3株商业克鲁维酵母对贺兰山东麓赤霞珠干红葡萄酒增酸效果及酒品质的影响

为探究商业化的克鲁维酵母对葡萄酒增酸效果及酒品质的影响,以贺兰山东麓的赤霞珠葡萄为原料,选取了3株商业化的克鲁维酵母:2株耐热克鲁维酵母(Lachancea thermotolerans,1株商品名Excellence X-FRESH,简称“卓越X”;1株商品名ZYMAFLORE OMEGALT,简称“ZO”)和1株乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans,商品名CV E-7,简称“CV E-7”),将它们与酿酒酵母(商品名Excellence XR,简称“XR”)以10∶1的接种量进行顺序发酵实验。分析了3株克鲁维酵母对葡萄酒中有机酸含量、基本理化指标、香气成分组成及感官特性的不同影响。结果表明,卓越X酒样和CV E-7酒样具有显著的增酸效果,特别是乳酸的质量浓度有所提高。所有接种克鲁维酵母的葡萄酒的基本理化指标均符合GB/T 15037—2006要求。卓越X酒样和CV E-7酒样的紫红色色调有显著提高(P<0.05)。相比仅使用酿酒酵母的对照组酒样,混菌发酵制得的酒样中香气化合物种类更丰富,质量浓度更高,尤其是乳酸乙酯、高级醇和脂肪酸的总质量浓度有显著提高(P<0.05)。对OAV大于1的香气活性化合物进行主成分分析,表明卓越X酒样具有更丰富的酯类化合物、高级醇和脂肪酸;CV E-7酒样增加了癸醛、2,3-丁二酮、己酸异戊酯等化合物的质量浓度;ZO酒样中酯类化合物丰富并且异戊醇质量浓度较高。主观评价结果表明,卓越X酒样和CV E-7酒样的得分较高,其次是ZO酒样,最低是未混菌发酵的对照组。研究表明,3株商业克鲁维酵母对贺兰山东麓“赤霞珠”葡萄酒品质都具有积极影响,特别是卓越X和CV E-7的增酸效果良好,可作为贺兰山东麓低酸赤霞珠原料的增酸菌株。希望研究可为赤霞珠葡萄酒的增酸酿造技术提供参考,为葡萄酒品质的提高提供理论依据。

克鲁维酵母突变株UV-G-40-3菊粉酶性质的研究

研究了克鲁维酵母突变株（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ－ＵＶ－Ｇ－４０－３）所产菊粉酶的分布为胞外酶∶胞壁酶∶胞内酶比是５．７∶１．６∶１。该酶Ｓ／Ｉ为５．３，最适温度为５０℃，最适ｐＨ为４．５，在５０℃以下、ｐＨ４．５～８的范围内比较稳定，４℃贮存稳定性好，１４ｄ后仍保持７６％活力，为外切型菊粉酶，酶解粗菊糖（洋姜提取液）活性为纯菊糖的４倍。

克鲁维毕赤酵母与酿酒酵母顺序接种对茵红李果酒风味的影响

为提高茵红李果酒的风味品质,选用克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)进行顺序接种,接种时间间隔分为24 h和48 h,接种比例为1:3、3:1和1:1。通过测定酵母生物量变化、理化指标、挥发性风味成分和感官分析,探究不同接种策略对茵红李果酒风味的影响。结果显示,在混菌发酵中,两种酵母相互制约,6~7 d后未检测到P.kluyveri的活菌存在。此外,与间隔24 h相比,间隔48 h接种发酵的茵红李果酒中乙醇含量较低,而还原糖含量较高。与对照纯酿酒酵母相比,混合发酵使茵红李果酒中酯类化合物浓度增加了33.37%~56.96%,高级醇类减少了47.23%~60.69%。其中T481:3和T243:1接种方式的酯类化合物含量增加最为显著。主成分分析揭示T243:1与苯甲酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙酸异丁酯、乙酸顺式-3-己烯酯和葵酸乙酯密切相关。感官评价显示,T243:1发酵的茵红李果酒在花果香和整体可接受性方面的评分最高。综上所述,T243:1接种方式有助于提升茵红李果酒的风味品质,为茵红李果酒生产工艺的优化提供了理论参考。

高效液相色谱法测定克鲁维酵母菊芋发酵液中的乙醇，糖和有机酸类代谢成分

建立了高效液相色谱法同时分析菊芋发酵液中的乙醇和有机酸的方法。采用HPLC有机酸分析柱,流动相为0.01 mol/L H2SO4,流速为0.5 mL/min,以紫外和示差折光检测器作为双通道检测手段,同时对克鲁维酵母菊芋发酵液中的柠檬酸、α-酮戊二酸、葡萄糖、丙酮酸、果糖、琥珀酸、乳酸、甘油、乙酸、乙醇进行了定量分析,本方法的回收率为95.8%～109.6%;RSD为0.33%～4.0%,结果表明,本方法简单、快速、准确,适用于监控克鲁维酵母发酵产物并指导整个发酵过程条件的优化。

克鲁维酵母Y-85合成菊粉酶最适条件的研究

采用响应面方法（ResponseSurfaceMethod,RSM）对克鲁维酵母（Kluyveromycessp．）Y－85产菊粉酶培养基成份进行了优选，和正交试验相比，该法选出的最适培养基的酶发酵水平提高28％。用15L自控发酵罐进行产酶条件控制试验，并在1000L罐上进行5批次酶发酵中试，平均菊粉酶活性达68.9u／ml。

克鲁维酵母Y-85菊粉酶的纯化和性质

克鲁维酵母(Kluyveromyces sp.)Y-85产生的胞内菊粉酶(endocellular inulinase)和胞外菊粉酶(exocellular inulinase)粗酶液分别经PEG6000-磷酸盐缓冲液双水相抽提得部分纯化酶液。前者进一步用硫酸铵分级沉淀、Protein-PAK DEAE离子交换、Protein-PAK200SW凝胶过滤后得到两个菊粉酶组分EⅠ和EⅡ;后者采用DEAE-Sephacel离子交换、Sephadex G150凝胶过滤后得到菊粉酶Eexo。经Waters 650E蛋白纯化系统鉴定,三者均呈单一的对称峰;EⅠ和EⅡ达聚丙烯酰胺盘状凝胶电泳纯。EⅠ、EⅡ和Eexo的分子量分别为42kD、65kD和57kD;三者均为糖蛋白,多糖含量分别为30％、35％和25％;I/S(Inulinaseactivity/Sucrase activity)比值分别为0.086、0.078和0.072;三者均属外切菊粉酶。EⅠ、EⅡ和Eexo酶反应最适pH分别为4.6、4.5和4.6,最适温度分别为52℃、52℃和55℃;Ag^+、Hg^(2+)和PCMB对酶活性有强烈的抑制作用;三者水解菊芋粉糖液的产物均为果糖(86.5％)和葡萄糖(13.5％)。

克鲁维酵母固体发酵高产菊粉酶的研究

首次利用固体发酵对筛选得到的一株克鲁维酵母S120高产菊粉酶的发酵工艺进行了初步研究。结果表明:麸皮是菌株S120产酶的最适基质,10%菊芋粉和0.5%硫酸铵有助于产酶;优化培养条件为:在300ml三角瓶中装料量20.0g,含水量为66%(V/W),起始pH5.7,培养温度34℃,接种量3.9%(V/W),发酵72h,菊粉酶酶活为118.28U/g(干重)。菌株S120菊粉酶的合成属于延续合成型,在工业生产中具有应用前景。

乳酸克鲁维酵母β-半乳糖苷酶的分离纯化及性质研究

乳酸克鲁维酵母经高压破壁后的粗提液，其β－半乳糖苷酶比活力为５．５６ｕ／ｍｇ．经硫酸铵沉淀，丙酮沉淀，ＰＡＰＭＡ－Ａｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ柱层析后，乳糖酶比活力达３７０ｕ／ｍｇ，纯化了６６．２倍，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定为一条带，分子量８５０００Ｄａ。酶作用的最适ｐＨ在６．４－６．８之间，最适温度４０℃，５０℃保温１５ｍｉｎ酶活丧失９０％，以邻硝基苯－β－半乳糖苷为底物的米氏常数为２．

克鲁维酵母与酿酒酵母属间原生质体融合构建高温酵母菌株

通过PEG诱导碘乙酸灭活呼吸缺陷克鲁维酵母（Kluyveromycessp．Y034）原生质体与酿酒酵母（SaccharomycescerevisiaeA001）原生质体融合，获得45℃发酵产酒率高达8．7％的高温酵母菌株AY006。线粒体缺失和氯霉素抑制可显著降低高密度原生质体回复抑制效应。对融合子菌落形态、同工酶性质和高温发酵等方面分析，融合株表达了耐温和高产酒率双亲优良性状，证实其杂种特征。

克鲁维酵母种间原生质体融合的研究

乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis Y12-1)和脆壁克鲁维酵母(K.fragilis8554)是乳糖酶生产菌株。应用原生质体融合技术进行了两菌株种间融合的研究。通过试验,原生质体形成及再生的最佳条件为:对数期的细胞,2％的蜗牛酶,30℃酶解30分钟,原生质体形成率90％以上,再生率20％左右。原生质体融合由聚乙二醇(PEG)诱导。K.lactisY12-1不能发酵菊糖;K.fragilis8554不能同化D-松三糖和麦芽糖。利用二菌株自身的营养缺陷性质获得融合子。融合子既能发酵菊糖又能同化D-松三糖和麦芽糖;融合子的DNA含量约为二亲株之和;融合子的菌落形态与亲株相比有一定差别;在以乳糖为碳源的培养基中,融合子的乳糖酶产量提高14—16％;连续15次传代,融合子稳定。

克鲁维酵母(Kluyveromyces SP.)Y-85菊粉酶生物合成的调控

研究了克鲁维酵母(KluyveromycesSP.)Y-85菊粉酶生物合成的诱导和阻遏机制,发现菊粉酶的生物合成受底物菊粉诱导和菊粉降解物阻遏的双重调控。对诱导作用机理的探讨认为,二聚果糖是酶合成的生理诱导物。研究着重探讨了菊粉酶生物合成的阻遏作用,当还原糖浓度在1.61mg/mL以上时,酶的合成受到明显的阻遏调节,在易利用碳源中,果糖的阻遏作用最强(阻遏率达60.47%)。通过对该菌株阻遏作用机理的探讨,认为果糖的阻遏调控发生在酶蛋白合成的转录水平上。

基于rDNA序列分析的湖北克鲁维酵母系统发育地位探讨(英文)

国内于20世纪90年代初曾描述过两个克鲁维酵母新种:中国克鲁维酵母(Kluyveromyces sinensis M. X. Li et al.)和湖北克鲁维酵母(Kluyveromyces hubeiensis M. X. Li et al.),二者均分自湖北神农架自然保护区。前者已被国际酵母菌分类学研究者接受和承认,而后者却一直被忽视。本文根据小亚基(18S) rRNA基因、大亚基(26S) rRNA基因D1/D2区和转录间区(ITS)序列分析,对K. hubeiensis进行了分子系统学研究。结果显示,K. hubeiensis代表一个具有充分分子系统学数据支持的独立种,该种与Saccharomyces spencerorum和Kluyveromyces lodderae形成一个高支持率的分枝,且与前者更近缘。本研究还显示,K. sinensis与Saccharomyces naganishii具有很近的亲缘关系。鉴于目前仅依靠序列分析对Kluyveromyces和Saccharomyces及其它相关属进行调整尚不现实,故建议仍维持这两个属的传统概念,并继续使用原种名。

分离自神农架的湖北克鲁维酵母新种

从我国湖北省神农架地区的霉腐树叶上,分离到一株克鲁维酵母属的酵母。其形态与生理方面与已知种与变种均有很大差异,定为新种,并命名为湖北克鲁维酵母(Kluyveromyceshubeiensis M.X.Li.X.H.Fu et Tang sp.nov.)。

克鲁维酵母高渗培养与原生质体制备与再生

研究了高渗预培养条件对克鲁维酵母Ｙ０３４原生质体形成与再生的影响。结果表明，同等条件下，经高渗预培养的原生质体再生率为常规培养的１．７倍，为改造菌株遗传特性而制备高活性原生质体探索了新的途径。

克鲁维酵母(K. hubeiensis)产菊粉酶的发酵参数研究

菊粉酶(inulinase)是一种降解菊糖β-2,1-D-果聚糖果糖苷键生成果糖或低聚果糖的水解酶.本研究在筛选菊粉酶高产菌株基础上,对产酶能力较强的1株湖北克鲁维酵母(Kluyvreromyces hubeiensis)的发酵产酶参数进行了优化;结果表明,该菌株在菊糖3%,蛋白胨3%,pH 5.0,30～37℃摇床培养48 h的产酶活力最高,其单位酶活比条件优化前提高了8～10倍.

克鲁维酵母中外切菊粉酶基因在毕赤酵母中的表达研究

用PCR的方法从克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)ATCC12424中克隆出外切菊粉酶基因.将该基因克隆到毕赤酵母表达载体pHBM905C、pHBM906上,构建了外切菊粉酶毕赤酵母表达载体pHBM1200、pHBM1201.将两者转化毕赤酵母GS115,得到重组菌株GS115(pHBM1200)、GS115(pHBM1201),将这两种重组菌株进行摇瓶发酵,测得带α-信号肽的菌株GS115(pHBM1200)表达的外切菊粉酶最高酶活为89.43 U/mL,带自身信号肽的菌株GS115(pHBM1201)表达的外切菊粉酶最高酶活为14.828 U/mL.SDS-PAGE电泳表明,外切菊粉酶的表观分子量为90 kD.将外切菊粉酶用去糖基化酶endoH处理后,SDS-PAGE电泳表明,分子量为60 kD,和预计的分子量一致.

克鲁维酵母菊粉酶的酶学特性研究

探讨克鲁维酵母S120菊粉酶的酶学特性。克鲁维酵母S120菊粉酶为内切型菊粉酶,该酶最适pH5.5,最适温度50℃,锰离子、镁离子、钙离子对菊粉酶的激活作用最显著,而锌离子,铜离子,亚铁离子有抑制作用。试验条件下,动力学方程为1/V=0.676 3×(1/S)+0.063 6,其中米氏常数Km为10.63 mg/mL,最大反应速度为15.72 mg(/mL.s)。

克鲁维酵母分子生物学会议述评

第10届国际克鲁维酵母分子生物学会议于1997年9月5～7日在法国里昂举行。来自世界各地的与会者约80余人。笔者在大会上介绍了"脆壁克鲁维酵母LAC 4基因5’上游非编码区结构与功能特性的研究",受到了好评。克鲁维酵母是近10年来日益受到重视的一个酵母属,包括16个种和若干个亚种。能利用乳清(乳品工业的一种废料,含有丰富的乳糖)大量繁殖。这种酵母具有营养要求简单、温度适应范围广、生长旺盛和蛋白分泌能力强以及对人类安全的特点,一直是生产乳糖酶、乙醇和单细胞蛋白的重要微生物。80年代后期,人们发现它的生理特点非常适合于作为基因工程的表达宿主,而引起生物工程界的关注。此外,研究还发现它的某些菌株没有明显的葡萄糖抑制效应,也引起了许多科学工作者的兴趣。

克鲁维酵母SK16.001 β-半乳糖苷酶的纯化工艺研究

采用不同分离手段纯化获得克鲁维酵母SK16.001中β-D-半乳糖苷酶。结果显示,通过硫酸铵分级盐析、透析脱盐、DEAE-fastflow离子强度梯度层析、Superdex G-75凝胶过滤后,酶的最终回收率为30.5%,纯化倍数为25.2,经PAGE电泳鉴定得到单一蛋白条带,分子量约为63.3kDa。

克鲁维酵母菊粉酶基因在毕赤酵母中的表达

从菊粉酶酶源菌株克鲁维酵母GKluyveromycesmarxianus)Y109中提取菊粉酶基因,PCR扩增Y109的菊粉酶基因inuB1,核苷酸序列测定分析表明inuB1的阅读框架全长1665bp,没有内含子,其中存在4个潜在的N 糖基化位点。以pPIC9K为表达载体,构建inuB1的酵母转化载体,转化毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115,获得菊粉酶基因工程菌GS115/inuB1。GS115/inuB1甲醇诱导发酵表达菊粉酶,inuB1基因重组胞外菊粉酶表观分子量为90kD(SDS PAGE),比酶活性是12.29U/mg。