牛α-s1酪蛋白基因5’端及上游区的克隆鉴定和部分序列分析

本文以PCR法克隆得到牛α-sl酪蛋白基因5'端800bp片段,并以该片段为探针,筛选了以EMBL3为载体构建的牛基因组文库,得到一个阳性克隆。酶切该克隆,并以牛α-s1酪蛋白基因5'端800bp片段及该基因cDNA为探针杂交,鉴定了该插入片段的方向,亚克隆了各相应酶切片段,制作了较为详细的限制酶图谱,并分析了该基因转录起始点前后部分序列。与该基因现有的资料比较,酶切图谱存在部分位点的差异,序列存在少量突变和缺失,在5'上游区均发现有内含子及外显子部分,且缺失均发生于有重复序列的部位。

肝癌相关抗原HAb18G反义RNA表达质粒的构建及克隆鉴定

目的 构建 HAb1 8G反义 RNA表达质粒载体 .方法 用 DNA重组技术将人 HAb1 8G基因反向克隆到真核表达质粒 PCI- neo中 ,构建成 HAb1 8G反义 RNA表达质粒PCI- as HAb1 8G.用阳离子脂质体介导转染人肝癌细胞系HHCC,经 G41 8筛选后获得的克隆进行鉴定 .结果 HAb1 8G反义 RNA表达质粒载体 PCI- as HAb1 8G经限制性酶切及部分序列分析证明基因插入正确 .流式细胞仪及免疫组化 SP法染色均证实 :转染细胞 HHCC/as HAb1 8G中HAb1 8G表达为阴性 ,而转染空载体的 HHCC/neu及 HHCC均为强阳性 .结论 成功构建了 HAb1 8G反义 RNA表达质粒载体 PCI- as HAb1 8G.为进一步研究 HAb1

胸膜肺炎放线杆菌荚膜多糖输出基因部分序列的克隆鉴定、序列拼接和分析应用

用设计的引物对胸膜肺炎放线杆菌1、3、6、9型标准株的荚膜多糖输出部分基因序列进行了扩增，克隆，测序，分别获得4个型的部分cpxDC基因序列和3型的部分cpxD基因序列。对克隆序列和GenBank中已知序列进行序列拼接，分别拼接出1、3、6型的荚膜输出cpxD基因全序列。通过基因序列分析发现，胸膜肺炎放线杆菌1、3、5、6、9型荚膜多糖输出基因已知序列间的同源性很高，达89％～99．88％。1、3、5、6型cpxD基因的推导氨基酸序列间的同源性为93％～99％。在cpxDC基因的保守区内设计出1对种特异性引物，对胸膜肺炎放线杆菌进行鉴定和检测，结果从8个标准型菌株和3株分离株中均扩出约720bp的阳性片段，其他6种能引起猪呼吸道疾病的细菌均呈阴性。所建立的PCR方法最低检出量为10Pg，最适模板量为5ng（50ptL）。试验结果表明，胸膜肺炎放线杆菌不同血清型间的荚膜多糖输出基因存在着高度的保守性。设计出的种特异性引物能用于胸膜肺炎放线杆菌的检测和鉴定。

人多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2基因反义RNA表达质粒的构建及克隆鉴定

目的:研究反义封闭ppGalNAc-T2基因表达对胃癌细胞GC7901细胞增殖以及肿瘤细胞生物学行为的影响,构建反义表达载体并转染胃癌细胞GC7901。方法:在对几种肿瘤细胞的ppGalNAc-T2基因的表达水平分析后,以高表达ppGalNAc-T2的人胃癌细胞GC7901的总RNA为模板,利用RTPCR方法扩增两段不同长度ppGalNAc-T2基因片段,构建反义表达载体并转染胃癌细胞GC7901,通过G418筛选,建立一系列旨在封闭胃癌细胞GC7901细胞ppGalNAc-T2基因表达的亚细胞克隆。通过荧光显微镜、RT-PCR技术手段检测封闭反义ppGalNAc-T2基因RNA表达。结果:ppGalNAc-T2反义表达质粒载体pEGFP-FDT2和pEGFPFX-T2经限制性酶切及部分序列分析证明基因已正确插入载体中,荧光显微镜及RTPCR显示转染成功。结论:成功构建了ppGalNAc-T2反义表达质粒载体,反义封闭ppGalNAc-T2基因表达后,胃癌细胞GC7901ppGalNAc-T2的含量明显降低,为进一步研究ppGalNAc-T2奠定了基础。

磷脂酰丝氨酸受体TIM4的克隆鉴定

磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）是表达在凋亡细胞表面的一种重要标志分子。它是第一个被鉴定出的细胞发生凋亡时表达发生变化的配体。目前很多研究表明，PS可以通过与一些特定分子相结合从而介导吞噬细胞对凋亡细胞的识别和摄取，其中大部分PS结合分子都为一些“桥联分子”。

克隆植物蛇莓基株的分子鉴定

采用随机扩增序列区间(ISSR)分子标记技术对蛇莓基株进行鉴定,结果表明6个ISSR引物在22个分株中共扩增出62个条带,每个引物扩增的条带数为4～16条,平均每个引物扩增的条带数为10.3条。采用6种引物对22个克隆分株的DNA扩增共产生28种带谱类型,其中有9种带谱为特异性带谱。综合分析这些带谱,确知这22个克隆分株分属16个基株。由带型可知,通过6个引物中的4种引物就可以把所有的基株鉴定出来,表明ISSR技术在分子水平上鉴定蛇莓的克隆基株是一种行之有效的方法。同时每个引物扩增出来的条带的多态性比例也比较高,平均达到90.3%。

库尔勒香梨9个新miRNA克隆鉴定

利用在小RNA高通量测序试验中筛选出的脱萼组与宿萼组差异表达新miRNA基因,采用Stem-loop法对总体表达量居前20位、在脱萼组和宿萼组中具有显著性差异表达、在子房和萼片组织中具有显著性差异表达的新miRNA进行成熟体的克隆鉴定、前体序列二级结构分析、qRT-PCR试验以及靶基因预测。结果显示,在不同的样本中有9个新miRNA(novel_miRNA)的成熟体序列以及4个novel_miRNA的表达量与高通量测序结果完全一致,并且预测得到大量具有生物学功能的靶基因。新发现的miRNA可能与‘库尔勒香梨’萼片脱落和宿存有密切关系。

小鼠天然可溶性VEGF受体基因sflt-1的克隆及鉴定

可溶性血管内皮细胞生长因子受体 (sFlt 1 )与膜表面受体Flt 1竞争结合血管内皮细胞生长因子 (VEGF) ,并且与膜表面受体Flt 1及KDR形成异源二聚体 .完全阻断VEGF的生物学活性 ,除与sFlt 1的结合部位结构域有关外 ,还与整个蛋白质分子的高效分泌表达有关 .而蛋白质分子的高效分泌表达与蛋白质在细胞内高尔基体及内质网的加工密切相关 ,基因工程重组可溶性受体由于一些尚未明了的原因 ,往往不能高效表达 ,从而大大影响了其应用价值 .利用RT PCR技术从胚胎小鼠中扩增出天然可溶性VEGF受体基因sflt 1 ,克隆于pcDNA3载体中 ,在COS 7细胞中短暂表达 ;并克隆至pET42b载体中 ,经IPTG诱导后 ,可大量稳定表达与His Tag形成的融合蛋白 ,经HisNi柱纯化 ,可特异性结合VEGF .可溶性受体sFlt 1在肿瘤组织的高效表达可有效阻断新生血管的形成 ,从而为肿瘤的治疗探索一种方法 .

生物学标志在产肠毒素性大肠埃希菌同源克隆鉴定中的应用

目的研究多方法、多生物学标志在产肠毒素性大肠埃希菌同源克隆鉴定中的作用。方法在毒力基因检测和分型基础上，首次采用质粒分析法结合多位点酶电泳法，对ＥＴＥＣ同源克隆进行了综合研究。结果７个毒力基因型的２０６株散发ＥＴＥＣ菌株经质粒图谱分型后，共可分成９３个质粒型，有１４０株ＥＴＥＣ具有独特的基因型；进一步用多位点酶电泳分型，２０６株ＥＴＥＣ可被分成１４８个ＥＴ型，３种方法综合，共有１９０株ＥＴＥＣ具有独特的基因型。结论多方法、多生物学标志在同源克隆鉴定中能提供更多、更可靠的信息。

白木香查尔酮异构酶基因的克隆鉴定与表达分析

查尔酮异构酶(chalcone isomerase,CHI)是黄酮类成分生物合成途径中的关键酶之一,在植物防御反应中发挥重要作用。本研究根据白木香转录组测序结果并结合RT-PCR技术首次从白木香愈伤组织中克隆得到1个CHI基因,命名为AsCHI1。白木香AsCHI1基因的开放阅读框(ORF)长654 bp,编码蛋白含217个氨基酸,其蛋白分子质量为23.11 kDa。AsCHI1蛋白具有查尔酮异构酶保守的活性位点,系统进化树显示AsCHI1蛋白为I型CHI蛋白,与棉花(Gossypium hirsutum)CHI蛋白亲缘关系较近。构建原核表达载体pET28a-AsCHI1并在E.coli BL21(DE3)菌株中成功表达AsCHI1,利用Ni2+亲和色谱纯化得到可溶性AsCHI1重组蛋白。体外酶活性分析证明重组蛋白AsCHI1可以催化柚皮素查尔酮转化为柚皮素。实时荧光定量PCR检测结果表明白木香愈伤组织经盐、甘露醇、低温以及重金属胁迫诱导后,AsCHI1基因的表达量明显上升;植物激素脱落酸、赤霉素和水杨酸均能够诱导愈伤组织中AsCHI1基因表达,说明AsCHI1在白木香自我防御反应中发挥作用。本研究结果为进一步探讨白木香中黄酮类成分的生物合成及其在白木香防御反应中的作用提供参考。

中华山蓼克隆的分子鉴定

采用ISSR分子标记对21个中华山蓼克隆进行了鉴定,结果表明:从100个ISSR引物中筛选出8个引物,对21个中华山蓼克隆进行DNA扩增,共扩增出84个清晰条带,其中44条具多态性,平均多态比率为52.4%。共扩增出73种条带类型,其中特异性条带类型为40种。综合分析这些条带类型,可知只要通过8个引物中的3个即可将所有的克隆鉴定出来,表明ISSR技术在分子水平上鉴定中华山蓼的克隆是一种行之有效的方法。

中国人基因组YAC文库的构建及首批克隆鉴定

本文采用PJS97/PJS98及TPH 274载体主宿系统构建中国汉族男性基因组YAC文库,在初探基础上不断改进方法,通过控制脉冲条件的原位筛选去除小片段DNA分子,用多胺溶液防止68℃对大片段DNA分子的破坏作用,并采用Agarase消解低熔点胶。转化获克隆10000余个,采用甘油一步到位法保存8000余个。对其中一批克隆进行鉴定。转化子阳性率为95％,其中75％的片段介于100～200kb间,10％为200～600kb,10％为600～1600kb,该批转化子平均片段230kb。克隆片段平均大小略高于回收到的目的片段的下限而低于它的平均大小。

新城疫病毒单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化的新城疫病毒ND35免疫Balb/C小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合.经筛选,获得5株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株.特异性试验表明,7G5单克隆抗体仅与ND35病毒株反应,而不与禽流感病毒AIV(H5亚型)、产蛋下降综合症病毒(EDS-76V)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、马立克氏病毒(MDV)、禽肺病毒(APV)反应.通过Western-blot对7G5单克隆抗体进行鉴定,发现其在相对分子质量47 500～62 000之间出现条带,表明其与NDV抗原有特异性结合.这5株单克隆抗体属于IgG1、IgG2b亚类,κ轻链.

花生多胺氧化酶基因的克隆与鉴定(英文)

多胺作为一类新型植物生理活性物质,对植物生长发育起着重要作用,在细胞工程与农业生产中具有广阔的应用价值。多胺氧化酶(Polyamine oxidase,PAO)是催化多胺降解的关键酶之一,对调控植物细胞中多胺浓度非常重要,影响植物的生长发育、形态建成过程。根据国际DNA数据库中已报道的PAO蛋白的保守结构域,设计简并引物(degenerate pri mer),通过RT-PCR方法首次从花生(仲恺花1号)中克隆PAO基因cDNA序列,并利用BLASTn、BLASTp及多重序列排比(Multiple Sequence Alignment)等生物信息学方法对所克隆的cDNA进行序列分析与鉴定,初步确定已从花生中克隆到PAO基因的同系物(homolog)。根据克隆的花生PAOcDNA序列(AhPAO1)设计特异引物,通过半定量RT-PCR方法检测花生胚根、胚芽和幼叶中AhPAO1基因的表达,结果发现胚根中AhPAO1基因表达最强,胚芽和幼叶中的表达无明显差异。本研究为进一步了解花生种子萌发和幼苗生长发育过程中多胺氧化酶基因表达的时空特异性奠定实验基础,并对进一步利用植物基因工程技术综合调控花生体内多胺水平有重要实践意义。

大鼠白细胞介素-10基因全长cDNA的克隆和鉴定

背景:肝纤维化病程迁延且药物治疗效果不理想,基因治疗将成为这一领域研究的热点。研究显示白细胞介素(IL)鄄10对肝脏具有保护作用,可阻止肝纤维化的发生、发展。目的:克隆并鉴定Sprague鄄Dawley(SD)大鼠IL鄄10基因的全长cDNA,为进一步构建大鼠IL鄄10腺病毒重组子和肝纤维化基因治疗的研究奠定基础。方法:自行设计IL鄄10上下游引物,以逆转录聚合酶链反应(RT鄄PCR)从SD大鼠脾脏单核细胞中扩增编码大鼠成熟IL鄄10肽链的cDNA片断。扩增产物与连接载体pMD鄄18T连接后转化感受态菌DH5α,构建重组载体pMD鄄18T鄄IL鄄10。结果:以SD大鼠脾脏单核细胞总RNA为模板,RT鄄PCR扩增出大小为540bp的大鼠IL鄄10cDNA片断。所构建的重组质粒经HindⅢ+KpnⅠ双酶切显示含有目的基因片段,测序结果证实扩增出的DNA片断与大鼠IL鄄10基因序列相符,表明编码区无基因突变。结论:成功地克隆了大鼠IL鄄10基因的全长cDNA,并构建了重组载体pMD鄄18T鄄IL鄄10。

TNF-α致脂肪细胞胰岛素抵抗相关基因的克隆和鉴定

目的分离和克隆肿瘤坏死因子α(TNF α)致 3T3 L1脂肪细胞胰岛素抵抗 (IR)的相关基因。方法分化成熟的 3T3 L1脂肪细胞用TNF α处理 4 8h后抽提总RNA ,采用mRNA差异显示技术分离和克隆TNF α引起脂肪细胞IR的基因 ,再通过半定量RT PCR证实。结果经mRNA差异显示技术分离和克隆到 10个已知基因的cDNA ,3个已知表达序列标签 (ESTs)片段和1个新的EST片段。半定量RT PCR证实TNF α上调 3T3 L1脂肪细胞Synip基因和血浆淀粉样蛋白A3(SAA3)基因的表达。结论Synip基因和SAA3基因的表达升高可能与TNF α致 3T3 L1脂肪细胞IR和相关的心血管并发症有关。

抗GSTAl单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备鼠抗人谷胱甘肽S转移酶A1(GSTAI)的单克隆抗体(mAb),并进行特性鉴定。方法:用纯化后的GSTAl融合蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,采用常规的细胞融合技术制备抗GSTAl的单克隆抗体(mAb)。用ELISA法测定鼠抗人GSTA1血清的效价;用Western blot方法鉴定抗血清的特异性。结果:筛选到l株可稳定分泌抗人GSTAlmAb的细胞株。腹水效价为12 800。Western blot显示在相对分子量(Mr)约25KD处出现特异性条带。说明制备的mAb可特异地识别成人肝细胞中相对分子量(Mr)约25KD的GST-GSTA1。结论:获得一株能特异性识别抗人GSTAI的单克隆抗体,可用于肝损伤性疾病的诊断。

鲤RNF2基因的克隆、组织表达与生物信息学分析

以鲤肾脏组织RNA为模板,扩增并克隆鲤环指蛋白2(RING Finger Protein 2,RNF2)基因的CDS区全长,分析其组织表达谱。结果显示,鲤RNF2基因的CDS区序列长1011 bp,编码336个氨基酸;该基因与鲫、斑马鱼、金头鲷、海洋青鳉鱼、鳕鱼、非洲爪蟾、尖尾娇鹟、小鼠、智人的同源性分别为98.2%、93.1%、78.0%、79.2%、79.2%、73.9%、78.1%、72.7%、72.7%;理化性质分析表明,RNF2蛋白分子质量为37.44 kD,理论等电点(pI)为6.28,脂肪系数为74.97%,不稳定指数为36.75,无跨膜结构和信号肽;亚细胞定位预测分析表明,该蛋白定位于细胞核(52.2%)、线粒体(26.1%)、细胞质(17.4%)和过氧化物酶体(4.3%)。蛋白质结构域分析表明该蛋白含RING结构域和RAWUL结构域,且RING结构域与斑马鱼、小鼠和智人完全一致;二级结构和三级结构表明,鲤鱼RNF2蛋白含有α-螺旋(35.12%)、延伸链(8.63%)、β-转角(0.89%)和无规则卷曲(55.36%);泛素化底物预测显示,TP53、IRF4、HIST2H2AC、H3F3B和HIST3H3作为RNF2蛋白的底物具有较高的置信度;实时荧光定量PCR结果显示,鲤RNF2基因在肌肉中表达量最高,其次是头肾和肝脏,在肾脏中表达量最低。这些结果为进一步研究RNF2在鲤鱼抗病毒应答中的作用提供了基础信息。

新城疫病毒F_(48)E_(9)株HN基因的克隆与酶切分析

为深入探讨新城疫病毒（ＮＤＶ）的结构与功能的关系，扩增和克隆了Ｆ４８Ｅ９株ＮＤＶ的ＨＮ基因。首先以提取的Ｆ４８Ｅ９株ＮＤＶ基因组ＲＮＡ为模板逆转录合成第一链ｃＤＮＡ，然后用ＨＮ基因特异性引物作ＰＣＲ扩增ＨＮｃＤＮＡ，结果得到１条分子量约１．８ｋｂ的ＤＮＡ带，与ＮＤＶＨＮ基因的大小一致。Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交进一步证实其为ＨＮ特异性ｃＤＮＡ。随后采用平端连接法将其克隆到ｐＳＶ·Ｓｐｏｒｔｌ质粒中，应用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ、ＳｃａⅠ、ＭｌｕⅠ、ＡｐａⅠ、ＰｓｔⅠ、和ＳｍａⅠ对ＮＤＶＦ４８Ｅ９株ＨＮｃＤＮＡ重组质粒作单酶或双酶切，结果表明，ＮＤＶＦ４８Ｅ９株ＨＮ基因较ＨｉｔｃｈｎｅｒＢ１株的ＨＮ基因缺少１个ＭｌｕⅠ位点（７０５ｂｐ左右），多１个ＰｓｔⅠ位点（８０２ｂｐ左右）。

华癸中生根瘤菌共生基因exo56的克隆和功能初步分析

利用Tn5-sacB转座子随机插入突变的方法,从Mesorhizobium huakuii7653R的400个突变株中筛选获得1个共生缺失突变株HK56。使用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)的方法从M.huakuii7653R中克隆了exo56序列。exo56全长969 bp,编码322个氨基酸,其编码产物Exo56与糖基转移酶2个家族的成员有很高的相似性,糖基转移酶为胞外多糖合成所必需。盆栽结果表明,exo56基因突变株只能形成少量的不固氮根瘤。