转染组细胞数为127.93±2.48,差异有统计学意义(P<0.01)。结论用HIV载体质粒成功构建的PENK克隆重组体可能会促进PC12细胞的生长。

反向遗传学技术在麻疹病毒属病毒中的研究进展

RNA病毒的反向遗传学是采用病毒的遗传材料(感染性克隆),在培养细胞或易感宿主中重新拯救出活病毒或类似病毒物质的过程.该技术在麻疹病毒属病毒中研究应用较多,尤以牛瘟病毒的研究开创了消灭麻疹病毒属病毒的先例,小反刍兽疫病毒和犬瘟热病毒的研究与应用还在进一步完善中.本文综述了反向遗传学技术在麻疹病毒属病毒基因结构与功能、致病机制、感染性克隆构建及新型疫苗研制等方面的研究进展.

大豆主要过敏原β-伴大豆球蛋白α亚基的分段及克隆载体的构建

利用生物信息学软件将大豆主要过敏原β-伴大豆球蛋白α亚基分为相互重叠的4个片段(A、B、C、D),设计和合成系列引物。利用PCR技术分别扩增β-伴大豆球蛋白α亚基Overlapping分段基因,将其插入到p MD-18T vector中,对重组质粒进行PCR和双酶切鉴定,测序结果与设计基因序列一致,成功构建了克隆载体。为研究β-伴大豆球蛋白α亚基的分段表达及抗原表位的筛选提供参考。

靶向性血小板衍生生长因子siRNA表达质粒的构建及鉴定

目的 构建靶向性血小板衍生生长因子(PDGF)B链的小分子干扰RNA(siRNA)表达质粒,为进一步研究PDGF基因功能奠定基础.方法 根据PDGF-B链序列设计合成含靶向PDGF基因siRNA转录模板的茎环结构,与两端分别有Bam HI、HindIII酶切位点的pSilencer3.1-Hlhygro质粒连接,转化大肠杆菌,扩增、纯化得到所需质粒,通过琼脂糖凝胶电泳及基因测序鉴定其分子量及插入片段的序列.结果 PCR扩增片段与预期结果相符,双酶切证实PDGF siRNA表达载体克隆构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致.结论 成功构建了靶向性PDGF基因的siRNAs表达质粒.

大肠杆菌重组LTKA63突变体和LTB黏膜免疫佐剂活性的研究

目的构建大肠杆菌不耐热肠毒素A亚单位(heat-labile enterotoxin subunit A,LTA)突变体 LTKA63及B亚单位(heat-labile entemtoxin subunit B,LTB)基因原核表达系统,确定rLTKA63和rLTB黏膜免疫佐剂活性。方法采用高保真PCR从大肠杆菌44815株基因组DNA中扩增LTA和LTB基因,采用定位突变技术构建LTKA63突变体,T-A克隆后测序。构建LTKA63和LTB原核表达载体,采用SDS-PAGE鉴定表达产物。采用三色流式细胞术确定rLTKA63激活T细胞途径,以GM1-ELISA检测rLTB结合牛GM1的能力。建立幽门螺杆菌SS1株小鼠感染模型,分别以幽门螺杆菌(Hp)重组尿素酶B亚单位(rUreB)和黏附素(rHpaA)为抗原,分别检测rLTKA63和rLTB对rUreB和rHpaA的免疫保护增强作用。结果从大肠杆菌44815株DNA模板中扩增获得预期大小的LTA和LTB基因条带。LTA基因定位突变后获得序列正确的LTKA63突变体。rLTKA63和rLTB表达量分别占细菌总蛋白的30％和20％左右。LTKA63作用后T_H1 和T_H2细胞较阴性对照组分别增加19．9％和42．3％,GM1-ELISA结果证实rLTB能与牛GM1结合。 33．3％(4／12)rUreB和41．7％(5／12)rHpaA免疫小鼠胃黏膜标本中分离出幽门螺杆菌,且rUreB和rHpaA特异性S-IgA检测结果均为阴性。rUreB或rHpaA加用rLTKA63或rLTB免疫后,小鼠胃黏膜标本中幽门螺杆菌分离阳性率下降为16．7％～25．0％(P>0．05),rUreB和rHpaA特异性S-Iga阳性率可达41．6％- 58．3％(P<0．01)。结论成功地构建了LTKA63和LTB原核表达系统,所表达的rLTKA63和rLTB均具有较强的黏膜免疫佐剂活性。