弓形虫表面抗原IMP1的克隆原核表达及免疫学鉴定

目的克隆刚地弓形虫强毒RH株的表面抗原免疫作图蛋白1(Immune mapped protein-1,IMP1),并对其进行原核表达纯化、鉴定。方法采用逆转录法合成刚地弓形虫RH株的第一链c DNA,以此为模板,用PCR法扩增野生型IMP1基因的最大开放阅读框(ORF)序列,TA克隆测序鉴定后,插入原核表达载体p ET28b中,构建重组表达载体p ET28bIMP1,经双酶切和测序鉴定后转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达携带6×组氨酸标签的IMP1融合蛋白,改变温度、诱导时间和IPTG浓度以优化诱导表达条件并测定蛋白可溶性,通过镍离子螯合(Ni2+-NTA)亲和层析纯化IMP1融合蛋白,经Western blotting验证重组蛋白的特异性。结果在弓形虫RH株速殖子c DNA中成功调取了IMP1基因的ORF序列,并通过TA克隆和测序鉴定了IMP1基因的正确性,在此基础上构建了原核表达重组质粒p ET28b-IMP1,经双酶切和测序验证了重组载体的正确性,并通过条件筛选确定了IMP1的最佳表达条件为20℃下0.3 mmol/L IPTG诱导9 h。经镍柱亲和层析纯化后,IMP1全蛋白表达量和可溶性均较好,与镍柱填料有较高的亲和力,能实现高效纯化。经SDS-PAGE及Western blotting鉴定,IMP1具有良好的免疫活性。结论新型强毒弓形虫RH株的表面抗原IMP1可在大肠杆菌原核表达系统中高效表达,全长蛋白可溶,性状稳定。本研究为进一步制备IMP1多克隆抗体,进行后续的体内表达研究以及抗弓形虫感染亚单位疫苗的构建和IMP1晶体结构研究奠定了基础。