鸡新城疫病毒的分离鉴定与交叉免疫保护试验

为了评价疫苗免疫保护效果,进而筛选出最佳的免疫方案,将分离到的鸡新城疫病毒(Newcas-tle disease virus,NDV)流行毒株制备成灭活疫苗进行交叉免疫保护试验研究。把采集到的疑似发生新城疫的病鸡肺、气管环等组织经处理后接种10日龄SPF鸡胚进行病毒的分离和增殖,并用血清学和分子生物学方法进行毒株的鉴定;用分离到的NDV/Chicken/TC/1/2011毒株制成油乳剂灭活苗,与La Sota疫苗以不同的疫苗组合免疫SPF鸡,进行交叉免疫保护试验。结果显示,共分离到9株新城疫病毒,其F蛋白裂解位点的氨基酸均为112 R-R-Q-K-R-F117,表现为强毒株的分子特征,与致病指数结果一致。分离株灭活苗组和分离株灭活苗+La Sota弱毒苗对试验鸡的免疫保护力最高,其次是La Sota灭活苗+La Sota弱毒苗和LaSota灭活苗,La Sota弱毒苗对试验鸡的免疫保护力最低。NDV分离株与疫苗株La Sota存在明显抗原性差异,这将对新城疫疫苗的发展和疾病控制策略制定至关重要。

猪胸膜肺炎放线杆菌血清1和5型交叉免疫保护研究

目的探讨猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)不同血清型间交叉免疫保护的关系。方法以1型和5型APP参考菌株为实验对象,分别测定半数致死量(LD50),制备灭活细菌抗原和活菌抗原,免疫昆明小鼠,检测ELISA抗体水平及交叉免疫反应,并分别以10LD501型和5型APP菌进行攻击,观察小鼠保护力。结果1型和5型APP菌对小鼠的半数致死量分别为8.0×105.3和5.1×103.83CFU/LD50,死菌抗原和活菌抗原免疫小鼠均可产生高滴度抗体,且1型与5型间存在较强的交叉免疫反应。死菌抗原和活菌抗原免疫小鼠均能对本型APP菌攻击产生保护,保护率在80%以上。1型活菌免疫小鼠对5型菌攻击保护率为70%,5型活菌免疫小鼠对1型菌攻击保护率为90%,1型、5型死菌免疫小鼠对5型、1型菌交叉攻击均无保护作用。结论1型、5型APP活菌和死菌免疫小鼠均可对本型菌攻击产生保护,两型间存在较强的交叉免疫反应,但只有活菌免疫可以产生较好的交叉免疫保护,死菌免疫不能产生交叉免疫保护。

不同地理株伊氏锥虫灭活苗交叉免疫保护及免疫方法研究

用伊氏锥虫湖北株和广西株制备纯虫灭活苗和含血灭活苗，经小鼠１次、２次免疫，再经强毒伊氏锥虫湖北株、广西株和江苏株交叉攻击。结果湖北株纯虫灭活苗２次免疫鼠，对同株（湖北株）获得３０／３０保护，对异株即广西株和江苏株分别获０／１０和７／１０保护，该苗一次免疫鼠对同株仅获得５／１０保护。广西株纯虫灭活苗２次免疫鼠对同株（广西株）获２０／２０保护，对异株即湖北株和江苏株分别获得０／１０和４／１０保护。含血湖北株伊氏锥虫灭活苗对同株无保护作用，１３只免疫小鼠全部死亡，对江苏株（异株）为９／１０死亡。对照小鼠全部发病死亡。交叉免疫保护试验结果说明，纯虫灭活苗经两次免疫后对伺株虫体产生坚强的免疫保护作用，免疫保护率达１００％，不同地理株伊氏锥虫因抗原变异现象出现不同的免疫保护作用。两次免疫接种小鼠其免疫保护效果比一次免疫的效果好。疫苗中如含有大量非特异物质，虫苗的免疫保护作用将完全丧失。稳定试验表明，灭活苗在室温下保存１个月，在４℃、－２０℃下保存６个月，免疫效果不变。

钩端螺旋体外膜蛋白Loa22交叉免疫保护作用研究

研究钩端螺旋体外膜蛋白Loa22免疫血清对不同血清型钩端螺旋体的交叉免疫保护作用。表达纯化钩端螺旋体外膜蛋白Loa22。分别在0、2、4周用纯化蛋白Loa22、LipL32蛋白和PBS经豚鼠皮下多点进行免疫。以LipL32蛋白免疫组为阳性对照,PBS免疫组为阴性对照。末次免疫后2周,用培养7天的不同血清型钩体从腹腔注射攻击豚鼠。连续观察15天,观察各组豚鼠发病情况,并取各组豚鼠的肺、肝、肾作病理切片。分析钩端螺旋体外膜蛋白Loa22对豚鼠的交叉免疫保护作用。蛋白Loa22免疫组的豚鼠用不同血清型钩端螺旋体攻击,无发病现象。豚鼠健康情况良好。而PBS对照组豚鼠出现了厌食、懒动等现象,病理切片有明显的变化。钩端螺旋体外膜蛋白Loa22免疫血清对豚鼠具有交叉免疫保护作用,可以抵抗不同血清型钩体的攻击。

弓形虫和新孢子虫交叉反应抗原MIC7A对小鼠的免疫保护效力分析

弓形虫和新孢子虫是两种亲缘关系接近的顶复亚门原虫,二者之间存在一定程度的交叉免疫保护作用,这种作用可能是基于交叉反应抗原产生的。本研究旨在表达并鉴定弓形虫和新孢子虫的交叉反应抗原TgMIC17A,通过将其应用于小鼠的免疫保护试验,评估该抗原对弓形虫和新孢子虫感染产生的交叉免疫保护作用。对TgMIC17A进行基因克隆和原核表达,通过免疫印迹试验鉴定其反应原性和交叉反应性。重组蛋白免疫小鼠后测定血清特异性IgG抗体水平,评价其免疫原性。二免后,分别用1×10^(3)个弓形虫Pru速殖子、1.5×10^(7)个新孢子虫Nc1速殖子攻虫,对小鼠的体重变化、存活率进行监测,并在攻虫30 d后检测各组存活小鼠的脑荷虫量,评价TgMIC17A重组蛋白免疫小鼠后对弓形虫和新孢子虫的交叉免疫保护效果。结果显示,rTgMIC17A可以被弓形虫和新孢子虫的阳性血清识别,相较于未免疫组小鼠,免疫组小鼠体内可产生高水平特异性IgG抗体(P<0.01),且感染弓形虫或新孢子虫的脑荷虫量均显著降低(P<0.01)。本研究克隆并表达了TgMIC17A,鉴定其为新孢子虫和弓形虫的交叉反应抗原。该抗原可以刺激小鼠产生较好的体液免疫反应,并对弓形虫和新孢子虫的感染产生一定的交叉免疫保护作用,可以为弓形虫和新孢子虫共感染的防治,以及筛选具有交叉免疫保护力的重组疫苗提供可借鉴的研究资料。

鸡新城疫强度株的分离鉴定与免疫保护试验

从河北省保定地区发病鸡群中分离到2株有血凝性的分离物,其血凝作用可被NDV阳性血清所抑制,而不能被AIV(H9亚型)、EDS 76所抑制,表明2株分离物均为新城疫病毒。对2株NDV的毒力指数(MDT、IC-PI、IVPI)测定结果显示:MDT分别为40.8 h和53.7 h,ICPI分别为1.96和1.86,IVPI分别为2.89和2.72,表明2株NDV均为新城疫强毒株。采用分离的HBW株制成油乳剂灭活疫苗,分别以HBW株和LaSota株的灭活苗免疫试验鸡,进行疫苗免疫效果比较和交叉免疫保护试验。结果显示:(1)分离株灭活苗免疫组鸡各个时期所产生的HI抗体效价和Lasota灭活苗免疫组鸡的抗体效价相差不明显,2组的升降规律也基本一致。(2)分离株灭活苗免疫组鸡(HI抗体效价为6log2以上时)对相同剂量F48E9标准毒株和2个分离株的攻击可给予100%的保护,Lasota灭活苗免疫组鸡(HI抗体效价为6log2以上时)对相同剂量F48E9标准毒株和2个分离株的攻击不能给予100%的保护。说明NDV不同基因型毒株间的毒力和抗原性有一定的差异。

季节性流感疫苗免疫血清与H7N9禽流感病毒交叉反应

目的分析接种季节性流感疫苗人群是否具有对新发H7N9流感病毒具有交叉保护,并反向检测了雪貂产生H7N9抗血清与H1/H3/H5不同亚型流感病毒的免疫反应。方法利用血凝抑制试验和微量中和实验检测疫苗免疫后人群转阳血清对A/Anhui/1(H7N9)病毒中和作用及雪貂H7N9抗血清与A/California/07/2009(H1N1)、A/PR/8/34(H1N1)、A/Brisbane/59/2007(H1N1)、A/Brisbane/10/2007(H3N2)、A/Shenzhen/406H/2006(H5N1)和A/Vietnam/1203/2004(H5N1)等不同亚型病毒的中和作用。结果季节性流感疫苗受众者转阳血清与H7N9病毒反应HI及中和抗体反应均为阴性,雪貂H7N9抗血清与H1/H3/H5不同亚型流感病毒反应HI及中和抗体反应均为阴性。结论季节性流感疫苗接种人群不具有对新发H7N9流感病毒交叉保护,并且反向验证了H7N9病毒抗血清与H1/H3/H5亚型流感病毒亦无交叉免疫反应。

五步蛇毒类毒素免疫豚鼠对竹叶青及烙铁头蛇毒的交叉免疫试验

本文提示五步蛇毒类毒素免疫豚鼠可抵御18mg竹叶青蛇毒(6 MLD)或17.5mg烙铁头蛇毒(7MLD);免疫豚鼠血清每毫升可中和五步蛇毒(640μg相当小鼠8LD_(50))、竹叶青蛇毒160μg(4.6LD_(50))或烙铁头蛇毒140～180μg(3.2～4.1LD_(50))。本文提示五步蛇毒与竹叶青毒及烙铁头毒有共同抗原,可引起交叉免疫。

禽Ⅱ型副粘病毒各种禽源分离株的免疫原性

分别制备了源于鸡、鹅、鸽、鹌鹑、孔雀、画眉鸟、珍珠鸡的禽Ⅰ型副粘病毒（APMV-1）7个强毒分离毒株和商品弱毒疫苗株克隆30（C30）的灭活油乳剂苗，并用这8种灭活油乳剂苗和C30株的活疫苗分别在鸡、鹌鹑、鹅和鸽进行了免疫及交叉攻毒保护试验。免疫后（PI）分别测定试验禽血清的新城疫病毒（NDV）血凝抑制（HI）抗体的滴度，并于PI5周用强毒株进行攻毒。结果表明，鸽的HI抗体几何平均滴度（MAT）为9．00～10．0log2，鸡的为7．13～7．63log2，鹌鹑的为5．OO～5．13log2，鹅对灭活油乳剂苗的为5．63～6．38log2、而对C30株活疫苗的仅为3．38log2；除了C30株活疫苗免疫鹅提供的保护率比较低（20％）外，8种油乳剂苗都能对同源或者异源强毒株的攻毒提供比较高的保护率（66．75％～100％）。研究结果表明，经典疫苗株C30与近年来从各种不同禽类分离的致病性APMV-1野毒株之间、不同禽源分离株之间的抗原性，以及各种不同禽源分离株的之间的免疫原性差异均不大。

鱼类病原菌外膜蛋白及其免疫原性研究进展

细菌性疾病是水产养殖病害中最常见且危害甚为严重的一类疾病[1]。长期以来,一直用于鱼类细菌性疾病防治的西药类药物,由于会导致病原菌产生耐药性,在鱼体内产生药物残留危害人类健康等副作用而被限制使用[2]。因此,为了选择更加安全有效的防治方法,疫苗免疫逐步得到了人们的重视。

鸭疫里氏杆菌1型流行株的生物学特性及免疫原性

为研究当前鸭疫里氏杆菌1型(RA1)流行株的生物学特性及免疫原性,对从江苏省、山东省等不同地区规模鸭场采集的病料中分离的23个疑似RA的菌株纯化培养后进行细菌形态观察,并利用RA 16S rRNA基因特异性引物进行PCR鉴定及基因序列测定、生化试验、血清学分型鉴定、致病性分析、交叉攻毒保护试验。结果表明,16株分离株符合RA生物学特性,经PCR检测为RA阳性,与GenBank中RA相应基因同源性≥99%,其中11株血清学鉴定为RA1,占分离RA总数的68.7%;选取的5株RA1分离株中JP01、SD02、GY01等3株致病率和致死率达80%~100%;对3株RA1分离株进行免疫原性研究,结果显示JP01株对各毒株的交叉攻毒保护率可达100%,说明JP01株具有良好的免疫原性。

qseC及luxS双基因缺失对多杀性巴氏杆菌毒力及其交叉免疫保护性的影响

qseC和luxS是多杀性巴氏杆菌群体感应系统相关基因,为探讨其双缺失对多杀性巴氏杆菌致病性及交叉免疫保护的影响,本研究在前期构建的牛源A型多杀性巴氏杆菌CQ2株(PmCQ2)qseC基因缺失株(ΔqseC)的基础上进行了luxS基因缺失,构建了qseC及luxS双基因缺失株(ΔqseCΔluxS)。与野生型PmCQ2相比,该双基因缺失株在生物膜产生方面显著上升,而其荚膜生成量、血清敏感性及其毒力却显著下调,与qseC单基因缺失相比,双基因缺失在调节菌株部分生物学特性方面具有正向或负向叠加效应。疫苗交叉免疫保护性方面,与ΔqseC及野生型PmCQ2比较发现,双基因缺失株中luxS基因的缺失,减弱了部分qseC基因缺失所赋予菌株的交叉免疫保护效果,但却增强了菌株对牛源F型多杀性巴氏杆菌的交叉免疫保护作用,相比PmCQ2的无交叉免疫保护作用,qseC及luxS双基因缺失仍赋予了菌株很好的交叉免疫保护性。研究结果表明,群体感应基因qseC和luxS均可调控多杀性巴氏杆菌毒力及其交叉免疫保护性,该双基因缺失株可作为多杀性巴氏杆菌广谱型疫苗候选菌株。

人用甲型H1N1流感疫苗两种免疫方法动物免疫效果比较

目的:比较甲型H1N1流感疫苗0d一针免疫方法与0、21d二针免疫方法的免疫效果,同时观察季节性流感疫苗免疫后是否对甲型H1N1流感病毒具有交叉保护性。方法:用甲型H1N1流感疫苗分别按0d一针及0、21d二针2种免疫方法免疫BALB/c小鼠,首针免疫后14、21、28、35及42d眼眶采血分离血清,用血凝抑制(HI)法测定小鼠血清中甲型H1N1特异性抗体滴度,比较2种免疫方法的免疫效果。用季节性流感疫苗免疫小鼠,14、28d后采血分离血清,用甲型H1N1流感病毒特异性抗原采用HI法测定季节性流感疫苗抗血清是否能与甲型H1N1流感病毒特异性抗原进行非特异性结合。结果:二针免疫的方法在第21天加强免疫一次后,第28、35及42天时抗体滴度明显高于一针免疫方法的抗体滴度,且第42天时的抗体滴度约为一针免疫方法抗体滴度的4倍。用甲型H1N1流感病毒特异性抗原采用HI法测定季节性流感疫苗抗血清,未测出甲型H1N1交叉抗体。结论:0、21d二针免疫的方法在第28天后抗体滴度仍保持较高的水平,明显高于0d一针免疫的方法。季节性流感疫苗对甲型H1N1流感病毒无交叉免疫保护性。

致病性弧菌外膜蛋白及其免疫原性研究进展

弧菌为水产养殖环境中常见的条件致病菌,其暴发可导致养殖鱼虾贝类大量死亡。由于常用的化学药物防治方法存在耐药性、药物残留等问题使得弧菌病的防治面临新的挑战,因而如何获得安全有效的防治方法成为弧菌所致疾病研究的重点和难点。弧菌为革兰氏阴性菌,外膜是该类型菌细胞壁特有的结构,由蛋白、糖和脂质构成。其中外膜蛋白易为宿主免疫系统识别为异物,可以激发机体的体液免疫和细胞免疫,有可能作为弧菌疫苗的有效成分。对弧菌外膜蛋白免疫原性的研究进展作一综述,以期为弧菌病的防治在外膜蛋白水平上提供一种有效的解决途径。

巨型艾美耳球虫不同地理株交叉免疫保护性研究

筛选出与巨型艾美耳球虫(E.maxima)山东分离株(Msd)免疫原性差异大的早熟弱毒株,为研制具有良好免疫原性的高效多价鸡球虫疫苗提供理论依据。4日龄雏鸡免疫E.maxima山东分离早熟株(PMsd),免疫后7 d分别攻击E.maxima Msd、上海分离株(Msh)、北京分离株(Mbj)、山西分离株(Msx);14日龄雏鸡分别免疫E.maxima Mbj和Msx,免疫后7 d,Mbj免疫组分别攻击Msh和Msx,Msx免疫组分别攻击Msh和Mbj。免疫PMsd攻击Msd组鸡只达到良好的免疫保护,而免疫PMsd攻击Msx组鸡只除病变记分减少率(28.6%)高于Mbj组(23.8%)外,相对增重率(74.3%)、卵囊减少率(9.7%)、抗球虫指数(159.3)均低于其他各组;免疫Msx攻击Mbj和Msh组鸡只卵囊减少率、抗球虫指数、相对增重率均大于免疫Mbj攻击Msx和Msh组。4种不同地理株的巨型艾美耳球虫中,Msx与Msd的免疫原性差异最大,且较Mbj更为广谱。

M2e合成肽流感通用疫苗的研究

M2蛋白是甲型流感病毒的跨膜蛋白,其优点为不易变异,且N端24个氨基酸组成的胞外区(M2e)十分保守,适合作为通用流感疫苗的靶标。因此本实验将4个拷贝的M2e通过赖氨酸与通用Th细胞表位偶联获得M2e分支肽(M2e-MAP),添加弗氏佐剂制备成合成肽疫苗免疫小鼠,评价其免疫原性及异源攻毒保护效力。ELISA实验结果表明,该疫苗能刺激机体产生高水平的抗M2e特异性IgG抗体;细胞因子IL-4的检测进一步说明了其能诱导产生高的体液免疫应答水平,ELISPOT实验从IL-4和IFN-γ两个方面分别说明了该疫苗不仅可以诱导高的体液免疫应答,而且能刺激机体产生高水平的细胞免疫应答。对免疫小鼠攻H9N2,通过肺病毒分离滴定和肺组织病理切片等方法检测攻毒保护效果,结果均表明,M2e分支肽疫苗能对异源病毒的攻击产生较好的保护效力。上述结果为流感通用疫苗的研究提供了一种参考思路。

新型兔出血症病毒研究进展

兔出血症病毒属于杯状病毒科,兔病毒属的成员之一,能够引起家兔的典型兔病毒性出血症。2010年,研究学者首次在法国发现一例非典型兔出血症疫情,该病原与经典兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)基因序列差异明显,被称为RHDV2。研究发现该病原能够与经典RHDV发生部分交叉免疫保护,该病原能够感染幼龄家兔而且是唯一一个能够跨物种感染的兔病毒属成员。该病的迅速传播,严重威胁了以兔为中心的生态平衡。目前,该病毒尚未在国内有报道,但是不排除潜在的隐性感染。因此,对该病原的分析研究对于控制该病原的传播具有非常重大的意义。

肉鸭感染呼肠孤病毒与鸭疫里默氏菌病例的诊治体会

呼肠孤病毒(Reovirus)在家禽和其他禽类中非常普遍,容易分离到病毒及检测到血清抗体,但主要关注其对鸡的危害,因为从其他禽类分离的病毒大多是不致病的[1]。近年来,雏番鸭呼肠孤病毒感染导致严重发病、死亡的病例较多,也有文献报道肉雏鸭感染该病毒导致以脾脏坏死为主要病变特征的疾病。鸭疫里默氏菌的血清型复杂且缺乏交叉免疫保护,极易产生耐药性,在临床中存在严重的多重耐药性,难以筛选到有效抗菌药物。该细菌主要感染1~8周龄鸭,也可以感染鹅、鸡及野鸟,以纤维素性渗出性炎症为主要病变特征。