免疫刺激复合物(ISCOM)介导的传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因免疫的研究

将传染性法氏囊病病毒 (IBDV)ZJ2 0 0 0株的多聚蛋白 (VP2 /VP4/VP3)基因插入 pCI质粒的CMV启动子下游 ,构建了真核表达质粒pCI VP2 /VP4/VP3,在Lipofectin介导下转染Vero细胞进行了多聚蛋白的瞬时表达。以免疫刺激复合物 (ISCOM)为佐剂制备DNA疫苗 ,进行不同免疫剂量间、不同免疫途径间、一次免疫和二次免疫间的效果对比试验。结果表明 :以肌内和皮内联合免疫法效果最好 ,而口服和点眼等途径未能诱导足够的免疫反应 ;大于 2 0 0 μg的剂量DNA疫苗才能产生良好的免疫力 ;二次免疫的效果明显优于一次免疫。与常规的弱毒疫苗B87和D78相比 ,DNA疫苗产生中和抗体的潜伏期长、效价相对较低 ,对强毒攻击的保护率相当。本试验还证实 ,免疫刺激复合物具有明显提高DNA疫苗免疫效果的作用。DNA疫苗能诱导产生保护性反应 ,为今后IBD疫苗的研究开创了一条新的途径。

副猪嗜血杆菌OMP5抗原免疫刺激复合物的制备及其对小鼠免疫功能的影响

为探究副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)外膜蛋白(outer membrane prtein,OMP)免疫刺激复合物(immune stimulating complexs,ISCOM)的抗原性,试验采用PCR方法扩增HPS的OMP5基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,获得重组表达质粒pET-28a-OMP5;进一步以QuilA、胆固醇和磷脂酰胆碱为原料,用透析法制备HPS OMP5抗原免疫刺激复合物(ISCOM-OMP5),用其免疫ICR小鼠后检测HPS抗体水平、细胞因子基因相对表达量及淋巴细胞增殖情况,以评价ISCOM-OMP5的免疫增强效果。结果表明:构建的重组表达质粒能够成功表达目的蛋白,大小约为40 ku;制备的ISCOM-OMP5具有ISCOM的典型蜂窝状结构,直径为30~40 nm,ISCOM-OMP5蛋白的包封率达85.8%;用ISCOM-OMP5对小鼠进行免疫,二免后14天即可在小鼠血清中检测到较高水平HPS抗体;ISCOM-OMP5能极显著提高白细胞介素-10(IL-10)和γ干扰素(IFN-γ)基因的相对表达量(P<0.01),显著提高T淋巴细胞的增殖能力(P<0.05),极显著提高B淋巴细胞的增殖能力(P<0.01)。说明ISCOM-OMP5可有效诱导小鼠产生针对HPS的免疫应答,能显著增强免疫效果。

免疫刺激复合物(ISCOM)疫苗的研究进展

综述了免疫刺激复合物(ISCOM)的结构和组成,其所制疫苗引起的抗体应答、细胞应答和粘膜应答的研究近况。同时对ISCOM疫苗的作用机理和其在免疫预防中的应用作了相应的概述。

伪狂犬病病毒免疫刺激复合物(ISCOM)的制备及其免疫效果检测

制备了伪狂犬病病毒囊膜蛋白免疫刺激复合物(ISCOM)。在电镜下呈典型笼状结构,直径约为40nm。其中抗原成分经SDS-PAGE电泳只出现一条带。用所制备的ISCOM10g为一头份免疫兔,中和抗体的最高效价为1:45,ELISA抗体效价最高可达1:128,两者均高于相同头份的亚单位疫苗、灭活疫苗及弱毒疫苗。ISCOM免疫兔后,攻击100LD50闽A株强毒,保护率为100%。

免疫刺激复合物(ISCOM)研究进展

本文就免疫刺激复合物 (ISCOM)的理化及免疫学特性进行了评述 ,并对其应用前景作了展望 ,以期了解免疫刺激复合物 (ISCOM)独特的免疫效果及其在免疫预防中的应用价值。

免疫刺激复合物(ISCOM)

ISCOM 全称ImmunostimulatingComplex,是由嵌入佐剂 Quil A 与抗原在溶液中相互作用而形成的一种高免疫活性的脂质小泡。常规佐剂有油乳剂(例如佛氏佐剂)、氢氧化铝胶等,但使用中需用大剂量以增强免疫效果,往往导致不可接受的反效应。

免疫刺激复合物(ISCOM)基质Quil A的纯化与测定

利用G 75凝胶从粗制皂素中制备出QuilA,并用紫外吸收法与溶血法对其含量进行测定,结果分别为49.6%和47.3%。

免疫刺激复合物疫苗制备及其对小鼠免疫功能的影响

确定了免疫刺激复合物(ISCOM)疫苗的安全有效剂量及其对小鼠免疫功能的影响。选取体重25 g左右的昆明小白鼠60只,分为12组,每组5只,腹腔分别注射不同剂量(5-200μg)的ISCOM疫苗,观察小鼠健康状态。选取体重28 g左右的昆明小白鼠60只,分为4组,分别在腹腔注射相同剂量的灭菌生理盐水,Lipase+生理盐水,空ISCOM,Lipase+ISCOM疫苗,利用间接ELISA检测血清中特异性抗体效价。结果表明,当注射剂量为5-25μg/只时,小鼠无任何异常症状。免疫后8 d,小鼠血清特异性抗体效价(log2)可以达到10.5,显著高于对照组。因此,ISCOM疫苗能有效引起小鼠的免疫反应。

多价精子抗原表位多肽-免疫刺激复合物的抗生育作用研究

目的 提高多价小鼠精子抗原表位多肽的免疫性避孕效应。方法 应用固相化学合成法合成具有两种精子抗原蛋白关键表位的 35肽 ,纯化后的多肽与皂甙QuilA及磷脂、胆固醇混合 ,透析制备多肽 免疫刺激复合物 (ISCOMs) ,并用于免疫雌性C5 7小鼠。结果 合成后的 35肽经纯化后纯度大于 95 % ,经质谱仪鉴定质荷比与理论值一致 ;透析法制备的多肽 ISCOMs在电镜下呈规则的蜂巢样、由多个亚单位构成的开放型结构 ;免疫后小鼠的血清及阴道冲洗液中特异性IgG和IgA最高分别为 1∶180 0 0和 1∶16 0 0 ;同时受孕率降为 2 0 0 % ,显著低于对照组 (P≤ 0 0 1)。结论 多肽 ISCOMs复合物具有独特的蜂巢样结构 ,其应用可显著提升多肽的免疫效应 ,尤其是粘膜免疫 ,获得较好的免疫性避孕效果 。

创伤弧菌外膜蛋白免疫刺激复合物对欧洲鳗鲡的免疫保护性分析

创伤弧菌（Vibrio vulnificus）是一种革兰氏染色阴性、多形性、运动性、有荚膜的嗜盐性细菌,属于弧菌属第5群,主要生长于海水中、鱼类及贝母类等体内[1]。根据寄主范围和生化反应类型的不同,将创伤弧菌分为3个生物型：生物Ⅰ型（产吲哚）[2]、生物Ⅱ型（不产吲哚）[3]以及1999年以色列的研究人员报道的创伤弧菌生物III型。

免疫刺激复合物基质为佐剂的猪支原体肺炎活疫苗肌肉注射免疫效果评价

试验旨在探讨免疫刺激复合物基质(ISCOM-基质)作为猪支原体肺炎168株活疫苗佐剂使用的可行性,并考察其配合疫苗肌肉注射时的免疫效力和攻毒保护效力。首先以Quil A、胆固醇和磷脂为原料,采用透析法制备ISCOM-基质,然后将制备好的ISCOM-基质与活疫苗混合孵育,检验其对活疫苗的毒性。于体外用ISCOM-matrix直接刺激或与刀豆蛋白共同刺激淋巴细胞,观察细胞的增殖应答情况。而后将添加ISCOM-matrix佐剂的猪支原体肺炎活疫苗肌肉注射免疫动物,检测血清抗体水平及淋巴细胞增殖应答水平,于免疫后8周攻毒,评价攻毒保护效力。结果表明,所制备的ISCOM-基质不影响活疫苗的活力,并且在体外可直接或协同刀豆蛋白刺激淋巴细胞产生明显的增殖反应,最低起效浓度为0.01 ng/ml;当作为佐剂与活疫苗配合肌肉注射免疫时,可以显著诱导动物对疫苗抗原的细胞免疫应答,体液免疫应答亦有一定程度增强。用肺炎支原体强毒攻毒后25 d剖检,免疫组病变明显较攻毒对照组减轻,显示出较好的攻毒保护效果。

乙肝治疗性多肽免疫刺激复合物的制备及鉴定

目的 为有效提高小分子多肽在体诱导CTL应答的能力 ,制备了乙肝治疗性多肽免疫刺激复合物 (ISCOMs) ,并对其形成进行了鉴定。方法 乙肝治疗性多肽ISCOMs采用透析法制备获得 ,并经小分子多肽的SDS PAGE电泳法确定了复合物中小分子多肽的存在 ,采用Bradfords法测定了复合物中多肽的结合量。结果 在电镜下呈典型的蜂巢状亚微型颗粒结构 ,所制备的ISCOMs中多肽的结合量约为 0 .30mg/ml。结论 ISCOMs的成功制备 。

含嗜水气单胞菌气溶素的免疫刺激复合物的制备及其对欧洲鳗的免疫效果

将嗜水气单胞菌气溶素(AerA)基因定向连接到pET32a(+)表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),SDS-PAGE分析表明,硫氧还蛋白-气溶素融合蛋白(Trx-AerA)表达量占重组菌总蛋白量的65.5%。将上述融合蛋白与商品化的QuilA混合,分别添加Mega-10、卵磷脂、胆固醇获得Trx-AerA ISCOMs。其中同时添加Mega-10、卵磷脂、胆固醇组蛋白回收率最高为10.46%,仅添加QuilA组蛋白回收率为1.82%,两者差异显著(P<0.05)。分别采用Trx-AerA、Trx-AerA ISCOMs、Trx ISCOMs经腹腔注射免疫欧洲鳗,免疫30 d后,每个实验组取5尾实验鱼采集血清,按1∶200稀释通过ELSIA法检测抗体水平,同时采用菌数为2.0×106CFU的嗜水气单胞菌ZN1株进行攻击,测定免疫效力。结果显示:Trx-AerA免疫组相对保护率为0%(3/15),Trx-AerA ISCOMs免疫组为83.3%(13/15),Trx ISCOMs免疫组为50%(9/15);3个免疫组针对气溶素的特异性抗体水平OD450值分别为0.19,0.52,0.36,Trx-AerA ISCOMs免疫组、Trx-AerA免疫组显著高于Trx ISCOMs免疫组(P<0.05)。结果表明影响嗜水气单胞菌免疫效果的除了气溶素的抗体水平外,ISCOMs等也能够增强非特异性免疫保护应答。

猪肺炎支原体P97R1抗原免疫刺激复合物的制备及对活疫苗免疫刺激能力的增强作用研究

为增强肌肉注射免疫条件下猪肺炎支原体(Mhp)活疫苗的免疫刺激能力,并补充其缺乏的针对重要黏附因子P97R1的应答,本实验采用透析法制备含有P97R1的免疫刺激复合物(ISCOM-P97R1),并将ISCOMP97R1作为活疫苗的佐剂,通过小鼠模型进行免疫学评价。结果表明,电镜下观察所制备的ISCOM-P97R1具有ISCOM的典型蜂窝状结构,直径为30 nm^40 nm,P97R1蛋白的包封率可达85.6%。免疫后7 d即可在小鼠血清中检测到高水平的特异性P97R1抗体,并且其针对Mhp全菌蛋白的抗体也显著高于无佐剂的活疫苗对照组。结果表明,ISCOM-P97R1对Mhp活疫苗免疫刺激能力具有显著的增强作用,同时可以有效诱导产生针对P97R1的免疫应答,进一步增强了疫苗的保护能力。

猪伪狂犬病病毒囊膜蛋白免疫刺激复合物的制备

以非离子去污剂 Mega-1 0裂解病毒囊膜蛋白 ,与新型佐剂 ISCOM基质作用 ,应用离心和透析相结合的方法制备了猪伪狂犬病病毒囊膜蛋白免疫刺激复合物 ( PRV-ISCOMs)。PRV-ISCOMs经磷钨酸负染后电镜观察见到囊膜蛋白分布在 ISCOM颗粒表面 ,形成直径3 0～ 40 nm 的笼格状结构 ,同时将 PRV-ISCOMs在 -2 0℃冻融 5次后经电镜观察仍见到典型的笼格状结构 ,与国外报道的形态一致 ,本结果证实我们成功地制备了具有良好稳定性的

HBsAg免疫刺激复合物的制备及鉴定

目的 提高CHO细胞表达的重组乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的免疫原性。方法 采用离心法和透析法制备HBsAg的免疫刺激复合物，并探讨其影响因素。结果 初步确定HBsAg的ISCOMs的最佳形成条件是：温度25℃，反应时间18h，pH6．8。电镜下观察ISCOMs呈直径为30—40nm的蜂窝状结构。SDS-PAGE分析表明，离心法和透析法制备的颗粒HBsAg蛋白均由P23、GP27和GP30组成。用Bradfords法检测离心法和透析法制备的ISCOMs的蛋白回收率分别为31．50％和41．15％，其稳定性和免疫原性均优于相应的铝佐剂疫苗。结论 HBsAg免疫刺激复合物可提高乙型肝炎表面抗原的免疫原性。

HBsAg免疫刺激复合物型疫苗制备

目的制备中国仓鼠卵巢细胞（CHO）细胞表达的重组乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的免疫刺激复合物型（ISCOMs）疫苗。方法采用离心法和透析法制备了HBsAg的免疫刺激复合物。结果电镜下观察ISCOMs直径为30-40nm左右的蜂窝状结构。十二烷基磺酸钠电泳（SDS-PAGE）分析表明，离心法和透析法制备的颗粒的HBsAg蛋白均由P23、GP27和GP30组成。Bradfords法测定离心法和透析法制备的ISCOMs的蛋白回收率分别为31．50％和41．15％。结论HBsAg免疫刺激复合物型的成功制备为ISCOMs型乙型肝炎疫苗的研制打下了基础。

免疫刺激复合物型白血病瘤苗对荷瘤小鼠免疫功能的影响

目的观察免疫刺激复合物(ISCOM)型白血病瘤苗对荷瘤小鼠免疫功能的影响。方法将40只SPF级C57BL/6小鼠随机分为4组,A组不进行任何处理,B、C、D组均进行荷瘤小鼠动物模型的建立,B组采用等体积的生理盐水进行治疗,C组采用灭活的FBL-3瘤苗治疗,D组采取灭活的FBL-3细胞+ISCOM瘤苗进行治疗,治疗4周后,观察小鼠一般状况、巨噬细胞(Mφ)杀伤活性和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性。结果治疗后,C组Mφ杀伤活性、B组Mφ杀伤活性和CTL杀伤活性均显著低于A组(P<0.01),C组Mφ杀伤活性、D组Mφ杀伤活性和CTL杀伤活性均显著高于A组(P<0.01);C组和D组小鼠未见明显脱毛,进食较正常,瘤体小于B组;C组和D组Mφ杀伤活性和CTL杀伤活性均显著高于B组(P<0.01),D组具有最高的Mφ杀伤活性和CTL杀伤活性。结论 ISCOM型白血病瘤苗可通过增强荷瘤小鼠的Mφ活性和CTL活性达到改善荷瘤小鼠的非特异性免疫和细胞免疫功能的作用。