弓形虫P30与佐剂CTA_2/B复合基因酵母表达载体的构建与生物信息学分析

目的构建含有弓形虫主要表面抗原P30与免疫佐剂CTA2/B复合基因的克隆载体及酵母表达载体,为进一步真核表达重组P30CTX蛋白奠定基础。方法PCR扩增P30CTX复合基因,产物回收后与pMD18T载体连接,转化大肠埃希菌DH5α,经氨苄抗性筛选及测序,建立克隆载体pMD18T P30CTX;克隆载体与表达载体双酶切后,回收1313bp的P30CTX基因,亚克隆入酵母表达载体,转化大肠埃希菌DH5α,筛选、测序后建立酵母表达载体PGAPZαA P30CTX。重组质粒分别以PCR、酶切及测序鉴定。使用生物信息软件分析P30CTX复合基因,预测编码蛋白结构。结果重组质粒经PCR可得1313bp的特异条带,EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切获得1313bp和3085bp的条带,与预期大小一致,测序结果证实为pGAP P30CTX基因,序列分析同源性为99.82%,P30CTX蛋白结构折叠无明显改变。结论成功构建了含有弓形虫主要表面抗原P30与免疫佐剂CTA2/B复合基因的克隆载体及酵母表达载体,预测毕赤酵母表达系统对P30CTX的抗原性不会产生影响。

甲型流感病毒M2e与CtB基因融合表达及其免疫特性初步研究

目的:构建真核表达重组质粒pcDNA 3.1a(+)-M2e/CtB,并初步研究其在NIH3T3细胞中的表达特性及免疫特性。方法:重叠PCR法扩增甲型流感病毒M2e基因和霍乱毒素CtB基因,将扩增得到的融合基因片段M2e-CtB定向克隆入真核表达载体pcDNA 3.1a(+)中,再转化E.coli JM109。将酶切鉴定、PCR扩增及序列鉴定正确的重组质粒命名为pcDNA3.1a(+)-M2e/CtB。用KEGEN TRANSⅢ阳离子聚合物将重组质粒pcDNA 3.1a(+)-M2e/CtB转染NIH3T3细胞,经免疫荧光、RT-PCR产物序列分析、Western blot检测其稳定表达产物。结果:重组质粒pcDNA 3.1a(+)-M2e/CtB含完整的M2e和CtB基因,与相对应基因的序列同源性分别为100%。重组质粒转染NIH3T3细胞后获得了有效表达,并且稳筛株细胞裂解物和上清均能用抗霍乱毒素抗体和抗流感病毒抗体检测到Mr约18000的蛋白条带。结论:成功构建了真核表达重组质粒pcDNA 3.1a(+)-M2e/CtB,初步证明其在体外表达的重组蛋白可分泌至胞外,且有M2e和CTB的双特异反应原性和免疫原性,为流感病毒核酸疫苗的进一步研究奠定了坚实基础。

鼻内给予卡介苗和重组霍乱毒素B能增强迟发型超敏反应[英]Maeyama J…／／J Microbiol Immunol．

重组霍乱毒素B亚单位(rCTB)是一种安全、有效的黏膜免疫佐剂。现有研究已经发展rCTB能抑制巨噬细胞分泌白细胞介素12(IL-12)，能激活Th-2细胞，使Th1／Th2平衡发生改变。目前尚无rCTB在细胞免疫中发挥相关作用的报道。作者在研究中发现鼻内给予重组乙型肝炎病毒表面抗原(rHBs)和rCTB免疫动物能够在动物体内同时产生IgG1和IgG2，提示rHBs和rCTB可能同时介导了Th1和Th2型反应。