基于免培养法研究泸州地区浓香型白酒窖泥原核微生物群落结构

通过构建细菌和古菌的16S rRNA基因克隆文库、测序及系统发育树分析,确定浓香型白酒成熟窖泥中细菌和古菌的群落组成。结果表明:窖泥中的细菌多样性丰富,多达34个OTUs。主要分布于14科以及2个科级分类地位未知的梭菌纲和拟杆菌纲类群内,且大多属于严格厌氧细菌。其中梭菌纲为窖泥内细菌群落的绝对优势种群(克隆子数比例为68.2%),除此之外还存在一定比例的芽孢杆菌纲(21.6%)、拟杆菌门(8.0%)、柔膜菌门(1.1%)和Synergistetes门(1.1%)的分布。古菌的群落组成较为简单,仅4个OTUs,主要分布于甲烷囊菌属、甲烷八叠球菌属、甲烷杆菌属和Methanomassiliicoccus内,克隆子数的比例分别为58.8%、29.4%、5.9%和5.9%。

土壤宏基因组的提取及基于免培养技术分析细菌16S rDNA

采用CTAB-SDS-冻融法和玻璃粉吸附法提取土壤宏基因组(metagenome),经琼脂糖凝胶电泳后用回收试剂盒对其进行纯化。以细菌16SrDNA通用引物从宏基因组中扩增出V8和V9两个高变区,回收纯化后与克隆载体pMD18-T连接,转化大肠杆菌DH5α,随机挑取一个阳性克隆菌进行序列测定,经BLAST分析表明该序列所代表的是一个不动杆菌属(Acinetobacter)细菌。本研究结果为分析土壤微生物种群结构和直接从土壤中分离功能基因奠定了基础。

免培养法对一热泉细菌多样性的初步研究

应用免培养法 (Culture independent)对云南腾冲热海大滚锅高温热泉中细菌的多样性进行初步的分析。经过克隆筛选 ,测定了 5个克隆的 1 6SrDNA插入片段的近全序列 ,系统发育分析的结果表明 ,它们分属于Bacillus、Hydrogenobacter和Pseudomonas,有一个克隆尚难确定其分类地位 ,它属于Thermodesulfobacteriaceae科 ,介于Geothermbacterium属和Thermodesulfo bacteria属之间。经PCR扩增出上述 5个克隆 1 6SrDNA插入序列中及环境样品总DNA中的1 6SrDNAV8高变区约 60 0bp片段 ,进行变性梯度电泳 (DGGE)。所得电泳图谱和 5个序列的系统发育树不仅表明该高温热泉存在着丰富的细菌多样性 。

醉马草免培养内生细菌的多样性

为了解醉马草内生细菌的组成和多样性,采用液氮研磨法提取醉马草总DNA,利用内生细菌16S rRNA基因特异性引物对醉马草总DNA进行16S rRNA基因扩增,构建醉马草内生细菌16S rRNA基因文库。对筛选到249个克隆进行HaeШ酶切分析,得到57个操作分类单元(OTUs)。系统发育分析将其归为4个门:变形杆菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)以及1个未知类群。其中74%的克隆与可培养细菌中的37个属具有高的16SrRNA基因序列相似性(97%—100%),其中芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、红球菌属(Rhodococcus spp.)、黄杆菌属(Flavobacterium spp.)、黄单胞杆菌属(Xanthomonas spp.)最为丰富。另外26%的克隆序列与GenBank中已存细菌16S rRNA基因序列相似性小于96%。研究结果表明,醉马草中可培养内生细菌丰富,多样并且可能存在一些潜在新物种或新类群。

基于免培养法的中高温大曲细菌群落结构研究

通过构建细菌16S rRNA基因克隆文库、测序及构建系统发育树,对泸州老窖中高温大曲的细菌群落结构进行了研究。结果表明:中高温大曲的细菌组成较为丰富,且大部分与可培养的细菌类群相关,主要分布于芽孢杆菌纲、梭菌纲以及放线菌纲。其中芽孢杆菌纲内克隆子多样性最为丰富,主要包括乳杆菌属、乳球菌属、魏斯氏菌属、芽孢杆菌属、明串珠菌属、片球菌属和高温放线菌属;放线菌纲内克隆子分布于糖多孢菌属;梭菌纲内克隆子分布于Symbiobacterium和一个属级分类地位未知的梭菌纲内。中高温大曲内细菌的优势种群为魏斯氏菌(占全部克隆子比例的30.35%,2 OTUs)、高温放线菌(28.57%,2 OTUs)和乳杆菌(19.65%,6 OTUs)。

免培养技术对浓香型白酒大曲中细菌多样性的影响

采用免培养(culture independent)技术直接从浓香型白酒大曲中提取细菌微生物基因组DNA,利用细菌16S rDNA通用引物扩增大曲混合微生物的16S rDNA,采用PCR扩增技术、分子克隆技术以及序列同源性分析等方法测定大曲中细菌的16S rDNA基因全序列,通过与基因数据库中相似菌群序列同源性的比较,构建系统发育树。结果显示,成熟的大曲中细菌共分为Lactobacillus,Pantoea,Enterobacter,Klebsiella,Leuconostoc,Erwinias,Pseudomonas,Bacillus licheniformis几大类群,表现出高度的细菌多样性。

浓香型白酒窖泥中细菌多样性的免培养技术分析

采用免培养(culture independent)技术直接从浓香型白酒窖泥中提取细菌微生物混合基因组DNA(也叫元基因组DNA),利用细菌16S rDNA通用引物扩增窖泥细菌的序列,根据16S rDNA序列对细菌多样性进行初步分析。采用PCR扩增技术、分子克隆技术以及序列同源性分析等方法测定细菌的16S rDNA,通过与基因数据库中相似菌群序列同源性的比较,得到样品菌种多样性,分别构建系统发育树。结果显示,细菌含有几大类群,表现出高度的细菌多样性。共分为Uncultured bacterium、Clostridium、Lactobacillus、Eubacterium和Syntroph-omonas五个细菌分类。

利用培养和免培养方法研究红壤的真菌多样性

利用培养和免培养方法研究了一个云南红壤的真菌多样性。扩增的18S rRNA基因片段经过RsaⅠ、HinfⅠ、HaeⅢ三种限制性内切酶消化后,培养方法共获得16种限制性酶切长度多态类型(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP),而免培养方法仅获得了12种RFLP类型。每个代表类型经DNA测序及系统发育分析表明,免培养方法得到的真菌全部属于子囊菌门。优势物种与Aspergillus niger类似,占免培养真菌的40.9%。其次是Penicillium属和Paecilomyces属真菌,分别占免培养真菌的18%和17%。此外,有13个克隆仅和环境克隆具有较近的亲缘关系。培养方法获取的真菌包括Ascomycota门(11.5%)、Zygomycota门(86.5%)以及Basidiomycota门(1.9%)真菌,优势克隆来自Mortierella属,占全部培养克隆的55.8%,有21.2%的序列与Absidiaglauca相似。两种方法观察到的真菌物种完全不同。

拜城盐山免培养放线菌多样性研究

[目的]研究新疆拜城盐山高盐环境中的放线菌多样性,为今后的开发和利用奠定基础。[方法]应用基于16S rRNA基因序列的免培养技术和系统发育分析方法对拜城盐山样品中的放线菌多样性进行研究。采用SDS-CTAB方法提取样品中的总DNA,利用特异性引物扩增样品DNA中的放线菌16S rRNA基因,并构建放线菌16S rRNA基因克隆文库;通过比较酶切图谱,挑选克隆文库中的代表克隆,进行序列测定和BLAST比对分析。[结果]构建的放线菌克隆文库共包含216个放线菌克隆。克隆序列经过BLAST比对分析,放线菌亚纲中的克隆有171个,占总克隆数的79.2%。酸微菌亚纲45个克隆,占总克隆数的20.8%,与GenBank中已知的微球菌16S rRNA基因序列最大相似度小于92%,是酸微菌亚纲中新的类群。优势放线菌为放线菌亚纲棒杆菌亚目诺卡氏菌科(Nocardiaceae)的红球菌属(Rhodococcus),占克隆总数的51.9%。有24.5%的序列与已有效发表菌株的序列相似性小于97%,部分序列形成了几个独立的进化分支,可能代表着放线菌新的类群。[结论]拜城盐山存在着较为丰富的放线菌种类,并且潜藏着新类型的放线菌资源。

基于免培养技术的食用菌病害微生物rDNA测序及初步分析

采用CTAB结合DNA凝胶回收试剂盒法提取四种主要食用菌病害组织样品的宏基因组DNA,用16S rDNA和18S rDNA通用引物分别对样品的基因组DNA进行PCR扩增、连接、转化并进行单克隆测序。每对引物随机挑取20个阳性克隆的rDNA序列进行比对,并对病害微生物的亲缘关系进行了初步分析,结果表明四种病害样品中两种为细菌性病害,两种为真菌性病害。

基于免培养的微生物群落多样性研究方法概述

微生物群落多样性问题已成为现在的研究热点.有关微生物群落多样性的研究方法由最初的传统培养方法、生化鉴定、分子测序逐渐发展为免培养方法.通过对免培养方法进行概述,并对各类方法的优缺点进行简单阐述.免培养方法主要分为两类:一类是不基于微生物总基因组DNA的分析方法;另一类是基于微生物总基因组DNA的分析方法.目前研究微生物群落多样性主要采用高通量测序技术.

免培养法对大鲵肠道微生物多样性的研究

【目的】了解大鲵肠道内生细菌的组成及多样性。【方法】采用美国Mo Bio公司试剂盒提取大鲵肠道内容物总DNA,选用细菌通用引物799F和1492R对总DNA进行16S rRNA基因特异性扩增,构建大鲵肠道内容物内生细菌16S rRNA基因克隆文库,对阳性克隆进行限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)分析,并对HaeⅢ酶切带谱不同的菌液进行测序,构建系统发育树。【结果】根据酶切带谱分析和测序结果的不同,将随机挑取的101个阳性克隆归为28个不同的可操作分类单元(OTUs),系统发育分析表明这些克隆序列分别属于变形菌门(Proteobacteria)、梭菌门(Clostridia)、芽孢杆菌门(Bacilli)和衣原体门(Chlamydiae)4个门。其中,变形菌门(Proteobacteria,占克隆总数的92.08%)为最优势类群。序列比对结果表明这些克隆序列分别与已报道的20个属具有较高的相似性。此外,还有一个OTU在系统发育树上形成独立分支且未能确定其分类。【结论】大鲵肠道内生细菌多样性丰富,并且可能存在新的分类单元。

红豆杉免培养内生细菌多样性的初步研究

【目的】了解红豆杉(Taxus chinensis)内生细菌的组成及多样性。【方法】提取红豆杉组织总DNA,选用细菌通用引物799F和1492R对总DNA进行16S rDNA特异性扩增,构建红豆杉内生细菌16S rDNA克隆文库,对阳性克隆进行PCR-RFLP(限制性内切酶片段长度多态性)分析,并对酶切带谱不同的菌液进行测序,构建系统发育树。【结果】根据酶切带谱分析和测序结果的不同,将随机挑取的158个阳性克隆归为26个不同的可操作分类单元(OUTs),系统发育分析表明这些克隆序列分别属于变形菌门(Proteobacteria,包含Alpha、Beta、Gamma、Delta亚群)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)4个门。其中,变形菌门(Proteobacteria,占克隆总数的58.86%)为最优势类群。序列比对结果表明这些克隆序列分别与已报道的20个属具有较高的相似性。此外,还有一个OUTs在系统发育树上形成独立分支且未能确定其分类。【结论】红豆杉内生细菌多样性丰富,并且可能存在新的分类单元。

免培养法研究野生川金丝猴肠道内生细菌多样性

【目的】了解野生川金丝猴(Rhinopithecus roxellana)肠道内生细菌的组成及其多样性。【方法】提取川金丝猴肠道内生细菌总DNA,选用细菌通用引物799F和1492R对总DNA进行16S rRNA基因特异性扩增,构建川金丝猴肠道内生细菌16S rRNA基因克隆文库,对阳性克隆进行限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)分析,并对HaeⅢ酶切带谱菌株进行测序,构建系统发育树。【结果】根据酶切带谱分析和测序结果,将随机挑取的157个阳性克隆归为27个不同的可操作分类单元(OTUs)。系统发育分析表明这些克隆序列有62.10%属于厚壁菌门(Firmicutes),其中包括梭菌属(Clostridium)、Cellulosilyticum属、Robinsoniella属、Anaerofustis属、Blautia属和Anaerovorax属,有37.90%属于未培养细菌。【结论】川金丝猴肠道内生细菌多样性丰富,并且可能存在新的分类单元。

从腾冲热海免培养获得的5个16 S rDNA克隆分析

用免培养法(culture-independentapproach)从腾冲大滚锅高温热泉中获得的16SrDNA,经克隆筛选,测定了其中5个克隆的16SrDNA插入片段的近全序列.构建的系统发育树分析结果表明,5个克隆中有2个是Bacillus属,1个是Hydrogenobacter属,1个是Pseudomonas属,还有1个在Thermodesulfobacteriaceae科,介于Geothermbacterium属和Thermodesulfobacteria属之间.

西藏扎布耶盐湖细菌多样性的免培养技术分析

【目的】利用免培养技术,获得有关西藏高原高盐度、高海拔盐湖的细菌多样性认识。【方法】从西藏扎布耶盐湖沉积样品中提取微生物总DNA,利用细菌引物f530/r1492扩增16S rRNA基因,然后构建16S rRNA基因质粒文库。采用HaeⅢ和HhaⅠ两种内切酶对阳性克隆质粒DNA进行ARDRA分型分析,根据分型结果挑选克隆进行测序。得到它们的16SrRNA基因部分序列,根据获得的序列构建构建系统发育树。【结果】在系统发育树上,部分克隆(占总克隆数的57.14%)与已知细菌属归于同一分支,主要分布在γ-变形菌纲、α-变形菌纲、δ-变形菌纲、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和疣微菌门(Verrucomicrobia)的23个嗜盐细菌属之中。其余的克隆为未培养序列,与前者差异很大,在进化树上形成了独立的分支。【结论】研究结果显示出扎布耶茶卡湖中的细菌组成具有极其丰富的多样性。

新疆巴里坤、七角井和台特玛盐湖沉积物中免培养放线菌群落组成与离子成分分析

【背景】新型病原微生物层出不穷,放线菌作为最重要的抗生素生产菌仍受制于纯培养困难和菌种资源不足,而对于盐湖沉积物中的丰富放线菌资源却鲜有报道。【目的】探索巴里坤、七角井和台特玛盐湖沉积物放线菌群落结构及其多样性,分析盐湖沉积物中化学离子成分对放线菌群落的影响。【方法】每个盐湖采集5份样品并混合,使用SDS-CTAB抽提法提取总DNA,使用放线菌特异性引物进行PCR扩增并构建16S r RNA基因文库,每个样品随机挑选220个克隆子,经过Hae III酶切筛选后对阳性克隆子进行测序分析;对每个样品的8种主要化学离子进行检测,并将沉积物化学离子成分与放线菌群落进行关联性分析。【结果】获得的381个克隆序列属于143个操作分类单元(Operational taxonomic Unit,OTU),聚类结果显示从3个盐湖中共探测到37个放线菌属(台特玛盐湖:24;巴里坤盐湖:16;七角井盐湖:14)。3个盐湖共有的放线菌属为Aciditerrimonas、Aquihabitans、Demequina、Dietzia、Ilumatobacter和Amycolatopsis。从放线菌群落结构上看,台特玛盐湖与其他两湖差异性很大,巴里坤盐湖与七角井盐湖群落相似性更高,巴里坤、七角井和台特玛盐湖未知放线菌的组成分别为47.59%、53.07%和51.53%。利用RDA(Redundancy analysis)分析盐湖沉积物化学离子与放线菌群落的关联性,结果显示与Na^+、Cl^-和K^+相比,Mg^(2+)、Ca^(2+)、SO_4^(2-)、HCO_3^-和CO_3^(2-)与盐湖放线菌类群的相关关系要更加紧密。【结论】3个盐湖中具有丰富的放线菌多样性,包含大量的未知放线菌。盐湖沉积物不同的化学离子成分影响着各自独特的放线菌群落,可为开发新的盐湖放线菌资源提供依据。

云南江城和黑井盐矿沉积物未培养放线菌多样性比较

类群特异性引物的应用使得研究者可以对感兴趣的微生物类群进行针对性研究。围绕云南江城和黑井两个地区的3个盐矿样点沉积物中放线菌的多样性和群落组成,我们通过放线菌特异性引物对总DNA进行16SrRNA基因扩增,经过克隆文库构建,利用酶切并选择其中不同带型的133个克隆的16SrRNA基因插入片段进行测序。系统发育分析和统计学结果表明,两地放线菌16SrRNA基因克隆广泛分布于整个放线菌门,同时发现部分序列可能属于放线菌的新类群。分析结果还预示,江城和黑井两地盐矿虽处云南不同地域含盐区,但两地未培养放线菌物种多样性和系统发育关系均较为相似。

硝尔库勒湖沉积物中非培养放线菌多样性

【目的】认识和了解盐湖沉积环境中放线菌的多样性,为今后的开发和利用奠定基础。【方法】应用免培养技术和基于16S rRNA基因序列的系统发育分析对新疆硝尔库勒盐湖沉积物中放线菌的多样性进行了研究。实验采用SDS-CTAB法提取土样中总DNA,利用放线菌特异性引物对土样总DNA进行16S rRNA基因扩增,并构建16S rRNA基因克隆文库;对随机挑选的160个克隆通过酶切筛选出51个不同图谱的重组克隆,并对其测序。【结果】所获得的51个克隆序列属于39个OTUs,其中52.9%的克隆序列分布于放线菌门(phylum Actinobacteria)放线菌亚(Actinobacteridae)的5个亚目和酸微菌亚纲(Acidimicrobidae)中,并且在这两个亚纲中有大量克隆序列属于放线菌的新类群,另外47.1%的克隆序列以极高的自展值在放线菌门内支持形成一个独立的大分支,极有可能代表一个新亚目或更高级分类单元的类群。【结论】这些研究结果说明硝尔库勒盐湖中存在有较为丰富的放线菌系统发育多样性,并且潜藏着新类型的放线菌资源。

离萼杓兰不同居群菌根真菌组成及多样性研究

离萼杓兰是兰科杓兰属植物,具有较高的观赏和经济价值,已成为濒危植物。首次采用微生物免培养技术研究离萼杓兰不同居群菌根真菌组成及多样性水平。结果表明:从4个居群的离萼杓兰菌根中共获得310个ITS-taxa,其中,天生桥56个,白地村84个,纳帕村62个,吉能村108个;离萼杓兰菌根真菌分别涉及胶膜菌属(Tu⁃lasnella),伏革菌属(Corticium)、角担菌属(Ceratobasidium)、层孔菌属(Fomes)、毛壳菌属(Chaetomium),丝核菌属(Rhizoctonia)、瘤菌根菌属(Epulorhiza)和念珠菌根菌属(Moniliopsis)8个属及一类归属未定的真菌;不同生境条件可影响离萼杓兰菌根真菌的优势菌群,但胶膜菌属具有寄主专一性特征。