HBV DNA免提取核酸荧光定量PCR检测法应用评价

目的评价乙型肝炎病毒核酸免提取荧光定量PCR方法(一步法)对不同病毒载量时检测性能。方法评价试剂为圣湘公司HBV DNA荧光定量PCR检测免提取试剂盒,对照试剂为匹基公司、科发公司、达安公司3家煮沸核酸提取法试剂盒。将4种试剂盒按各自要求对配套的不同浓度标准品、阴性、临界值的反应曲线考核其线性和灵敏度。另检测1份已知浓度质控品、5份未知浓度样本血清考核其准确性、可比较性。检测仪器为瑞士罗氏公司Light Cycler荧光定量仪。结果一步法、匹基公司、科发公司、达安公司4家标准品浓度相关性R2分别为0.992、0.998、0.999及0.963,线性均满意。4个不同浓度标准品扩增曲线图形:一步法曲线比其他3家更为光滑,呈间距均匀的S形抛物线,2次结果重复曲线更趋重迭。对已知定值为(1.5E+06)IU/mL的质控品检测:一步法、匹基公司、科发公司、达安公司相应结果为(1.16E+06)、(5.27E+05)、(4.32E+05)及(4.90E+06)IU/mL,一步法最接近靶值。5份血清结果显示:4种试剂盒除P公司对2号样本结果为低于检出下限外,其他对1号、2号、3号、5号检出结果均与其他3家接近,可为临床接受。4号样本为一个低值临界范围,出现低于报告限、低值及临界追踪值3种结果现象。结论 4家HBV DNA荧光定量PCR检测检测试剂线性结果均满意,对中、高浓度样本检测结果较接近,但在低浓度临界范围检测报告可能会对临床诊断带来误导,需追踪复查。HBV PCR一步法检测技术免除了核酸高温裂解提取步骤,操作简便,人为误差减少,性能稳定,有利提高检测灵敏度、结果准确性。

PRRSV类NADC30毒株免提取核酸荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为了建立简便、快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)类NADC30毒株免提取核酸荧光定量RT-PCR方法,试验根据GenBank中PRRSV类NADC30毒株NSP2基因设计引物和探针,建立了直接对样品中PRRSV类NADC30毒株检测的荧光定量RT-PCR方法。对该方法的敏感性、特异性和重复性进行评估,并对临床样本进行检测。结果表明:建立的PRRSV类NADC30毒株免提取核酸荧光定量RT-PCR方法的扩增体系(20μL)为2×PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix 10μL,PRRSV类NADC30毒株液1μL,NADC30-F(15μmol/μL)0.8μL,NADC30-R(15μmol/μL)0.8μL,NADC30-P(15μmol/μL)0.4μL,灭菌纯化水7μL。扩增程序为90℃3 min;60℃5 min;95℃5 s, 54℃20 s (收集荧光信号,选择FAM通道),40个循环。该法特异性好,对其他猪常见病原无交叉反应。对PRRSV类NADC30毒株液的最低检测限度为3.98 TCID_(50)/100μL,与传统提取核酸的荧光定量RT-PCR检测方法敏感性一致。不同病毒含量样本组内和组间变异系数均不高于2%,具有良好的重复性和稳定性。临床样本检测结果与传统荧光定量RT-PCR方法检测结果一致。说明建立的PRRSV类NADC30毒株免提取核酸荧光定量RT-PCR检测方法特异性好、敏感性高,具有良好的重复性和稳定性,可用于PRRSV类NADC30毒株的临床检测。

AGCU免提取STR荧光检测试剂盒的验证

目的考察AGCU免提取STR荧光检测试剂盒,对保存在滤纸片或FTA卡上血液样本的直接扩增检测情况。方法使用AGCU免提取STR荧光检测试剂盒,对未经提取的滤纸片血液样本、FTA卡血液样本675份进行直接扩增和18个基因座的DNA分型,并对结果的可靠性进行研究。结果18个基因座检测结果与PP16和ID试剂盒分型结果一致,2000年数据库样本成功率92.3%,2001年数据库样本成功率92.6%,2004以后年数据样本及案件样本、亲子鉴定样本成功率在99%以上。结论AGCU试剂盒可以成功地对滤纸片、FTA卡样本的18个STR基因座进行直接扩增检测,检验结果稳定,分型准确。

免提取冻干式百日咳鲍特菌核酸检测方法建立及应用

目的本研究建立快速、便携、特异、敏感的百日咳鲍特菌实时定量PCR(Q-PCR)核酸检侧方法,并初步探索在呼吸道感染患者中百日咳鲍特菌(Bordetella pertussis)检测的应用价值。方法靶基因采用IS481基因,优化反应试剂实现免核酸提取直接扩增,对体系进行冻干处理,简化操作步骤。并对所收集得到的上呼吸道感染者的咽拭子标本进行检测评价。结果本检测体系检出限达到100copies/mL,227例急性上呼吸道感染者的咽拭子标本中,其阳性检出率为3.96%。结论成功建立了高敏感、简便、快速的百日咳核酸检测方法,为百日咳诊断提供了新手段。

5种免提取试剂盒检验滤纸血痕结果的比较

目的探讨5种免提取试剂盒对滤纸血痕样本检验的效果。方法陈旧滤纸血痕(存放时间12～14个月)及新鲜滤纸血痕(存放时间小于1个月)各920份,分别随机分为5组。应用AGCU 17+1、Goldeneye 20A、Powerplex16HS、Identifiler Plus、Identifiler Direct 5种免提取试剂盒进行检验,对比各组检验结果。结果陈旧滤纸血痕5种试剂盒的检验成功率为98.91%～100%,各组间无差异(P>0.05);新鲜滤纸血痕,Identifiler Plus和Identifiler Direct试剂盒检验成功率高于AGCU17+1、Goldeneye 20A及Powerplex 16HS试剂盒(P<0.01);将样本做陈旧化处理后再用成功率较低的3种试剂盒进行检验,成功率分别升至100%、99.46%、99.46%;Identifiler Plus试剂盒扩增循环27次效果优于28次。结论本文5种试剂盒均可用于滤纸血痕的直接扩增检验,但使用AGCU17+1、Goldeneye 20A及Powerplex 16HS试剂盒需将新鲜血痕做陈旧化处理;Identifiler Plus试剂盒需将循环次数降为27次。

3型腺病毒免提取核酸重组酶介导的等温扩增实时荧光检测方法的建立及应用

目的 建立3型腺病毒(human adenovirus 3,HAdV-3)免提取核酸的重组酶介导的等温扩增(recmbinase acid amplification,RAA)实时荧光检测方法。方法 根据HAdV-3基因保守序列分别设计1对引物和1条探针,通过对免提核酸的条件摸索和优化,建立1种免提取核酸,重组酶介导的等温扩增实时荧光检测方法;通过对培养的毒株进行系列稀释,免提取核酸分析该方法的灵敏度;通过检测其他呼吸道病毒的原始样本,评价该方法的特异性;并检测HAdV-3临床样本,与传统的提核酸实时荧光定量PCR方法进行比较。结果 本研究建立的免提取核酸实时荧光RAA方法对10倍系列稀释的HAdV-3毒株进行检测,和实时荧光定量PCR方法相比,灵敏度相当,对应的最低浓度稀释样本的Ct值为36.87,对常见其他型别的呼吸道病毒检测无交叉反应。两种方法对56例HAdV-3阳性临床样本同时检测,结果完全一致。结论 本文首次报道了免提取核酸的实时荧光RAA检测HAdV-3的方法,该方法具有较高的灵敏度和特异性,适合应用于临床实验室及基层单位快速检测HAdV-3。

水蛭免加热提取物抗凝血及抗血栓作用

目的观察水蛭免加热提取物的抗凝血、抗血栓作用,并与水蛭煎煮浓缩物进行比较。方法小鼠灌胃给水蛭两种提取物5.72g生药/kg,2.86g生药/kg,1.43g生药/kg,采用玻片法测定小鼠凝血时间;剪尾法测定小鼠出血时间。大鼠灌胃给水蛭两种提取物4g生药/kg,2g生药/kg,1g生药/kg,观察对大鼠下腔静脉结扎后静脉血栓湿重及干重的影响、对电刺激颈总动脉闭塞性血栓形成时间的影响、对大鼠动-静脉旁路血小板血栓湿重的影响。结果水蛭免加热提取物延长正常小鼠凝血时间和出血时间,减轻大鼠静脉血栓的湿重和干重,延长大鼠颈总动脉血栓形成时间、减轻大鼠血小板血栓的湿重。结论水蛭免加热提取物具有强大的抗凝血作用,抑制大鼠静脉血栓、动脉血栓及血小板血栓的形成。水蛭免加热提取物在抑制大鼠静脉血栓形成、延长小鼠凝血时间等方面优于传统的煎煮提取物。

水蛭免加热提取物抗凝血作用及其机制研究

目的 :观察水蛭免加热提取物对动物凝血系统、凝血因子活性及纤溶系统的影响 ,并与水蛭煎煮浓缩物进行比较。方法 :动物灌胃给药 ,凝固法测大鼠 PT、APTT,PT法测血浆凝血因子 、 、 、 的活性 ,APTT法测因子 的活性 ,测 EL T观察药物对家兔纤溶活性的影响。结果 :水蛭免加热提取物能延长大鼠 PT、APTT,抑制凝血因子 、 、 的活性 ,对凝血因子 和 活性无明显影响 ;对兔血 EL T无明显影响 ,在延长大鼠 PT、降低大鼠凝血因子 、 活性等方面优于传统的煎煮提取物。结论 :水蛭免加热提取物通过抑制凝血因子 、 、 活性而抑制内、外源性凝血途径 ,对大鼠 PT、凝血因子 、

水蛭免加热提取物对高凝动物模型凝血系统及血小板聚集率的影响

目的:观察水蛭免加热提取物对鞣花酸所致高凝动物模型凝血系统及血小板聚集率的影响。方法:动物灌胃给药,小鼠尾静脉注射鞣花酸制造高凝动物模型,以剪尾法测定出血时间(BT);眼球采血,玻片法测定凝血时间(CT)。大鼠舌下静脉注射鞣花酸,腹主动脉采血,用试剂盒测定凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT),PT法测定凝血因子Ⅱ的活性,按吴氏法测定循环血小板聚集率。结果:水蛭免加热提取物能延长高凝模型小鼠的BT、CT和高凝模型大鼠的PT、APTT,抑制凝血因子Ⅱ的活性,降低血小板聚集率。结论:水蛭免加热提取物对高凝模型动物具有抗凝血、抗血小板聚集作用。

3种免核酸提取PCR试剂盒检测乙型肝炎患者血清中HBV DNA的比较

目的比较3种免核酸提取PCR试剂盒检测乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒(HBV)DNA的灵敏度和特异度,初步探讨其用于HBV DNA检测的临床价值。方法用3种免核酸提取PCR试剂盒分别检测30例慢性乙型肝炎患者及30例阴性参比血清标本中的HBV DNA,以荧光定量PCR结果为标准,比较3种试剂检测灵敏度和特异度。结果 3种试剂盒的HBV DNA阳性检出率分别为93.3%(28/30)、96.7%(29/30)、100%(30/30);3种试剂检测HBV阴性的特异度均为100%;3种试剂检测灵敏度A公司为103 IU/mL,B、C公司均为102 IU/mL。结论使用免核酸提取PCR试剂检测HBV快速、简便、高效,可用于临床HBV DNA快速检测。

非洲猪瘟病毒免提取核酸荧光定量PCR检测方法的建立

根据非洲猪瘟病毒(ASFV)保守的VP72基因序列,设计特异性引物和探针,经过优化反应体系中各组分及反应条件,建立了直接检测样品中ASFV的荧光定量PCR方法,并分析该方法的特异性和敏感性。结果显示,该直扩荧光定量PCR方法只对ASFV有特异性扩增,对其他几种相似疾病病原的灭活抗原,如猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪圆环病毒、口蹄疫病毒、印第安纳型水泡性口炎病毒、新泽西型水泡性口炎病毒、猪流行性腹泻病毒等检测均呈阴性。敏感性试验结果显示,对10倍梯度稀释的非洲猪瘟病毒灭活抗原的检测敏感性可达1×10^-6,与OIE推荐的传统的荧光PCR的检测敏感性相当。3个ASFV稀释度样品的组内和组间重复的变异系数均小于5%。该方法无须提取核酸,可在60 min内完成对样品的检测,检测快速、灵敏,结果准确,结合便携式荧光PCR仪,为野外或现场的非洲猪瘟病毒快速检测提供了一种切实可行的方法。

一种免核酸提取HBV-DNA荧光定量PCR试剂盒临床应用价值的评估

目的评估一种全新的免核酸提取的荧光定量PCR试剂检测HBV-DNA的临床应用价值。方法通过随机检测62例临床血清样品,比较免核酸提取和核酸提取两种试剂HBV-DNA扩增结果的一致性、灵敏度和相关性。结果两种HBV-DNA荧光定量试剂阴阳结果符合率为100%;HBV-DNA定量结果无显著差异(t=1.006,P>0.05);免核酸提取法不同浓度梯度相关系数r=-0.9999(P<0.001);灵敏度为4×102IU/ml,CV<6%。结论该免核酸提取HBV-DNA荧光定量PCR试剂扩增效率、线性关系和重现性良好,具有潜在的临床应用价值和发展前景。

基于免核酸提取可视化RT-LAMP快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

本文基于逆转录环介导恒温扩增(RT-LAMP)技术建立葫芦科作物中黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)免核酸提取的可视化快速检测方法。根据CGMMV全基因组序列,筛选保守区域并设计特异性RT-LAMP检测引物。通过荧光扩增方法(加SYTO-9)和可视化方法(加钙黄绿素),开展RT-LMAP特异性、灵敏度和重现性试验分析。结果表明,优化筛选的引物组可以特异性地检测CGMMV,检测灵敏度达到4.21×10^(3) fg/μL,组内和组间变异系数均小于5%,重现性好。对瓜类作物田间种苗、植株叶片及市售种子等103份样品进行检测及一致性分析,表明该方法与基于RNA提取RT-LAMP、荧光RT-qPCR及免疫测试条检测结果之间的Kappa值均为1.0(1~1,95%置信区间),具有很好的一致性。基于免核酸提取的可视化RT-LAMP快检方法成为适合现场快速检测的理想选择,对于CGMMV危害葫芦科作物的田间监测以及疫情防控具有广泛的推广应用前景。

免核酸提取法与煮沸裂解法对HBV-DNA提取后荧光定量PCR检测结果的影响比较

目的:探究在检测乙型肝炎时,比较免核酸提取法和煮沸裂解法对乙型肝炎病毒DNA提取及使用荧光定量PCR检测结果的影响。方法:选取2015年6月至2017年3月在乙肝防治示范区医院就诊的156例慢性乙型肝炎患者,随机分为对照组(煮沸裂解法)和观察组(免核酸提取法),检测两组的检出率,并分析重复性与相关性。结果:通过对比,观察组的检出率(89.74%,70/78)与对照组(71.79%,56/78)相较,显著升高,差异明显(P<0.05);比较两组的相关性,相关性良好(线性相关,r=0.992);比较两组的重复性,观察组的重复性更好。结论:针对乙型肝炎病毒核酸的提取,免核酸提取法的检出率较高,准确性较高,重复性好,结果稳定,对乙型肝炎病毒的诊断和治疗有很高的临床价值。

三种免核酸提取PCR试剂盒检测乙肝患者血清HBV-DNA的临床对比研究

目的针对乙型肝炎病毒的检测,选取3种免核酸提取PCR试剂盒,研究其临床应用价值。方法采集24例乙型肝炎患者血清以及24例阴性血清标本,分别用3种免核酸提取PCR试剂盒进行检测,对比这3种试剂盒的检测灵敏度以及特异性,检测结果以荧光定量PCR结果为标准。结果针对24例乙型肝炎患者血清检测,结果发现,3种免核酸提取试剂盒中,购自C公司的Mighty Amp试剂盒阳性检出率最高,达到95.83%;3种试剂盒检测下的阳性结果经RT-PCR检测,均为阳性。另外,检测24例阴性参比血清,结果显示均为阴性。3种试剂盒阳性检出率相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论免核酸提取PCR试剂盒应用于乙型肝炎病毒的检测,方便快捷、特异性强、灵敏度高。

辣椒不同工艺提取物的镇痛作用比较

目的比较丙酮温浸提取和免加热提取工艺得到的辣椒提取物的镇痛作用。方法阿司匹林为阳性对照药,采用小鼠热板法疼痛模型,观察不同提取工艺得到的辣椒提取物灌胃给予小鼠后对小鼠痛阈的影响。结果丙酮温浸组480mg/kg、960mg/kg、1280mg/kg组,免加热酯提取物960mg/kg、1920mg/kg组,免加热水提取物960mg/kg、1920mg/kg、3840mg/kg组均明显延长疼痛反应潜伏期。不同工艺提取物中960mg/kg剂量组显效的时间有差异。结论免加热提取法得到的酯溶性、水溶性辣椒提取物以及丙酮温浸法得到的辣椒提取物均有镇痛作用,但相同剂量下三种提取物的镇痛效果明显不同。

植物中芳香成分的微波-动态气流提取设备的研制

将微波原理与植物中挥发性成分的提取工艺和技术相结合,研制了1台新型设备,用于微波-动态气流提取植物中芳香成分。设计过程考虑到:(1)免溶剂情况下,用较低密度的微波场照射,使植物细胞迅速破壁;(2)用带有出气孔的搅拌器,在搅拌的同时,通入动态气流,导出芳香成分;(3)采用软刮片贴壁搅拌,促进芳香成分气化并防止物料焦化。以新鲜大蒜精油的提取为例,对比该设备以微波-动态气流法在免溶剂条件下提取与通常的水蒸气蒸馏法提取,结果表明:前者的提取能耗、提取时间及萃取剂用量分别只占后者所需的9.3%、20%及42%,而两者的产出率相近(2.6‰与2.4‰)。该设备操作简便、特别适用于从含水量高的新鲜植物中提取芳香成分。