免疫亲和层析技术协同酶联免疫吸附法检测赭曲霉毒素A

利用免疫亲和层析技术(immunoaffinity chromatography,IAC)对样品中赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)进行捕获与浓缩,利用酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法对IAC捕获的目标物OTA进行测定。IAC与ELISA中的抗OTA单克隆抗体来自不同的克隆株,分属不同独特型,与OTA结合靶点的选择性存在差异,IAC与ELISA协同检测,可以有效过滤OTA结构类似物造成的干扰,提高免疫分析的特异性与灵敏度。该方法用于加标样品测定时,OTA的检出限为0.2 ng/g,定量限为0.4 ng/g,OTA的平均回收率为75.9%,与单一的ELISA法相比,该方法虽然回收率略低,但灵敏度可以显著提高,达到ELISA法的60倍。通过对49份样品的实际检测,该方法检出阳性样品与国标法的符合率达到100%,漏检率为0%,由此可见,该方法在准确性上表现出明显的优势。作为一种综合免疫分析技术,该方法不需要大型仪器设备,对操作环境没有严格要求,便于基层实验室对样品中OTA的分析。

基于纳米抗体的可再生免疫亲和柱结合高效液相色谱-串联质谱法测定玉米中的黄曲霉毒素B_(1)

目的研究黄曲霉毒素B_(1)(aflatoxinB_(1),AFB_(1))纳米抗体的表达产量的影响因素,开发具有可再生性的AFB_(1)免疫亲和柱,构建免疫亲和处理-高效液相色谱-串联质谱法(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS)测定玉米中AFB_(1)污染的分析方法。方法研究诱导温度、诱导时间和诱导剂浓度等对AFB_(1)纳米抗体表达量的影响,比对验证AFB_(1)纳米抗体可再生免疫亲和柱的耐受性和可再生使用次数。使用70%甲醇水溶液提取玉米样品中AFB_(1),提取液通过免疫亲和柱净化富集后进行HPLC-MS/MS检测,最后进行方法学验证并应用到实际样品检测。结果诱导AFB_(1)纳米抗体表达的最优条件分别为诱导温度16℃、诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷浓度0.5 mmol/L、诱导时间14 h,在最优条件下产量可达7.8 mg/L。AFB_(1)纳米抗体具有良好灵敏度、亲和性、特异性和甲醇耐受性,制备的AFB_(1)免疫亲和柱具有极好的可再生性,重复使用150次以上,对AFB_(1)回收率仍可达80%以上。同时,建立的免疫亲和处理-HPLC-MS/MS,在0.1~100.0μg/L范围内呈现良好的线性关系,检出限为0.014μg/L,定量限为0.047μg/L。在3个不同加标浓度下,回收率在92.0%~104.1%,变异系数小于3.9%。结论本研究开发的AFB_(1)纳米抗体免疫亲和柱表现出优秀的再生性和高特异性,节约了检测成本,建立的免疫亲和处理-HPLC-MS/MS检测方法操作简便、回收率高、结果准确,适用于实际玉米样品中AFB_(1)的含量测定。

基于壳聚糖微球的黄曲霉毒素B_(1)免疫亲和柱开发制备

目的基于壳聚糖微球制备用于黄曲霉毒素B_(1)检测前处理的免疫亲和柱。方法通过优化化学交联法的反应条件,包括壳聚糖分子量、氨基和醛基摩尔比、壳聚糖浓度和水相油相比,制备粒径大小合适且均一的壳聚糖微球,并以此为载体偶联黄曲霉毒素B_(1)的单克隆抗体制备免疫亲和柱。对亲和柱性能进行分析,使用阳性实际样品对亲和柱使用效果进行验证。结果在最佳制备条件下免疫亲和柱非特异性吸附率为5.26%,对单克隆抗体偶联率为90.90%,柱容量为2.69μg AFB_(1)/mL壳聚糖微球,检测回收率为92.12%~98.62%,相对标准偏差为0.61%~2.53%。用于实际样品检测回收率为87.90%~96.37%。结论本研究建立的免疫亲和柱制备过程简单、成本低,为黄曲霉毒素B_(1)痕量检测前处理提供一种新的方案。

免疫亲和层析高效液相色谱法对小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定

目的:建立测定小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的免疫亲和层析高效液相色谱法。方法:小麦粉经粉碎处理,用水提取,通过免疫亲和柱上样、净化和洗脱后,用高效液相色谱仪测定小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量。结果:在100~5 000 ng·mL^(-1),方法的线性关系良好,相关系数(R^(2))为0.999 8,检出限为48 ng·mL^(-1),回收率为90.1%~109.6%,相对标准偏差为1.49%~2.20%。结论:该方法操作步骤简便,特异性强,精密度高,可以作为大批量分析小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的处理方案。

超声萃取-免疫亲和柱净化-柱后光化学衍生高效液相色谱法同时测定蜂房药材中4种黄曲霉毒素

建立超声萃取-免疫亲和柱净化-柱后光化学衍生高效液相色谱同时测定蜂房药材中黄曲霉毒素B_(1)、黄曲霉毒素B_(2)、黄曲霉毒素G_(1)、黄曲霉毒素G_(2)含量的分析方法。样品经粉碎,过孔径为120μm筛后,采用70%甲醇溶液超声处理30 min,经免疫亲和柱净化、高效液相色谱分离、光化学柱后衍生,通过荧光检测器测定4种黄曲霉毒素的含量。黄曲霉毒素B_(1)的线性范围为0.0104~0.0520 ng,相关系数为0.9999;黄曲霉毒素B_(2)的线性范围为0.0038~0.0190 ng,相关系数为0.9998;黄曲霉毒素G_(1)的线性范围为0.0108~0.0540 ng,相关系数为0.9998;黄曲霉毒素G_(2)的线性范围为0.0038~0.0190 ng,相关系数为0.9998。4种黄曲霉毒素检出限分别为0.42、0.15、0.43、0.15μg/kg,测定结果的相对标准偏差不大于2.5%(n=6),样品加标回收率为92.9%~96.9%。该方法操作简便,灵敏度高,可用于蜂房中黄曲霉毒素含量的测定。

全自动免疫亲和柱净化-液相色谱串联质谱法同时测定饼粕类饲料原料中黄曲霉毒素

研究旨在建立全自动免疫亲和柱净化-液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)同时测定饼粕类饲料原料中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)含量的分析方法。通过比较不同提取条件和净化方式对黄曲霉毒素(AFs)检测结果的影响,确定较佳前处理方法。样品经40%乙腈提取、磷酸盐缓冲液稀释,采用自动免疫亲和柱净化,得到的样品溶液使用LC-MS/MS进行定量分析。基于上述方法对花生粕、豆粕、棉籽粕等饲料原料样品进行分析测定,结果表明:AFs在0.02~10.00 ng/mL范围内线性关系良好(R2≥0.9950),方法定量限为0.1μg/kg,平均回收率为82.2%~109.8%,RSD≤8.9%。该方法可批量自动化处理样品,提高工作效率,避免因人员操作导致的结果偏差,适合于饲料原料中多种AFs的精准测定。

免疫亲和柱-高效液相色谱法测定炒僵蚕中黄曲霉毒素

目的:采用免疫亲和柱-高效液相色谱法,对炒僵蚕饮片中的黄曲霉毒素B_(1)、B_(2)、G_(1)、G_(2)的残留量进行分析,旨在为炒僵蚕饮片质量标准的完善及其市场监管提供依据。方法:样品经过高速匀浆处理,经免疫亲和柱净化,采用高效液相色谱-柱后光化学衍生法测定。采用YMC-C_(18)(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,以甲醇-乙腈-水(32∶18∶50)为流动相,流速为1.0 mL·min^(-1),柱温为30℃,荧光检测器激发波长为360 nm,发射波长为450 nm,对7批炒僵蚕进行分析。结果:本研究采用的黄曲霉毒素B_(1)、B_(2)、G_(1)、G_(2)检测方法的线性关系、精密度、回收率良好,黄曲霉霉毒素G_(2)在多批样品检出,检出率为86%,有1批样品中黄曲霉霉毒素G_(1)含量较高,参照《中华人民共和国药典》(2020年版)黄曲霉毒素的限量标准,其黄曲霉毒素B_(2)、G_(1)和G_(2)总量超出限度规定。结论:本研究为首次采用免疫亲和柱-高效液相色谱法对炒僵蚕中黄曲霉素进行筛查,明确其存在安全风险,为炒僵蚕饮片中黄曲霉素的质控提供参考。

免疫亲和柱净化柱后光化学衍生高效液相色谱-荧光检测法同时测定制马肾中4种黄曲霉毒素

目的:建立免疫亲和柱净化柱后光化学衍生高效液相色谱-荧光检测法同时测定制马肾中黄曲霉毒素B_(1)、B_(2)、G_(1)、G_(2)的含量。方法:样品采用70%甲醇作为提取溶剂,经免疫亲和柱净化、高效液相色谱分离、光化学柱后衍生后,通过荧光检测器测定其中黄曲霉毒素的含量。结果:黄曲霉毒素B_(1)的线性范围为0.0104~0.0520 ng(r=0.9999)、黄曲霉毒素B_(2)的线性范围为0.0038~0.0190 ng(r=0.9998)、黄曲霉毒素G_(1)的线性范围为0.0108~0.0540 ng(r=0.9998)、黄曲霉毒素G_(2)的线性范围为0.0038~0.0190 ng(r=0.9998),线性关系良好,回收率在89.68%~101.44%之间,RSD≤3.5%。结论:该方法操作简便,灵敏度高、重复性好、结果准确,可用于制马肾中黄曲霉毒素的测定。

免疫亲和柱净化-高效液相色谱-串联质谱法测定母乳中的五氯苯酚

目的 构建复合免疫亲和柱净化,高效液相色谱-串联质谱法(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, HPLC-MS/MS)测定母乳中五氯苯酚残留的分析方法。方法 母乳样品用5%三乙胺乙腈水(7:3, V/V)提取,经免疫亲和柱特异性净化,以含0.05%氟化铵的甲醇和含0.05%氟化铵的超纯水为流动相,梯度洗脱, ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱分离,多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)模式检测,内标法定量分析。结果 五氯苯酚在0.02~20.00μg/L范围内呈现良好线性关系,相关系数达0.9998;在低、中、高3个不同加标浓度下,回收率在98.72%~106.95%之间,相对标准偏差小于6.09%,基质效应在94.45%~101.61%之间;方法的检出限为0.008μg/L,定量限为0.02μg/L。免疫亲和柱在该实验条件下至少可重复使用8次,降低87%以上的实验成本。结论 本方法基于免疫亲和柱对样品进行特异性净化,重现性好、准确度高,能够有效地分离和检测母乳中的五氯苯酚残留,可应用于母乳样品中五氯苯酚的定性定量检测。

免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱法同时测定水产品中8种霉菌毒素

目的:建立免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)同时测定水产品中8种霉菌毒素残留。方法:样品经乙腈水溶液(84:16,V:V)提取,多毒素免疫亲和柱净化。色谱柱为Agilent Proshell 120 SB·C_(18)(2.1 mm×100 mm,2.7μm),流动相为甲醇-5 mmol/L乙酸铵(含0.1%甲酸),梯度洗脱,流速为0.4 mL/min,柱温为40℃。采用电喷雾离子源正负离子同时扫描,多反应监测模式(MRM)进行质谱检测。结果:8种霉菌毒素在1.0~50.0 ng/mL范围内线性关系良好(R2>0.992),方法检出限在0.05~0.50μg/kg之间,定量限在0.17~1.65μg/kg之间;8种霉菌毒素加标回收率在75.6%~106.3%之间,相对标准偏差(RSD)为3.5%~9.3%。结论:该方法操作便捷、灵敏度高、准确可靠,能满足水产品中多种霉菌毒素残留快速检测需求。

免疫亲和柱结合超高效液相色谱-串联质谱法测定牛奶中的16种真菌毒素比较研究

目的通过比较5种不同商品化多合一免疫亲和柱的可检测目标毒素种类、回收率和稳定性,筛选性能最优的免疫亲和柱,建立免疫亲和前处理-超高效液相色谱-串联质谱法(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)测定牛奶中16种真菌毒的方法。方法牛奶样品分别经5种不同多毒素免疫亲和柱进行净化富集,用优化后的UPLC-MS/MS,在多反应监测模式下测定,同位素内标法定量,筛选覆盖牛奶中真菌毒素污染种类全面、回收率和稳定性最佳的免疫亲和柱,并进行免疫亲和柱性能评价和方法学验证,最终将方法应用于实际样品检测。结果免疫亲和柱A对牛奶中16种真菌毒素在低、中、高3个添加水平均具有良好的准确度和精密度,加标回收率在83.6%~126.8%之间,相对标准偏差为0.2%~18.4%。柱A内各毒素残留水平低于仪器检出限,柱容量在21.8~1317.5 ng之间。使用免疫亲和柱A富集净化样品,各目标毒素在线性范围内线性良好,相关系数均大于0.99,定量限为0.0010~0.2000ng/g。应用该方法对牛奶质控样品和实际样品进行检测,质控样品测定值均在标示范围内;实际样品中能够检出较低水平的黄曲霉毒素M_(1)、去环氧脱氧雪腐镰刀菌烯醇和伏马毒素B1。结论本研究验证筛选免疫亲和柱A应用于牛奶中16种真菌毒素的测定,其柱残留和柱容量能够满足牛奶中真菌毒素污染的测定;经方法学验证该方法准确可靠、灵敏度高,适用于牛奶中16种真菌毒素的日常检测。

全自动免疫磁珠法与免疫亲和柱法测定食用油中黄曲霉毒素B1的对比研究

采用全自动免疫磁珠净化与免疫亲和柱净化的前处理方法,结合超高效液相色谱法对不同食用油中黄曲霉毒素B1进行定量检测,并对两种前处理方法结果准确性、加标回收率、检测时间进行了对比。结果表明:全自动免疫磁珠净化与免疫亲和柱净化测定植物油标准物质,结果分别为15.59μg/kg和14.64μg/kg,均在标准值范围内;对不同种类食用油添加不同量的黄曲霉毒素B1标准物质,加标回收率均在88%~110%之间,相对标准偏差均在5%以内。采用Bland-Altman法对全自动免疫磁珠净化法和免疫亲和柱净化法进行差异分析,结果显示这两种净化方法的差异在可接受范围内。两种方法在净化和富集食用油中黄曲霉毒素B1均可满足实验要求,可以互相代替使用。通过检测时间对比,全自动免疫磁珠净化搭配使用真菌毒素全自动净化仪前处理方法可同时处理多个样品,平均一个样品净化时间小于3 min,处理时间短、实验效率更高。

免疫亲和柱净化-高效液相色谱技术检测食品中呕吐毒素的方法优化

目的:建立了基于优化的免疫亲和柱净化高效液相色谱技术的呕吐毒素检测方法。方法:优化的免疫亲和柱淋洗条件为将1.5 mL甲醇以0.5 mL·min^(-1)的流速分3次洗脱;优化的流动相为乙腈∶水=10∶90。结果:当呕吐毒素的载柱量在12.4~2504.0 ng时,柱回收率为82.6%~103.2%;在98.6~4930.0 ng·mL^(-1)时,呕吐毒素的校正曲线为y=0.06335x-0.81590,相关系数为0.999921。以优化后的实验方法分析小麦粉、醋和黄酒中的呕吐毒素,检出限为1.2~4.2μg·kg^(-1),定量限为4~14μg·kg^(-1);3种食品中呕吐毒素的3水平平均加标回收率为84.3%~104.7%,实验室内变异系数为0.3%~5.5%;对特性值为1303μg·kg^(-1),特性值区间为1043~1563μg·kg^(-1)的小麦粉质控样品中呕吐毒素的含量进行检测,结果为1320μg·kg^(-1)。结论:优化后的检测方法灵敏、准确,适用于食品中呕吐毒素的检测。

免疫亲和柱净化-HPLC柱后光化学衍生技术同时检测何首乌中的4种黄曲霉毒素

目的:建立免疫亲和柱净化-HPLC柱后光化学衍生法同时测定何首乌中4种黄曲霉毒素AflaG1、G2、B1、B2的含量。方法:样品经80%乙腈-水溶液提取后,采用含2%的吐温-20溶液稀释,月旭Aflatoxin(B1、B2、G1、G2)3 mL免疫亲和柱净化,Ultimate^(■)ODS-3(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱分离,以甲醇-乙腈-水为流动相进行等度洗脱,流速为1.0 mL/min,柱温为30℃,进样量为15μL,荧光检测器激发波长为360nm,发射波长为450nm的条件进行测定。结果:所发展的方法能够对生何首乌中黄曲霉毒素AflaB1、B2、G1、G2进行准确检测并定量,其线性范围相关系数均大于0.999,回收率为93.6%-101.8%,RSD小于10%。结论:所建立的方法能同时检测生何首乌中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2,通过在稀释和淋洗阶段加入吐温-20,有效去除杂质干扰,保证了免疫亲和柱的高回收率,使黄曲霉毒素的检测变得更高效准确。

免疫亲和注射器微萃取-高效液相色谱串联质谱法测定牛奶中玉米赤霉醇类化合物

将偶联玉米赤霉醇单克隆抗体的二氧化硅作为注射器微萃取的选择性吸附剂,建立了检测牛奶中6种玉米赤霉醇类化合物(ZERs)的免疫亲和注射器微萃取-高效液相色谱串联质谱法(IA-MEPS-LC-MS/MS)。将牛奶离心后,取中间夹层,使用免疫亲和注射器微萃取,超纯水洗涤,甲醇洗脱,洗脱液浓缩,流动相复溶后进行LC-MS/MS分析,采用C18色谱柱分离,水-乙腈为流动相梯度洗脱。使用基质匹配外标法定量,在工作液质量浓度0.1~100.0 ng/mL时6种ZERs线性良好,相关系数在0.9943~0.9962;在ZERs添加水平为1 ng/g时,平均回收率在50.40%~68.34%,日内RSD在4.87%~17.64%,日间RSD在7.04%~18.75%,本方法的检测限(LOD)为0.05 ng/g,定量限(LOQ)为0.2 ng/g。

全自动免疫磁珠法与免疫亲和柱法测定玉米粉中黄曲霉毒素B_(1)的对比研究

采用全自动免疫磁珠净化与免疫亲和柱净化的前处理方法,结合超高效液相色谱法对玉米粉中黄曲霉毒素B_(1)进行定量检测,并对两种前处理方法结果准确性、加标回收率、检测时间进行了对比。结果表明:对玉米粉中添加不同量的黄曲霉毒素B_(1)标准物质,使用免疫亲和柱净化法的加标回收率在80.96%~100.42%之间,平均回收率为88.04%,标准偏差为0.052,变异系数为5.90%;使用全自动免疫磁珠净化法的加标回收率在90.00%~108.33%之间,平均回收率为100.20%,标准偏差为0.046,变异系数为4.57%。采用配对t检验评价两种净化方式对检测结果一致性的影响,结果显示t值小于理论t_(0.05(32))的值,P>0.05,结果显示这两种净化方法的差异在可接受范围内。两种方法在净化玉米粉中黄曲霉毒素B_(1)中可以满足实验要求。全自动免疫磁珠净化搭配使用真菌毒素全自动净化仪前处理方法可同时处理多个样品,平均一个样品净化时间小于3 min,处理时间短、实验效率更高。

免疫亲和色谱与固相微萃取联用技术研究进展

固相微萃取(SMPE)技术是近年来快速发展的一项样品前处理技术,具有操作简便、经济、快速等优点。SMPE装置由手柄和萃取头两部分组成,萃取头上的涂层是最核心的部分,萃取原理是涂层与目标组分之间的吸附作用。由于涂层的种类有限和选择性差,使其不适合萃取复杂的基质。免疫亲和色谱(IAC)具有很强的特异性。将两项技术联用(IAC-SPME),抗体或者抗体相关材料作为SMPE的涂层,既有SMPE的优点,又弥补了SMPE在选择性方面的不足,用于直接从复杂基质中萃取分析物,IAC-SPME具有很好的应用前景,是目前研究的热点。论文就IAC-SPME联用技术的研究进展进行了综述。

免疫亲和色谱在动物源性食品兽药残留分析检测中的应用

1 概述 免疫亲和色谱（immnuoaffinity chromatography，IAC）也叫免疫亲和层析，是色谱技术的一种，是一种利用抗原抗体特异性可逆结合的技术。主要原理是根据抗原抗体的高选择性，从复杂的待测样品中提取目标化合物。具体过程是将抗体号隋性微珠共价结合，然后装柱，将抗原溶液过免疫亲和柱，而非目标化合物则沿柱流下，最后用洗脱缓冲液洗脱抗原，从而得到纯化的抗原，用适当的缓冲液和合适的保存方法，柱可以再生备用。

免疫亲和柱净化-亲水液相色谱串联质谱法测定牛奶中的三聚氰胺

本文建立了牛奶中三聚氰胺的免疫亲和柱净化-亲水液相色谱串联质谱分析方法,样品经简单稀释即可经免疫亲和柱净化后用液相色谱串联质谱法检测,内标法定量。相关系数r~2为0.999 74,线性范围为1~100 ng/m L,最低检出限(LOD)为0.000 10 mg/kg,定量限(LOQ)为0.000 24 mg/kg,回收率在97.4%~100.6%。结果表明,该方法具有较高的准确度和灵敏度,可满足实际样品检测需求。

免疫亲和柱HPLC快速测定蜂蜜中黄曲霉毒素B_1、B_2、G_1、G_2

本文采用单克隆抗体免疫亲和技术作为直接从样品中分离提纯黄曲霉毒素的特效手段 ,提取液挥干后 ,经衍生用HPLC荧光检测器测定。本法在样品添加 5μg/Kg黄曲霉毒素时进行十次测定 ,平均回收率分别为G173 .1 %、B191 .6%、G2 90 .2 %、B2 76.6% ,2 .5μg/Kg样品 1 0次测定的精密度分别为 :G11 1 84 %、B14 .2 8%、G2 1 3 .4 1 %、B2 1 4 .2 0 % ,本方法在 2 5pg～ 1 2 50pg范围内成线性 ,相关系数分别为 :G1:r=0 9990、B1:r=0 .9994、G2 :r=0 .9995、B2 :r=0 .9992。测定的最低检出量为 6.2 5pg。