研究提出不当使用免疫刺激剂造成水产动物免疫紊乱的靶向肠道菌群解决方案

近日,中国农业科学院饲料研究所水产微生物与饲料创新团队系统阐述了当前水产养殖中免疫激活剂使用不当所导致的鱼体免疫紊乱状态,并深入分析了靶向肠道菌群解决此类免疫紊乱的可行性,对水产养殖行业绿色发展具有指导作用。相关研究成果发表于《水产养殖综述(Reviews in Aquaculture)》上。

创伤弧菌外膜蛋白免疫刺激复合物对欧洲鳗鲡的免疫保护性分析

创伤弧菌（Vibrio vulnificus）是一种革兰氏染色阴性、多形性、运动性、有荚膜的嗜盐性细菌,属于弧菌属第5群,主要生长于海水中、鱼类及贝母类等体内[1]。根据寄主范围和生化反应类型的不同,将创伤弧菌分为3个生物型：生物Ⅰ型（产吲哚）[2]、生物Ⅱ型（不产吲哚）[3]以及1999年以色列的研究人员报道的创伤弧菌生物III型。

免疫刺激复合物(ISCOM)介导的传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因免疫的研究

将传染性法氏囊病病毒 (IBDV)ZJ2 0 0 0株的多聚蛋白 (VP2 /VP4/VP3)基因插入 pCI质粒的CMV启动子下游 ,构建了真核表达质粒pCI VP2 /VP4/VP3,在Lipofectin介导下转染Vero细胞进行了多聚蛋白的瞬时表达。以免疫刺激复合物 (ISCOM)为佐剂制备DNA疫苗 ,进行不同免疫剂量间、不同免疫途径间、一次免疫和二次免疫间的效果对比试验。结果表明 :以肌内和皮内联合免疫法效果最好 ,而口服和点眼等途径未能诱导足够的免疫反应 ;大于 2 0 0 μg的剂量DNA疫苗才能产生良好的免疫力 ;二次免疫的效果明显优于一次免疫。与常规的弱毒疫苗B87和D78相比 ,DNA疫苗产生中和抗体的潜伏期长、效价相对较低 ,对强毒攻击的保护率相当。本试验还证实 ,免疫刺激复合物具有明显提高DNA疫苗免疫效果的作用。DNA疫苗能诱导产生保护性反应 ,为今后IBD疫苗的研究开创了一条新的途径。

免疫刺激商品断奶仔猪复制多系统衰竭综合征(PMWS)

猪圆环病毒2型(PCV2)是引起PMWS的必需病原,与其他病原混合感染或受到外界刺激时表现PMWS临床症状。本试验将16头商品化断奶仔猪(32日龄)随机分为4组(每组4头),即对照组、钥匙孔血蓝蛋白刺激组、PCV2攻毒组和PCV2攻毒后钥匙孔血蓝蛋白刺激组,用上海某猪场分离株PCV2-SH、钥匙孔血蓝蛋白(KLH)反复刺激断奶仔猪以复制PMWS。其中对照组、钥匙孔血蓝蛋白刺激组未出现症状;PCV2攻毒组症状较轻,出现增重缓慢,伴有短暂的体温升高;而PCV2攻毒后钥匙孔血蓝蛋白刺激组出现明显的临床症状,2头猪在攻毒后第11天濒临死亡,其中1头在第12天死亡,攻毒猪宰杀后脏器出现明显的病理变化。PCV2攻毒组和PCV2攻毒后钥匙孔血蓝蛋白刺激组于攻毒后第4天出现病毒血症,宰杀后肺脏、淋巴结均检测到PCV2的DNA。以上结果说明,PCV2-SH感染结合免疫刺激可以引起商品化仔猪发生PMWS,为PCV2致病机理和免疫学研究提供了动物发病模型。

利用小鼠模型评价含有5'-GTCGTT-3'特征序列的人CpG寡脱氧核苷酸的免疫刺激活性

为了寻找合适的动物模型来评价人CpG寡脱氧核苷酸 (CpG ODN)的活性 ,研究了CpG2 0 0 6等含有 5 ' GTCGTT 3'特征序列的人CpG ODN对小鼠的免疫刺激活性。在体外它们能够促进小鼠脾淋巴细胞转化 ,促进B细胞分泌IgM ,但不能诱生高水平的IFN γ。研究了CpG2 0 0 6等序列在体内作为疫苗佐剂对HBsAg免疫效果的影响 ,发现 :(1)人CpG ODN能够明显提高抗 HBs抗体水平 ,并逆转Al(OH) 3 对Thl类免疫应答的抑制 ;(2 )初免时以CpG2 0 0 6为佐剂可以使免疫应答“锁定”在Thl类免疫应答 ,而加强免疫时以CpG2 0 0 6为佐剂可以在一定程度上逆转初免时Al(OH) 3 诱生的Th2类免疫应答 ;(3)CpG2 0 0 6联合Al(OH) 3 作为佐剂的单剂量疫苗的免疫效果强于两剂量以Al(OH) 3 为佐剂的常规疫苗。上述结果表明 :小鼠可以作为动物模型用于含有 5 ' GTCGTT 3'特征序列的人CpG ODN免疫效果的研究。

白细胞介素18基因修饰的树突状细胞的表型分析及其免疫刺激活性

目的:研究IL-18基因修饰后的树突状细胞(DC)的表型和功能的变化.方法:以含IL-18基因的重组腺病毒体外转染小鼠骨髓来源的DC,RLIDS检测IL-18分泌水平,以RT-PCR检测IL-18mRNA表达,以FACS法分析其DC表型变化,采用TdR检测其MLR的变化.结果:IL-18基因修饰的DC有效分泌IL-18,可检测到IL-18mnRNA的表达,分泌上清具有诱导T细胞产生IFN-γ的作用,IL-18基因修饰的DC同种异体MLR明显增强,且仅能被IL-18抗体部分阻断,表型分析表明,IL-18基因修饰后的Ia,B7.2,ICAM-1太阳性的DC的比例明显增加.结论:IL-18基因修饰的DC可有效表达有功能的IL-18,部分表面分子表达上调,刺激同种异体T淋巴细胞增殖能力的提高,提示其抗原提星功能增强.

不同序列的CpG-ODN对猪体外免疫细胞免疫刺激作用的研究

为了筛选出对猪体有免疫刺激活性的CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN),人工设计合成了9种未甲基化CpG-ODN不同序列,分别作用于健康猪外周血淋巴细胞和脾脏免疫细胞,进行体外转化试验。用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测外周血淋巴细胞转化效果和脾细胞的增殖能力和代谢能力,通过测得的OD490值,计算出淋巴细胞增殖指数(SI),筛选CpG-ODN的免疫刺激作用。结果显示:9种不同序列的CpG-ODN对猪外周血淋巴细胞和脾脏免疫细胞均具有不同程度的刺激作用,其中CpG-ODN7对淋巴细胞增殖能力的增强效果最为明显(SI=3.5),CpG-ODN6对猪脾脏免疫细胞的刺激指数最大(SI=2.7)。为研制猪DNA疫苗有效的CpG-ODN免疫佐剂奠定了基础。

体外筛选对鸡具有免疫刺激活性的CpG寡脱氧核苷酸

分别用有丝分裂原和CpG寡脱氧核苷酸 (CpGODN)对SPF鸡全血 ,经低速离心分离的外周血单个核细胞(PBMC)和脾脏细胞 ,用淋巴细胞分离液分离的PBMC和脾脏细胞进行刺激 ,用3 H TdR掺入法测定并比较上述鸡免疫细胞在不同培养温度和细胞浓度下的转化效果 ,从而建立了适用于大批量筛选对鸡具有免疫刺激活性CpGODN的淋巴细胞转化方法。进一步用该方法筛选自行设计合成的 38条ODN。结果表明 ,用低速离心法分离的鸡PBMC ,在细胞含量为10 7mL-1、 37℃、 5 %CO2 条件下 ,经CpGODN刺激 6 4～ 6 6h后 ,可以得到稳定的高效转化 ;不含CpG模体的ODN不具有免疫刺激活性 ;CpGODN 10、 11和 14具有最佳的免疫刺激活性 ,刺激指数大于 10。

免疫刺激序列增强日本血吸虫DNA疫苗的免疫保护作用

目的 探讨免疫刺激序列在日本血吸虫Mr 2 3 0 0 0膜蛋白 (SjC2 3 )DNA疫苗诱导BALB/c小鼠抗血吸虫感染中的作用。 方法 将SjC2 3基因片段克隆到增加了免疫刺激序列的真核表达质粒 pcDNA3 1 CpG中 ,构建pcDNA3 1 SjC2 3 /CpG。 40只雌性BALB/c小鼠随机分为 4组 ,① pcDNA3 1对照组 ;②pcDNA3 1 SjC2 3组 ;③ pcD NA3 1 CpG组 ;④ pcDNA3 1 SjC2 3 /CpG组。每鼠经两侧股四头肌注射质粒DNA共 10 0 μg ,隔 2周加强免疫 1次 ,共 3次。末次免疫后 4周经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴 45条 /鼠 ,45d后计数成虫及肝脏虫卵数。首次免疫前和感染前 2d分别经尾静脉采血 ,检测IgG及IgG1、IgG2a。末次免疫后 3周取小鼠脾细胞 ,检测经伴刀豆球蛋白和SjC2 3重组蛋白刺激后小鼠白细胞介素 2 (IL 2 )、白细胞介素 4(IL 4)和γ干扰素 (IFN γ)。用51Cr释放法检测经SjC2 3重组蛋白刺激后脾细胞对小鼠淋巴瘤细胞的杀伤作用。 结果 ②组和④组减虫率分别为 2 8 1%和 3 5 1% ,减卵率分别为 2 1 6%和 2 6 5 %。④组减虫率显著高于②组 (P <0 0 5 )。这两组均检测到特异性IgG ,IgG2a/IgG1比值分别为 10 1和 12 2。脾细胞经伴刀豆球蛋白和SjC2 3重组蛋白刺激后的IL 2水平 ,②组较①组、④组较③组均有升高。②组脾?

增强CpG免疫刺激作用途径的研究进展

CpG基序（CpG motifs）是指含有非甲基化的胞嘧啶（C）和鸟嘌呤（G）核苷酸核心的寡聚脱氧核苷酸（ODN）序列，又称为免疫刺激序列，一般为6个寡聚核苷酸。

免疫刺激复合物基质为佐剂的猪支原体肺炎活疫苗肌肉注射免疫效果评价

试验旨在探讨免疫刺激复合物基质(ISCOM-基质)作为猪支原体肺炎168株活疫苗佐剂使用的可行性,并考察其配合疫苗肌肉注射时的免疫效力和攻毒保护效力。首先以Quil A、胆固醇和磷脂为原料,采用透析法制备ISCOM-基质,然后将制备好的ISCOM-基质与活疫苗混合孵育,检验其对活疫苗的毒性。于体外用ISCOM-matrix直接刺激或与刀豆蛋白共同刺激淋巴细胞,观察细胞的增殖应答情况。而后将添加ISCOM-matrix佐剂的猪支原体肺炎活疫苗肌肉注射免疫动物,检测血清抗体水平及淋巴细胞增殖应答水平,于免疫后8周攻毒,评价攻毒保护效力。结果表明,所制备的ISCOM-基质不影响活疫苗的活力,并且在体外可直接或协同刀豆蛋白刺激淋巴细胞产生明显的增殖反应,最低起效浓度为0.01 ng/ml;当作为佐剂与活疫苗配合肌肉注射免疫时,可以显著诱导动物对疫苗抗原的细胞免疫应答,体液免疫应答亦有一定程度增强。用肺炎支原体强毒攻毒后25 d剖检,免疫组病变明显较攻毒对照组减轻,显示出较好的攻毒保护效果。

免疫刺激后小鼠肝脏内参基因稳定性研究

实时定量PCR技术现已广泛应用于细胞或组织mRNA转录水平的检测和半定量。选择合适的内参基因可以消除不同标本在RNA的产量、质量以及逆转录效率上可能存在的差别,从而获得目标基因特异性表达的真正差异。本试验应用实时定量PCR技术,研究小鼠在经过免疫刺激后,B2M、ACTB、GAPDH、SDHA、HPRT1和ARBP共6个内参基因在肝脏中的表达情况。结果表明,这6个内参基因表达存在差异。经过geNorm程序统计学分析,确定了ACTB、GAPDH两个看家基因适用于校正目标基因的表达量,为研究小鼠免疫刺激后肝脏目标基因的表达奠定基础。

具有免疫刺激活性的非甲基化寡核苷酸链的研究进展

富含非甲基化碱基CG的寡核苷酸链 (CpG oligodeoxynucleotides,CpG ODN) ,具有免疫刺激活性 .其骨架及侧翼核苷酸序列决定CpG ODN免疫效应的强度及特异性 .最近研究发现 ,通过对CpG ODN中核苷酸上的基团进行化学修饰 ,或改变侧翼核苷酸序列均能影响CpG ODN的免疫活性、种属及细胞特异性 .这对CpG

含嗜水气单胞菌气溶素的免疫刺激复合物的制备及其对欧洲鳗的免疫效果

将嗜水气单胞菌气溶素(AerA)基因定向连接到pET32a(+)表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),SDS-PAGE分析表明,硫氧还蛋白-气溶素融合蛋白(Trx-AerA)表达量占重组菌总蛋白量的65.5%。将上述融合蛋白与商品化的QuilA混合,分别添加Mega-10、卵磷脂、胆固醇获得Trx-AerA ISCOMs。其中同时添加Mega-10、卵磷脂、胆固醇组蛋白回收率最高为10.46%,仅添加QuilA组蛋白回收率为1.82%,两者差异显著(P<0.05)。分别采用Trx-AerA、Trx-AerA ISCOMs、Trx ISCOMs经腹腔注射免疫欧洲鳗,免疫30 d后,每个实验组取5尾实验鱼采集血清,按1∶200稀释通过ELSIA法检测抗体水平,同时采用菌数为2.0×106CFU的嗜水气单胞菌ZN1株进行攻击,测定免疫效力。结果显示:Trx-AerA免疫组相对保护率为0%(3/15),Trx-AerA ISCOMs免疫组为83.3%(13/15),Trx ISCOMs免疫组为50%(9/15);3个免疫组针对气溶素的特异性抗体水平OD450值分别为0.19,0.52,0.36,Trx-AerA ISCOMs免疫组、Trx-AerA免疫组显著高于Trx ISCOMs免疫组(P<0.05)。结果表明影响嗜水气单胞菌免疫效果的除了气溶素的抗体水平外,ISCOMs等也能够增强非特异性免疫保护应答。

多价精子抗原表位多肽-免疫刺激复合物的抗生育作用研究

目的 提高多价小鼠精子抗原表位多肽的免疫性避孕效应。方法 应用固相化学合成法合成具有两种精子抗原蛋白关键表位的 35肽 ,纯化后的多肽与皂甙QuilA及磷脂、胆固醇混合 ,透析制备多肽 免疫刺激复合物 (ISCOMs) ,并用于免疫雌性C5 7小鼠。结果 合成后的 35肽经纯化后纯度大于 95 % ,经质谱仪鉴定质荷比与理论值一致 ;透析法制备的多肽 ISCOMs在电镜下呈规则的蜂巢样、由多个亚单位构成的开放型结构 ;免疫后小鼠的血清及阴道冲洗液中特异性IgG和IgA最高分别为 1∶180 0 0和 1∶16 0 0 ;同时受孕率降为 2 0 0 % ,显著低于对照组 (P≤ 0 0 1)。结论 多肽 ISCOMs复合物具有独特的蜂巢样结构 ,其应用可显著提升多肽的免疫效应 ,尤其是粘膜免疫 ,获得较好的免疫性避孕效果 。

乙肝治疗性多肽免疫刺激复合物的制备及鉴定

目的 为有效提高小分子多肽在体诱导CTL应答的能力 ,制备了乙肝治疗性多肽免疫刺激复合物 (ISCOMs) ,并对其形成进行了鉴定。方法 乙肝治疗性多肽ISCOMs采用透析法制备获得 ,并经小分子多肽的SDS PAGE电泳法确定了复合物中小分子多肽的存在 ,采用Bradfords法测定了复合物中多肽的结合量。结果 在电镜下呈典型的蜂巢状亚微型颗粒结构 ,所制备的ISCOMs中多肽的结合量约为 0 .30mg/ml。结论 ISCOMs的成功制备 。

免疫刺激复合物疫苗制备及其对小鼠免疫功能的影响

确定了免疫刺激复合物(ISCOM)疫苗的安全有效剂量及其对小鼠免疫功能的影响。选取体重25 g左右的昆明小白鼠60只,分为12组,每组5只,腹腔分别注射不同剂量(5-200μg)的ISCOM疫苗,观察小鼠健康状态。选取体重28 g左右的昆明小白鼠60只,分为4组,分别在腹腔注射相同剂量的灭菌生理盐水,Lipase+生理盐水,空ISCOM,Lipase+ISCOM疫苗,利用间接ELISA检测血清中特异性抗体效价。结果表明,当注射剂量为5-25μg/只时,小鼠无任何异常症状。免疫后8 d,小鼠血清特异性抗体效价(log2)可以达到10.5,显著高于对照组。因此,ISCOM疫苗能有效引起小鼠的免疫反应。

猪肺炎支原体P97R1抗原免疫刺激复合物的制备及对活疫苗免疫刺激能力的增强作用研究

为增强肌肉注射免疫条件下猪肺炎支原体(Mhp)活疫苗的免疫刺激能力,并补充其缺乏的针对重要黏附因子P97R1的应答,本实验采用透析法制备含有P97R1的免疫刺激复合物(ISCOM-P97R1),并将ISCOMP97R1作为活疫苗的佐剂,通过小鼠模型进行免疫学评价。结果表明,电镜下观察所制备的ISCOM-P97R1具有ISCOM的典型蜂窝状结构,直径为30 nm^40 nm,P97R1蛋白的包封率可达85.6%。免疫后7 d即可在小鼠血清中检测到高水平的特异性P97R1抗体,并且其针对Mhp全菌蛋白的抗体也显著高于无佐剂的活疫苗对照组。结果表明,ISCOM-P97R1对Mhp活疫苗免疫刺激能力具有显著的增强作用,同时可以有效诱导产生针对P97R1的免疫应答,进一步增强了疫苗的保护能力。