CA50时间分辨荧光免疫分析的方法学及临床应用评价

目的 建立CA50的时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）法，并对CA50 TRFIA方法学及临床应用价值进行评价。方法 用稀土离子Eu^3＋标记CA50单克隆抗体，以96孔微孔板为载体，固相夹心法建立CA50 TRFIA；通过对67例消化道恶性肿瘤和良性病变患者以及213例健康人血清CA50的测定，应用临床诊断试验评价方法，系统地对CA50 TRFIA方法学和临床应用价值进行评价。结果 CA50 TRFIA在精密度、重复性、线性范围和回收率等方面均获得较为满意的结果；该方法对消化道恶性肿瘤的灵敏度为35．00％，特异度为95．77％，准确度为90．56％，阳性预示值为43．75％，阴性预示值为94．00％。结论 CA50 TRFIA是一种新的免疫标记技术，该方法对消化道肿瘤具有较高的特异度和准确度，是一种较为可靠和特异的方法，可用于肿瘤普查、诊断、预后和转归，评价疗效和高危人群随访观察，且无放射性污染，更适应于临床的应用，值得推广应用。

脂质体包裹的促甲状腺激素受体胞外段基因重组质粒免疫法构建小鼠甲状腺相关眼病动物模型的可行性

背景甲状腺相关眼病（TAO）是眼科临床常见的难治性疾病，发病率在眼眶疾病中居首位。目前对于TAO的研究缺乏可复制的动物模型，在疾病早期阶段难以获得眼眶组织，具体病因及确切的发病机制仍未得到阐明。要详细了解TAO的发病机制，探寻有效防治措施，关键在于建立适当的动物模型。目的采用脂质体包裹的促甲状腺激素受体（TSHR）胞外段基因重组质粒免疫同系雌性BALB／c小鼠，探讨该方法建立TAO动物模型的可行性。方法按照计算机随机分组方法将32只同系6～8周龄雌性BALB／c小鼠随机分为空白对照组、空质粒注射组、脂质体注射组和重组质粒注射组。分别于0、3、6周免疫各组小鼠，重组质粒注射组小鼠经双胫前肌和腹腔内分别注射阳离子脂质体包裹的pcDNA3．1＋／hTSHR28930txg和40μg；脂质体注射组小鼠分别经双胫前肌和腹腔内分别注射未包裹重组质粒的阳离子脂质体30μg和40μg；空质粒注射组小鼠分别经双胫前肌和腹腔内分别注射pcDNA3．1＋空质粒30μg和40μg；空白对照组小鼠未行任何干预。分别于初次免疫前及初次免疫后1、2、3、4个月测量各组小鼠的体质量，观察小鼠外眼表现。于初次免疫后17周末处死小鼠，取甲状腺及眼眶组织进行组织病理学观察；收集各组小鼠心脏血0．6～0．8ml，采用ELISA法测定小鼠血清总甲状腺素4（TT4）和促甲状腺激素（TSH）的质量浓度。结果重组质粒注射组6只小鼠12只眼出现眼球突出、眼睑肿胀和角膜溃疡。空白对照组、脂质体注射组、空质粒注射组小鼠随着时间的延长体质量逐渐增加，而重组质粒注射组小鼠体质量则逐渐下降，总体比较差异有统计学意义（F时间=3．838，P=0．023），不同组间小鼠体质量总体比较差异有统计学意义（F分组=3．425，P=0．028），其中注射后2、3、4个月重组质粒注射组小鼠体质量明显低于空白对照组、空质粒注射组和脂质体注射组，差异均有统计学意义（均P〈O．05）。空白对照组、脂质体注射组、空质粒注射组和重组质粒注射组小鼠血清TT4质量浓度分别为（7．75±1．00）、（7．96±0．76）、（6．76±1．10）和（4．43±2．88）μg／dl，TSH质量浓度分别为（6．36±2．58）、（4．83±3．96）、（6．63±1．71）和（1．60±1．76）ng／ml，总体比较差异均有统计学意义（F=7．150，P〈0．001；F=5．521，P〈O．01），其中重组质粒注射组小鼠血清中TT4和TSH质量浓度均明显低于空白对照组、脂质体注射组、空质粒注射组，差异均有统计学意义（均P〈O．05）。组织病理学检查显示，6只重组质粒注射组小鼠甲状腺出现淋巴细胞浸润，15只眼小鼠眼眶组织出现眼眶内脂肪组织增生、淋巴细胞及肥大细胞浸润、透明质酸沉积以及眼外肌肌纤维肿胀、变性和断裂，并伴有炎性细胞浸润。结论采用脂质体包裹的TSHR胞外段基因重组质粒免疫同系雌性BALB／c小鼠建立TAO动物模型是一种可行、有效的方法，该模型与人TAO的病理组织学特征相似，成模率高。

晚期非小细胞肺癌患者DC-CIK治疗前的免疫状态与预后的关系

目的探讨晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞(dendritic cellcytokine induced killers,DC-CIK)治疗前外周血CD4+CD25+CD127-调节性T细胞(regulatory T cells,TRegs)、CD3+CD56+细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cells,CIKs)、CD4+/CD8+T细胞比值与预后的关系。方法采用流式细胞仪技术检测45例晚期NSCLC患者DC-CIK治疗前、后外周血CD4+CD25+CD127-TRegs、CD3+CD56+CIKs、CD4+和CD8+T细胞,并与患者临床特征进行相关分析;采用Cox回归模型分析治疗前CD4+CD25+CD127-TRegs、CD3+CD56+CIKs、CD4+/CD8+T细胞比值对患者预后的影响。结果晚期NSCLC患者DC-CIK治疗前、后比较,治疗后患者外周血CD4+T细胞减少,CD8+T细胞增多,CD4+/CD8+T细胞比值下降,差异均有统计学意义(均P<0.05);原发病灶瘤体最长直径越大,患者治疗前外周血TRegs越多,CIKs越少(均P<0.05);生存分析显示,治疗前TRegs越多,患者预后越差,生存期越短,且TRegs>7×109/L影响患者的生存(P<0.05)。结论晚期NSCLC患者外周血TRegs是判断预后的独立预测指标。

游离型PSA时间分辨荧光免疫分析法的建立

目的：建立血清游离型前列腺特异性抗原（F-PSA）的时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA）.方法：以抗PSA单克隆抗体101#包被96孔微孔板,用Eu3＋标记抗 F-PSA单克隆抗体201#,夹心法建立F-PSA的时间分辨荧光免疫分析法.标准曲线由TRFIA检测仪自带的Log-Log_B函数处理.结果：F -PSA批内和批间CV分别为1.12%和5.36%,效点均值ED20、ED50和ED80分别为2.866、12.01和38.13 ng/mL.可测范围为0.02～78 ng/mL.回收率为103.58%.试剂经冻干后-30 ℃保存6个月后免疫反应参数基本未改变.结论：建立的F-PSA TRFIA有良好的健全性,定量分析效果较好.

不同检测方法对低水平乙型肝炎表面抗原的测定及其临床评估

目的:探讨免疫发光、电化学免疫发光、ELISA三种方法对检测低水平乙型肝炎表面抗原的价值。方法:以免疫发光测试系统Architect i2000检测结果为参考,把70例<50 IU/ml的标本分成三个级别:<1 ng/ml、1~5 ng/ml、≥5 ng/ml三组,用电化学免疫发光MODULAR〈E〉170、ELISA检测,对三种方法测定的结果进行比较。结果:免疫发光Architect i2000与电化学免疫发光MODULAR〈E〉170比较,<1 ng/ml组符合率79.2%(P(0.05),1~5 ng/ml组符合率100%,≥5ng/ml组符合率100%。免疫发光Architect i2000与ELISA比较,<1 ng/ml组符合率0%,1~5 ng/ml组符合率45.5%(P<0.05),≥5 ng/ml组符合率100%。结论:免疫发光Architect i2000与电化学免疫发光MODULAR〈E〉170对低水平HBsAg的检测效能基本一致,结果相对可靠,常规ELISA法对≥5 ng/ml的HBsAg检测结果可靠,但对低水平HBsAg漏检率高,特别是<1 ng/ml HBsAg很难检出。

FasL和B7-1联合基因修饰的肺癌细胞诱导抗肺癌主动免疫

目的 :探讨FasL和B7 1联合基因转移是否具有协同的抗肿瘤效应。方法 :采用重组腺病毒载体将FasL和B7 1基因导入人肺癌细胞A 5 49,G418阳性克隆筛选 ,流式细胞分析 ,RT PCR显示FasL和B7 1的表达 ,并且通过Hoechst3 3 3 42染色和DNA片段分析检测肺癌细胞的凋亡 ;将携带FasL和B7 1基因的肺癌细胞 (命名为A 5 49/FB 11)接种于C5 7BL/ 6小鼠背部皮下 ,观测其致瘤性能 ;A 5 49/FB 11致敏的小鼠对野生型瘤细胞是否具有免疫保护作用 ;用A 5 49和A 5 49/FB 11细胞分别经腹腔免疫小鼠 ,得到腹腔浸润淋巴细胞及致敏脾细胞 ,MTT法检测其体外杀伤实验。结果 :FasL和B7 1基因在肺癌细胞中获得高表达并可诱导肺癌细胞的凋亡 ,双基因转染的肺癌细胞的致瘤性明显下降 ;A 5 49/FB 11诱导的CTL (cyto toxicTlymphocyte)对A 5 49的杀伤活性显著高于野生型A 5 49诱导的CTL对相同靶细胞的杀伤活性 ,P <0 0 5 ;A 5 49/FB 11诱导的CTL对A 5 49/FB 11的杀伤率显著高于对野生型A 5 49的杀伤率 ,P <0 0 5。结论 :FasL促进肺癌细胞凋亡 ,B7 1促进抗肺癌CTL的增殖、活化 ,在效应阶段两基因发挥着重要的协同作用。

酶联免疫吸附试验、胶体金法和化学发光法检测孕妇人巨细胞病毒感染的对比研究

目的:分析酶联免疫吸附试验(ELISA)、胶体金法和化学发光法检测孕妇人巨细胞病毒(HCMV)特异性抗体IgG、IgM的价值。方法:纳入862例孕妇,分别采用ELISA法、胶体金法和化学发光法检测IgG及IgM抗体水平,并计算3种方法诊断孕妇HCMV感染的灵敏度、特异度和阳性预测值,对3组结果进行比较。结果:ELISA法、胶体金法及化学发光法检测得HCMV IgG抗体的阳性率分别为90.37%、46.06%、91.88%,ELISA法及化学发光法的阳性率高于胶体金法(P<0.01);ELISA法、胶体金法及化学发光法检测得HCMV IgM抗体的阳性率分别为69.72%、49.54%、91.07%,化学发光法及ELISA法的阳性率显著高于胶体金法(P<0.01),化学发光法的阳性率高于ELISA法(P<0.05)。3种方法检测HCMV感染的灵敏度、特异度及阳性预测值差异均有统计学意义(P<0.05),其中化学发光法的灵敏度、特异度及阳性预测值均显著高于ELISA法和胶体金法。结论:化学发光法检测孕妇HCMV IgG、IgM抗体水平阳性检出率高,诊断灵敏度、特异度及阳性预测值高,可以为临床诊断及治疗提供可靠的依据。

电化学发光免疫法和时间分辨荧光免疫法检测血清TSH的比较

【目的】比较电化学发光免疫法和时间分辨荧光免疫法两者在检测血清TSH上的优势。【方法】利用两法分别检测血清促甲状腺激素(TSH)并进行精密度、准确度、病人结果可报告范围,分析灵敏度、特异性、回收率等几方面的比较。【结果】两法检测血清TSH的敏感度分别为0.05mIu/L和0.100mIu/L,病人可报告范围分别为0.05～100.00mIu/L和0.10～80.00mIu/L,电化学发光免疫法精密度和准确度优于时间分辨荧光免疫法。【结论】电化学发光免疫法检测血清TSH在精密度、敏感度、稳定性,病人可报告范围等方面更优于时间分辨荧光免疫法。

阿罗格脱敏治疗支气管哮喘的疗效观察

目的:探讨阿罗格变应原疫苗脱敏治疗支气管哮喘的疗效及安全性。方法:根据点刺试验情况,采用阿罗格变应原疫苗对相应敏感的支气管哮喘患者进行脱敏治疗,观察治疗前后的肺功能变化及治疗期间的不良反应。结果:阿罗格脱敏治疗后,患者的FEV1、FVC和PEFR均高于治疗前及对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。阿罗格脱敏治疗的局部及全身性不良反应发生率极低且反应均较轻。结论:阿罗格脱敏治疗支气管哮喘是一种安全可行的方法,具有疗效显著,耐受性好等特点。

顺铂对豚鼠耳蜗毛细胞损害的形态及机理研究

目的观察顺铂对豚鼠耳蜗毛细胞的损害 ,并阐述一氧化氮 (nitricoxide ,NO)在其耳毒性机制中的作用。方法将 2 0只豚鼠随机分成两组 ,试验组腹腔注射顺铂 0 .5ml,对照组给予同等量的生理盐水 ,5天后做听性脑干反应 (auditorybrainstemresponse ,ABR)测听 ,此后处死动物 ,取出耳蜗 ,应用免疫组化技术、光镜及扫描电镜观察耳蜗毛细胞的损害。结果试验组动物测试ABR听阈明显提高 ,光镜下见耳蜗毛细胞明显变性 ,诱导型一氧化氮合酶阳性染色 ,电镜下见毛细胞的纤毛散乱、倒伏甚至散失。结论顺铂对豚鼠耳蜗毛细胞有明确的损害作用 ,而NO在其耳毒性机制中发挥着重要作用。

神经生长因子及其两种受体与子宫颈原位癌的相关性研究

目的 探讨神经生长因子 (NGF)及两种受体 (p75和 Trk A)与子宫颈原位癌的关系。方法 采用免疫组化 S- P法和原位杂交法检测石蜡包埋子宫颈组织中 NGF、p75和 Trk A的蛋白和 m RNA的表达 ,包括研究组子宫颈鳞状上皮原位癌 (SCIS) 30例 ,对照组正常上皮组织 (NSE) 13例 ,中、重度不典型增生 (DSEH) 13例和浸润癌(ISEC) 14例。结果 NGF及其两种受体蛋白随着子宫颈病变进展其共表达逐渐减少 ,在 ISEC组其共同阳性表达率下降为 14 .3% ,与 NSE、DSEH、SCIS各组相比差异均有显著性 (P<0 .0 5 ) ;NGF与 p75蛋白以及 Trk A与 p75蛋白的共同阳性表达率在 ISEC组中分别下降为 4 2 .9%和 14 .3% ,SCIS组与 ISEC组相比差异有显著性 (P<0 .0 5 )。NGF、p75和 Trk A的 m RNA在各组组织中的表达率差异均无显著性。结论 子宫颈原位癌是癌变过程中一个相对特殊阶段的癌。 NGF及其受体的表达缺失程度、NGF- p75和 p75 - Trk

梅毒螺旋体重组蛋白rTpN17或rTpN47为抗原的ELISA与TRUST和TPHA血清学检测效果的比较

目的:克隆并构建梅毒螺旋体tpn17、tpn47基因原核表达系统,建立基于rTpN17、rTpN47的ELISAs,并对其用于梅毒血清学诊断的敏感性和特异性进行评价。方法:采用PCR扩增tpn17和tpn47基因并构建tpn17和tpn47基因原核表达系统。采用SDS-PAGE检测目的重组蛋白rTpN17和rTpN47表达情况,Ni-NTA亲和层析法提纯rTpN17和rTpN47,Western blot检测rTpN17和rTpN47免疫反应性。分别以rTpN17和rTpN47为包被抗原,建立检测血清标本中梅毒抗体的ELISAs(rTpN17-ELISA和rTpN47-ELISA),检测200例健康人、25例类风湿关节炎(RA)和17例系统性红斑狼疮(SLE)患者血清样本,并与甲苯胺红不加热血清试验(TRUST)和梅毒螺旋体间接血凝试验(TPHA)检测效果进行比较。结果:克隆的tpn17和tpn47基因与GenBank中相关序列相似性为100%。rTpN17和rTpN47表达量分别为细菌总蛋白的37.2%和26.8%。提纯后的rTpN17和rTpN47能与梅毒抗体阳性血清发生明显的结合反应。TPHA检测阳性率最高(99.1%,P<0.001),rTpN17-ELISA和rTpN47-ELISA检测阳性率相近(85.3%和84.3%,P=0.427),TRUST检测阳性率低于rTpN17-ELISA(P=0.001),但与rTpN47-ELISA相近(P=0.014)。所有健康人血清、RA和SLE患者血清标本的rTpN17-ELISA、rTpN47-ELISA和TPHA检测结果均为阴性,但有7.1%(3/42)RA和SLE患者血清标本TRUST检测结果阳性。结论:以rTpN17和rTpN47为抗原的ELISAs可作为快速、简便、敏感性和特异性较高的梅毒血清学筛查方法,而且rTpN17和rTpN47仍保持原有免疫反应特异性。

核心蛋白聚糖mRNA及其蛋白在结直肠癌中的表达

目的:研究核心蛋白聚糖(DCN)mRNA及其蛋白在结直肠癌中的表达。方法:采用原位杂交及免疫组织化学方法检测DCN mRNA及其蛋白在30例结直肠癌及20例相对正常大肠组织中的表达。结果:30例结直肠癌患者,DCN mRNA表达阳性率为66.67%(20/30);20例相对正常大肠腺细胞中,DCN mRNA表达阳性率为85.00%(17/20),两者比较差异无显著性(P>0.05)。在30例结直肠癌癌细胞及20例相对正常大肠腺细胞内未发现DCN蛋白表达。结论:DCN mRNA在结直肠癌癌细胞及相对正常大肠腺细胞中均有表达。

抗心磷脂抗体及抗核抗体与反复自然流产的关系

目的 :探讨抗心磷脂抗体 (ACA)及抗核抗体 (ANA)与反复自然流产 (RSA)的关系。方法 :采用 EL ISA法检测 98例 RSA患者及 4 0例正常妇女血清 ACA和 ANA。结果 :RSA组 ACA阳性率为 32 .7% ,明显高于对照组 (5 .0 % ,P<0 .0 1) ;早期与晚期 RSA两组间比较 ,ACA阳性率差异无显著性 (P>0 .0 5 ) ,RSA2次与 RSA≥ 3次两组间比较 ,ACA阳性率差异无显著性 (P>0 .0 5 ) ;ACA Ig M、Ig G、Ig A中以 Ig G、Ig M检出率较高 ,ACA Ig M、Ig G、Ig A同时阳性者仅 4例 ;阳性和强阳性 ACA占 37.5 % (11/32 ) ,其余均为 ACA弱阳性 ;RSA患者 ANA阳性率为 17.3% ,较对照组 (2 .5 % )明显增高 (P<0 .0 5 )。结论 :ACA及 ANA与 RSA有关 ,可作为 RSA免疫因素的辅助诊断指标。

大肠癌组织中MMP-3的表达及其临床意义

目的:探讨基质金属蛋白酶3(matrixmetalloproteinases3,MMP3)在大肠腺瘤及大肠癌组织中的表达及其与临床各病理参数之间的关系。方法:应用免疫组织化学方法检测MMP3在20例大肠腺瘤和60例大肠癌组织中的表达。结果:MMP3在20例大肠腺瘤及60例大肠癌组织中,阳性表达率分别为10.0%(2/20)和41.7%(25/60),组间差异有统计学意义,P=0.031;在大肠腺癌组织中,MMP3的阳性表达与淋巴结转移呈正相关,P=0.008,与患者5年生存率呈负相关,P=0.003。结论:MMP3的上调表达可能参与了大肠癌的发生与发展,对临床上判断预后具有较大的意义。

OPG及RANKL在儿童先天性胫骨假关节病变骨与骨膜中的表达研究

目的通过免疫组化检测儿童先天性胫骨假关节和胫骨骨折患儿骨与骨膜标本中骨保护素(OPG)、核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的表达水平,明确OPG及RANKL在儿童先天性胫骨假关节骨与骨膜中的表达差异,并分析其可能的意义。方法选取2016年1月至2018年2月由湖南省儿童医院收治的17例儿童先天性胫骨假关节(CPT组)和10例胫骨骨折患儿(对照组)作为研究对象。采用SABC法检测先天性胫骨假关节患儿和对照组骨及骨膜中OPG、RANKL的表达,并分析其差异性。结果本研究发现OPG在CPT组(0.08±0.03)骨膜中的表达量低于对照组(0.11±0.02),差异有统计学意义(t=2.805,P<0.01);RANKL在CPT组(0.24±0.07)骨膜中的表达量高于对照组(0.15±0.04),差异有统计学意义(t=3.707,P<0.01);CPT组(2.37±0.29)病变胫骨骨膜中RANKL/OPG比值高于对照组(1.09±0.16),差异有统计学意义(t=12.792,P<0.01)。OPG在CPT组(0.17±0.09)胫骨中的表达量低于对照组(0.26±0.05),差异有统计学意义(t=2.895,P<0.01);RANKL在CPT组胫骨中的表达量(0.68±0.13)高于对照组(0.33±0.09),差异有统计学意义(t=7.494,P<0.01);RANKL/OPG比值在CPT组(5.12±0.60)胫骨中的表达量高于对照组(1.12±0.17),差异有统计学意义(t=25.784,P<0.05)。结论RANKL/OPG失衡可能是儿童先天性胫骨假关节出现胫骨不愈合和骨吸收的原因之一。

乳头隐匿性分泌液中CEA的检测在乳腺肿瘤鉴别诊断中的意义

目的分析检测乳头隐匿性分泌液中CEA的表达及其在乳腺肿瘤鉴别诊断中的意义。方法对34例乳腺癌患者,26例乳腺良性疾病患者作乳头分泌液CEA检测;将硝酸纤维膜贴附于乳头上24小时,取下后低温保存,使用免疫组化方法对吸附于膜片上的CEA进行检测。结果34例乳腺癌患者中12例膜片中出现CEA染色,而良性疾病患者26例中仅1例。两组差异有显著性(P<0.01)。结论硝酸纤维膜可吸附乳头分泌液中的微量抗原,对其中CEA的检测有可能作为一种乳腺良、恶性肿瘤鉴别诊断的辅助方法。

大鼠附睾9型水通道表达

目的 :观察大鼠附睾 9型水通道 (aquaporin9,AQP9)的表达。方法 :取 12周龄大鼠的附睾头部和尾部提取总 RNA和总蛋白进行 AQP9Northern blotting分析和 Western blotting分析。结果 :12周龄大鼠附睾存在 AQP9的表达 ,且附睾头部表达强于尾部。结论 :12周龄大鼠附睾头部 AQP9表达强于尾部 ,反映附睾不同部位对水的重吸收功能的差异。

食管鳞癌组织垂体瘤转化基因表达及其临床意义的研究

目的:探讨食管鳞癌组织中垂体瘤转化基因(PTTG)mRNA及其蛋白的表达及与肿瘤临床病理特征的关系。方法:采用RT-PCR技术检测30例食管鳞癌及相应的30例癌旁组织中PTTGmRNA的表达,同时采用免疫组织化学SP法检测标本中PTTG蛋白的表达。结果:在食管鳞癌组织中PTTGmRNA的阳性表达率(93.3%)及平均表达水平(0.69±0.06)显著高于相应的癌旁正常组织(70.0%和0.32±0.06),两组比较差异有统计学意义,P<0.01。PTTG蛋白在食管鳞癌组织中的阳性表达(83.3%,25/30)明显高于在癌旁组织中的阳性表达(20.0%,6/30),P<0.01;并与淋巴结转移、TNM分期和分化程度有关。结论:PTTG基因异常表达可对食管鳞癌的发生和发展起重要作用,可能为食管鳞癌的早期诊断和基因治疗提供新的靶点。