Connexin31相互作用蛋白筛选、证实与功能研究

筛选间隙连接蛋白31 (connexin31,Cx31) 相互作用蛋白并研究其在Cx31运输中的功能. 运用制备的抗Cx31多克隆抗体免疫沉淀,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,蛋白质条带回收,蛋白质胶块酶解,电喷雾-四极杆-飞行时间质谱分析,数据库扫描筛选可能相互作用蛋白,可能互作蛋白经免疫共沉淀、细胞免疫共定位等证实,确定actin为Cx31相互作用蛋白. 用药物处理细胞,抑制actin的功能,观察Cx31定位与间隙连接通道的通透性,确定actin在Cx31运输中的功能. 当药物抑制actin的功能时,Cx31很少能到达细胞膜上形成间隙连接通道,Cx31主要分布在胞质中;当药物抑制tublin的功能时,Cx31能到达细胞膜上形成间隙连接通道,细胞免疫荧光实验显示间隙连接斑有增多的现象,但染料转移实验表明细胞膜上间隙连接通道并没有增加. Actin在Cx31运输至细胞膜上形成间隙连接通道的过程中具有重要作用.

接头相关蛋白复合物3δ亚单位与BRD7的相互作用及其功能

目的:观察鼻咽癌密切相关基因BRD7与接头相关蛋白复合物3(AP3)δ亚单位的相互作用及功能。方法:首先构建AP3δ基因真核表达载体pCMV-HA-AP3δ和pEGFP-C2-AP3δ,然后采用GFP介导的细胞荧光实验考察非洲绿猴肾COS7细胞中AP3δ的亚细胞定位;通过细胞荧光共定位和免疫共沉淀实验分析BRD7蛋白与AP3δ蛋白的相互作用;最后采用荧光素酶实验观察BRD7与AP3δ对COS7细胞E2F3和CyclinD1活性的影响,半定量逆转录PCR观察转染pcDNA3.1-BRD7的HNE1细胞AP3δmRNA的表达,以转染空白载体的HNE1细胞为对照。结果:成功构建了pCMV-HA-AP3δ和pEGFP-C2-AP3δ;AP3δ蛋白主要定位于胞质;AP3δ蛋白与BRD7蛋白存在相互作用。AP3δ基因可协同BRD7下调细胞E2F3和CyclinD1启动子活性。在BRD7稳定转染的HNE1细胞中,AP3δmRNA的表达较转染空白载体组明显上调。结论:AP3δ蛋白与BRD7蛋白存在相互作用,在功能上相互促进。

人间隙连接蛋白31相互作用蛋白AnnexinⅡ的筛选与证实

间隙连接蛋白31(connexin31,Cx31)是间隙连接蛋白(connexin)家族的一员,目前对于Cx31的功能及其调节方式知之甚少.采用固相多肽合成的方法合成Cx31羧基端一个多肽片段(250￣266),经HPLC纯化后偶联到匙孔血蓝蛋白,免疫新西兰雄兔后采血检测、并纯化、经蛋白质印迹、细胞免疫荧光染色、免疫沉淀证实得到的抗体为特异性抗Cx31的抗体.运用制备的抗Cx31多克隆抗体免疫沉淀,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,蛋白质条带回收,蛋白质胶块酶解,Q-TOF质谱分析,数据库扫描筛选可能相互作用蛋白,运用抗体pull-down实验,筛选到可能相互作用蛋白annexinⅡ,经过免疫共沉淀、细胞免疫共定位等实验证实annexinⅡ与Cx31相互作用.

人mRNA输出因子Gle1与肽链释放因子相互作用上调HeLa细胞中蛋白质翻译终止活性

Gle1蛋白是一种mRNA核输出因子.最近有研究报道Gle1蛋白参与了酿酒酵母的蛋白质翻译终止过程.为了探讨Gle1蛋白是否在其它生物中也具有同样的功能,本研究利用酵母双杂交、免疫共沉淀以及免疫共定位等方法证实了人Gle1蛋白与参与蛋白质合成终止的两类肽链释放因子均能够相互作用,提示hGle1蛋白可能在人细胞中参与了蛋白质的翻译终止过程.进一步在HeLa细胞中利用双荧光素酶报告系统分析人Gle1蛋白对蛋白质翻译终止的影响,结果显示,hGle1的过表达能促进细胞内蛋白质的翻译终止.为进一步探讨hGle1蛋白在蛋白质合成中的作用机制奠定了基础.

CD151和整合素α3β1在大肠肿瘤中的表达及临床意义

探讨CD151和整合素a3β1在直肠腺瘤及结直肠腺癌组织中的表达及其与临床各个病理因素之间的关系，并且研究两者的相关性。方法：应用免疫组织化学双染方法对正常结直肠黏膜、结直肠腺瘤及结直肠腺癌组织各120例进行CD151和整合素a3β1检测，并进行Kaplan-Meier生存分析。采用Spearman等级相关分析CD151和整合素a3β1之间的相关性。结果：CD151结直肠正常黏膜、腺瘤、腺癌组织的阳性率分别为21．7％、52．5％、72％，腺瘤和腺癌组织分别与正常黏膜比较均具有统计学意义。整合素a3β1在结直肠正常黏膜、腺瘤、腺癌组织的阳性率分别为34．2％、55％、70％，腺瘤和腺癌组织分别与正常黏膜比较均具有统计学意义。在结直肠腺癌中，CDl51和整合素a3β1的表达与患者年龄、性别和肿瘤的部位、大小无相关性，与肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移及Duke’s分期有关。CD151和整合素a3β1在大肠正常黏膜、腺瘤及腺癌组织中的表达经双变量相关分析，表达呈正相关。从图的Kaplan-Meier生存曲线及Log-Rank检验可知，CD151＋、a3β1、CD151＋时与大肠癌患者5年生存期密切相关，是影响大肠癌预后的因素。结论：CD151和整合素a3β1在大肠癌的表达密切相关，提示CD151与整合素a3β1素复合物存在于大肠癌，其表达对预后产生明显的影响。CD151与整合素a3β1联合表达是临床预后判断的可靠指标。

喉鳞状细胞癌中STK15蛋白和BUBR1蛋白的表达及相互作用

目的探讨STK15和BUBR1蛋白的表达与喉癌发生、发展的相关性以及喉癌组织中STK15和BUBR1蛋白的相互作用。方法选取40例病理诊断为喉鳞状细胞癌组织标本及癌旁正常组织标本,应用免疫组织化学SP法检测STK15和BUBR1蛋白的表达水平,应用免疫荧光双标实验判定STK15和BUBR1蛋白的共定位。结果 STK15蛋白平均光密度值喉癌组织高于癌旁正常组织(P<0.05),BUBR1蛋白平均光密度值喉癌组织低于癌旁正常组织(P<0.05),即喉癌组织中STK15蛋白表达水平高于癌旁正常组织,而BUBR1蛋白表达水平低于癌旁正常组织。免疫荧光双标结果表明STK15蛋白和BUBR1蛋白均在细胞质及细胞核中表达,且2种蛋白标记的荧光可以重叠,提示两者可能存在相互作用。结论 STK15蛋白高表达、BUBR1蛋白表达下调可能与喉癌的发生、发展相关。STK15和BUBR1蛋白可能相互作用,共同影响喉癌的发生、发展。