猪胸膜肺炎放线杆菌OmpD、LppB蛋白的原核表达及免疫原性分析

本研究旨在评价猪胸膜肺炎放线杆菌OmpD和LppB蛋白的免疫原性和保护效果。通过同源性分析,发现19个血清型的APP均含有ompD和lppB基因,氨基酸序列相似性分别为98.2%~100%和99.3%~100%。利用基因工程大肠杆菌表达纯化了1型菌株的rOmpD和rLppB蛋白,并进行了免疫原性分析。结果显示,两种蛋白均能有效表达,与猪康复血清反应明显。小鼠免疫rOmpD、rLppB蛋白后,ELISA抗体水平显著提高,对国内流行的1型、7型菌株攻毒保护率为70%~80%。进一步制备含rOmpD和rLppB的油乳剂,免疫仔猪后,ELISA抗体水平显著提高,对1型、7型菌株攻毒具有部分保护作用和交叉保护能力,但未能完全阻止感染和死亡。因此OmpD、LppB有作为APP亚单位疫苗开发候选抗原的潜力,本研究为进一步开发具有良好交叉保护效果的疫苗提供了数据支持。

低温等离子体诱导黑色素瘤细胞免疫原性细胞死亡的研究

目的 比较低温等离子体(low-temperature plasma, LTP)直接处理和等离子体活化液(plasma-activated medium, PAM)处理对黑色素瘤细胞免疫原性细胞死亡(immunogenic cell death, ICD)的诱导作用。方法 LTP直接处理和PAM处理黑色素瘤细胞B16F10细胞24 h后,通过MTT检测细胞活力,使用流式细胞术检测细胞凋亡和细胞表面钙网蛋白(calreticulin, CRT)的表达情况,用三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)检测试剂盒检测培养液中ATP含量,使用ELISA法检测细胞培养液中高迁移率族蛋白1(high-mobility group box 1, HMGB1)含量;用LTP处理的B16F10与未成熟的树突状细胞(dendritic cells, DC)DC2.4细胞系共培养,流式细胞术检测DC表面分子(CD80和CD86)。结果 与对照组相比,两种处理方式均能导致B16F10细胞活力下降,细胞凋亡率增加,细胞内活性氧(ROS)增多,CRT表达升高、ATP和HMGB1分泌含量增加(P<0.05)。在相同处理时间下,LTP直接处理的B16F10细胞CRT表达和ATP释放高于PAM处理(P<0.05)。与DC2.4组相比,DC细胞成熟标志分子CD80在LTP-120s组、LTP-180s组、PAM-120s组、PAM-180s组表达比例升高,DC细胞成熟标志分子CD86在LTP-120s组、LTP-180s组、PAM-180s组的表达比例升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 LTP直接处理和PAM处理均可诱导黑色素瘤细胞发生ICD,LTP直接处理诱导效果更佳。

猪圆环病毒2型毒株的分离鉴定及其对小鼠的免疫原性分析

为获得猪圆环病毒2型(PCV2)候选疫苗株,对疑似PCV2感染猪的淋巴结、脾脏等组织病料进行检测,对阳性病料进行PCV2分离纯化、鉴定、全基因测序和遗传进化分析,并制成PCV2灭活疫苗,进行小鼠免疫原性分析。结果显示;从PCV2阳性病料中成功分离得到1株PCV2毒株,病毒含量不低于10^(6.0) FAID_(50)/mL,间接免疫荧光试验可见绿色荧光;该毒株基因全长约1767 bp,全基因核酸序列与PCV2参考序列ON012565.1、KU960933.1同源性最高为99.9%,与PCV3参考序列PP566974.1同源性最低为45.9%,与多数PCV2参考毒株序列同源性在92%以上,经进化树分析属于PCV2d基因亚型;用该分离毒株制成灭活疫苗免疫小鼠后,测得特异性抗体,且效价较高。结果说明,该分离株具有良好的免疫原性,可作为PCV2疫苗研发的候选毒株。

人过表达肝细胞生长因子间充质干细胞对小鼠的免疫原性和免疫毒性评价

目的评价人过表达肝细胞生长因子间充质干细胞(hepatocyte growth factor-overexpressing dental pulp-stem cells,HGF-DPSCs)对小鼠的免疫原性和免疫毒性。方法采用BALB/c小鼠,雌雄各半,随机分组,每组6只,共6组,合计动物36只。设立第3天对照组(D3 PBS组)、第3天尾静脉注射DPSCs组(D3 DPSCs组)、第3天尾静脉注射HGF-DPSCs组(D3 HGF-DPSCs组)、第7天对照组(D7 PBS组)、第7天尾静脉注射DPSCs组(D7 DPSCs组)、第7天尾静脉注射HGF-DPSCs组(D7 HGF-DPSCs组)。全自动动物血液细胞分析仪检测外周血淋巴细胞、粒细胞、单核细胞,ELISA检测HGF、IgA、IgE、IgG、IgM、IFN-γ、IL-4、TNF-α表达水平,HE染色评价肝、肾、脾、肺组织的病理变化。结果D3 HGF-DPSCs组和D7 HGF-DPSCs组的血清人源HGF水平分别高于D3 DPSCs组和D7 DPSCs组,D3 PBS组和D7 PBS组不表达人源HGF。D7 PBS组较D3 PBS组、D7 DPSCs组较D3 DPSCs组、D7 HGF-DPSCs组较D3 HGF-DPSCs组,在淋巴细胞、炎症因子和器官毒性上均未观察到明显区别。各组间淋巴细胞总数、淋巴细胞百分比、总IgA、总IgE、总IgG、总IgM、IL-4、TNF-α、IFN-γ等指标差异均无统计学意义。同时HE染色结果表明经尾静脉注射HGF-DPSCs后,小鼠各脏器未出现明显病理损伤。结论腺病毒载体构建的HGF-DPSCs可在小鼠体内高表达HGF,同时HGF-DPSCs并无明显的免疫原性和免疫毒性,为HGF-DPSCs的后续研究和临床应用提供了直接的数据支撑和理论依据。

密码子优化的RHDV2双VP60基因重组杆状病毒构建及表达蛋白免疫原性分析

[目的]试验旨在优化兔出血症病毒2型(Rabbit hemorrhagic disease virus 2,RHDV2)病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)疫苗的制备策略,探究RHDV2 VLP疫苗对家兔的免疫原性,为低成本、高产量RHDV2新型疫苗研发提供新思路。[方法]根据昆虫细胞的密码子偏好性优化合成RHDV2 VP60全基因,将双VP60基因插入真核载体pFastBacTMDual,转化携带Bacmid质粒的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,构建含双VP60基因的重组杆粒Bacmid-VP60-VP60,转染Sf9昆虫细胞,通过Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)及透射电镜对重组杆状病毒Bacmid-VP60-VP60进行表达验证;将优化策略制备的重组蛋白抗原与氢氧化铝佐剂按照9∶1比例制备VLP灭活疫苗,通过安全性检验、最小免疫剂量、免疫持续期等评估优化策略制备的RHDV2 VLP疫苗的保护效果。[结果]试验成功构建重组杆粒Bacmid-VP60-VP60。Western blotting鉴定结果显示,重组杆状病毒转染Sf9细胞表达出大小约60 ku的RHDV2 VP60蛋白。IFA鉴定结果显示,感染重组杆状病毒的Sf9细胞产生了大量的黄绿色荧光,表明重组杆状病毒在Sf9细胞中大量表达VP60蛋白。透射电镜观察结果显示,VP60蛋白折叠成VLP,大小为40 nm左右,呈现球形结构,表面光滑。优化策略制备的RHDV2 VLP疫苗对家兔具有良好的安全性和免疫原性,最小免疫剂量为0.5 mL/只,免疫持续期可达210 d以上。[结论]试验构建了含有密码子优化的双VP60基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中成功表达RHDV2 VP60蛋白,该蛋白制备的VLP疫苗对家兔具有良好的免疫原性。

非洲猪瘟病毒p30蛋白与CRM197的融合表达及对小鼠的免疫原性评价

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种急性、高传染性和致死性的传染病,对猪养殖业造成了巨大的影响。安全有效的疫苗和有效治疗药物的缺乏给非洲猪瘟防控带来了巨大的挑战。作者尝试设计一种融合蛋白以改善非洲猪瘟病毒p30的免疫原性。白喉毒素的无毒突变体CRM197已被成功地用作多糖-蛋白结合疫苗的载体蛋白,以增强多糖的免疫原性。本研究构建p30与CRM197催化结构域(A片段)的融合表达质粒,纯化后的重组蛋白和单独p30分别使用小鼠评价了其免疫原性。结果显示:通过原核表达与亲和层析纯化得到融合蛋白p30-CRM197(A)免疫小鼠后,较单独表达的p30其可以在更短的时间内激发起高水平针对p30的特异性IgG,并且在初次免疫后56 d后还能维持较高水平的淋巴细胞免疫活力。本研究结果表明,CRM197的A片段作为载体蛋白显著增强原核表达p30蛋白的免疫原性,其可作为非洲猪瘟亚单位疫苗的候选分子内佐剂。

嵌合流行毒株G-H环基因重组口蹄疫病毒的拯救及其免疫原性分析

为了研究能有效免疫防控当前流行的O型3个拓扑型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)的疫苗候选株,本研究利用FMDV反向遗传操作技术,通过基因替换,构建同时含当前流行的O型三个拓扑型病毒株结构蛋白基因的重组全长克隆,转染表达T7RNA聚合酶的细胞后拯救重组FMDV,分析结构蛋白基因的重构对病毒生物学特性的影响;拯救病毒制备灭活疫苗,免疫猪和牛,用体外中和试验初步研究其作为O型FMD疫苗候选株的潜力。结果表明FMD流行毒株结构蛋白VP1 G-H环基因的替换没有明显影响重组病毒的噬斑表型和复制能力,但不同FMDV G-H环抗原表位对猪诱导机体产生交叉中和抗体水平影响较大,对牛诱导机体产生交叉中和抗体的影响较小,表明FMDV G-H抗原表位是猪免疫优势的表位。本研究为未来FMDV疫苗的设计提供了重要参考。

重组人血白蛋白在食蟹猴体内的免疫原性评价

目的:考察重组人血白蛋白(rHSA)在食蟹猴体内产生的抗药抗体(ADA)特征,并比较rHSA和人血浆来源白蛋白(pHSA)诱导食蟹猴产生ADA特征的差异。方法:单次给药实验共使用24只食蟹猴,设置4组:pHSA组(1 g·kg^(-1))与rHSA低、中、高剂量组(0.3,1,2 g·kg^(-1)),每组6只动物,共给药1次。重复给药实验使用12只食蟹猴,设置pHSA组与rHSA组,每组6只动物,给药剂量均为1 g·kg^(-1),连续静脉输注给药6 d。实验均在给药前和给药后14,21,28,42,56 d进行ADA检测。结果:2个实验中各组动物均出现ADA阳性反应。单次给药实验中,pHSA组14 d可检测到抗体(阳性率为50%),28 d的ADA阳性率达到峰值(83%),部分动物抗体持续到56 d。rHSA的3个剂量组均在14 d可检测到抗体,28 d时ADA阳性率达到峰值(阳性率最高达100%),随后ADA阳性率开始下降。重复给药实验中,pHSA组和rHSA组均在14 d可检测到抗体(阳性率均为83%)且ADA阳性率达到峰值,至42 d的ADA阳性率开始下降。单次给予等剂量(1 g·kg^(-1))的pHSA和rHSA后,rHSA组ADA阳性率小于pHSA组。重复给予等剂量(1 g·kg^(-1))pHSA和rHSA后,二者的ADA阳性率相同,但rHSA组ADA阳性率降低较快。结论:rHSA与pHSA均可诱导食蟹猴产生体液免疫应答,产生相应抗体,重复给药可诱导更强的免疫反应。

Ⅰ群4型禽腺病毒Y17215-1株体外增殖规律及免疫原性研究

为探讨禽腺病毒4型分离株Y17215-1的体外增殖特性和免疫原性,本研究以LMH细胞为模型,摸索Y17215-1株最佳接种剂量和收获时间;通过活毒滴鼻接种和灭活疫苗肌肉注射的方式免疫SPF鸡,测定其免疫原性。结果显示:Y17215-1株0.1 MOI接种LMH细胞,培养48~72 h病毒滴度达到峰值108.625 TCID_(50)/mL。该病毒经肌肉注射对42日龄SPF鸡具有较强致病性,LD_(50)为103.000 TCID_(50)/0.2 mL。以10^(7.676) TCID_(50)的Y17215-1株滴鼻免疫21日龄SPF鸡,免疫后7 d 100%试验鸡产生中和抗体,14 d达到高峰。以Y17215-1株制备灭活疫苗肌肉注射免疫21日龄SPF鸡(10^(7.676) TCID_(50)/羽),免疫后7 d 70%试验鸡产生中和抗体,21 d达到高峰。在免疫后21 d用1000LD_(50)的Y17215-1株进行攻毒,活毒和灭活疫苗的保护率均为100%。以上结果表明:Y17215-1株具有很好的体外增殖特性和免疫原性,可以作为候选疫苗毒株。

猪传染性胃肠炎病毒S、N基因DNA疫苗载体构建及其免疫原性

【目的】构建猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)S、N基因的DNA疫苗载体,并进行免疫原性试验,为猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis,TGE)的防控和DNA疫苗研究提供技术支撑和基础数据。【方法】扩增S基因的A位点、D位点和N基因,并将N基因(单独)、A位点和D位点(融合)克隆至pCDNA3.1-His-C构建重组疫苗载体,运用生物信息学软件预测分析S(A-D)蛋白、N蛋白二级结构组成、三级构像、亚细胞定位和优势B细胞抗原表位。将构建成功的重组载体分别转染至PK-15细胞进行间接免疫荧光试验,运用共聚焦检测重组蛋白的表达分布情况。将重组疫苗载体单独或联合免疫小鼠,运用间接ELISA检测IgG抗体水平。【结果】扩增出S基因的A位点、D位点和N基因,大小分别为498、606、1149 bp。构建了A位点与D位点(融合)、N基因(单独)的DNA疫苗重组载体p-S(A-D)-His和p-N-His。生物信息学软件预测分析发现TGEV感染宿主细胞时N蛋白主要定位于细胞核和线粒体,S(A-D)蛋白主要定位于细胞质和线粒体,S(A-D)蛋白具有7个优势B细胞抗原表位,N蛋白具有8个优势B细胞抗原表位。重组载体p-S(A-D)-His和p-N-His均在PK-15细胞内成功表达,且S(A-D)-His和N-His在PK-15细胞核和细胞质中均有分布。重组疫苗载体免疫小鼠后,免疫效果由高至低依次为p-N-His>p-S(A-D)-His+p-N-His>p-S(A-D)-His。【结论】本研究构建了TGEV的S、N基因的DNA疫苗载体,免疫小鼠后均产生了较强的特异性抗体,为TGEV的核酸疫苗的研制提供了基础材料和依据。

紫草素诱导宫颈癌细胞凋亡及免疫原性死亡的机制研究

目的探究紫草素作用下的宫颈癌细胞凋亡及其免疫原性死亡相关分子表达变化。方法通过网络药理学、生物信息学及WGCNA方法从分子层面探究紫草素诱导宫颈癌细胞凋亡的作用机制;CTD数据库获取紫草素的作用靶点;GEO数据库及WGCNA分析宫颈癌的差异基因,取交集后得到疾病靶点,与药物靶点相互映射后得到治疗靶点;STRING数据库进行蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)分析;DAVID数据库进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析。体外实验中,采用5~80μmol/L紫草素处理人宫颈癌SiHa细胞,48 h后CCK8法检测细胞存活率;SiHa细胞经10μmol/L紫草素(低浓度组)和20μmol/L紫草素(高浓度组)处理48 h后,采用流式细胞术检测细胞凋亡及其免疫原性死亡相关分子和共刺激分子的表达,并以20 ng/μl的5-氟尿嘧啶作为阳性对照组,不加紫草素为空白对照组。结果WGCNA共筛选宫颈癌1989个差异基因;通过DAVID数据库共筛选得到91个KEGG富集条目,884个生物学过程、81个分子功能、21个细胞组分;PPI网络显示,紫草素与宫颈癌细胞中的TP53和CASP3等靶点密切相关;紫草素干预宫颈癌核心靶点主要作用于细胞凋亡蛋白通路,免疫系统过程的负调节通路,参与免疫反应的淋巴细胞活化、细胞凋亡执行期的调控通路等。紫草素对SiHa细胞的增殖具有明显抑制作用,IC50值为29.62μmol/L;低、高浓度组的细胞凋亡率,caspase-3、caspase-9、CRT、HSP70、PD-L1、Galectin9表达水平高于空白对照组(P<0.05);高浓度组细胞凋亡率,caspase-3、caspase-9、CRT、HSP70、PD-L1、Galectin9表达水平高于低浓度组(P<0.05)。结论紫草素作用于TP53、CASP3等靶点诱导宫颈癌细胞发生凋亡的同时,对细胞发生免疫原性死亡也具有诱导作用。

光动力治疗与肿瘤细胞免疫原性死亡

抗癌治疗的成功依赖于免疫系统介导的长期特异性抗肿瘤免疫反应。而近年来肿瘤细胞免疫原性死亡(ICD)被认为是诱发机体产生这种反应的重要方式。光动力疗法(PDT)已被证实可引发肿瘤细胞免疫原性死亡。ICD的核心是垂死癌细胞表达或释放危险相关分子模式(DAMPs),这些DAMPs对激活树突状细胞(DC)和激活T细胞适应性免疫反应至关重要,并导致长期免疫记忆的形成。本文将介绍ICD的研究进展以及通过改善肿瘤微环境缺氧和光敏剂的亚细胞定位增强PDT诱导ICD的能力的探索。

1株兔源A型产气荚膜梭菌毒力和免疫原性测定

在兔场中发现一只疑似感染了产气荚膜梭菌病兔,从该兔的病理组织中分离到1株兔源产气荚膜梭菌,对分离株进行血清学分型。毒力以及免疫原性检测。结果表明:该分离株血清型为A型,该分离株肉肝胃酶消化汤培养液的无菌毒素对小鼠和家兔均有毒力、对小白鼠的最小致死量为0.05 m L/只,对家兔的最小致死量为1.5 m L/只。按《中华人民共和国兽用生物制品规程》(以下简《规程》)方法制备疫苗进行效力检验,免疫保护率不低于80%。

牛种布鲁氏菌A19ΔBtpA缺失株生物学特性及其免疫原性研究

布鲁氏菌四型分泌系统(T4SS)效应物BtpA是布鲁氏菌的重要免疫抑制分子之一。为了进一步了解BtpA对牛种布鲁氏菌生物学特性的影响,并探究BtpA基因缺失是否会影响布鲁氏菌的免疫原性。在牛种布鲁氏菌疫苗株(A19株)上对BtpA基因进行了缺失,通过qRT-PCR检测布鲁氏菌A19ΔBtpA缺失株中的BtpA mRNA表达水平,并探究布鲁氏菌A19株和A19ΔBtpA缺失株在生长曲线、胞内生存、黏附侵袭和体外应激方面的差异。此外,将A19株和A19ΔBtpA缺失株免疫小鼠,在免疫后的第7、14、21、28和35天使用间接ELISA检测小鼠体内的布鲁氏菌特异性抗体水平;通过ELISpot检测免疫第21天时小鼠脾淋巴细胞中IFN-γ的表达水平,利用流式细胞术测定了小鼠脾淋巴细胞中IFN-γ阳性CD4^(+)、CD8^(+)T淋巴细胞以及CD4^(+)、CD8^(+)T淋巴细胞的分类情况。结果表明:成功构建了A19ΔBtpA缺失株,A19ΔBtpA缺失株中BtpA的转录水平显著低于A19株,A19ΔBtpA缺失株与亲本株在生长曲线、胞内生存和黏附侵袭方面呈现相似的趋势。而体外应激试验显示,高渗应激条件下A19ΔBtpA缺失株的存活菌量明显低于A19株(P<0.05)。免疫原性研究中,与PBS组相比,A19组和A19ΔBtpA组均可极显著诱导小鼠产生布鲁氏菌特异性抗体(P<0.01);与A19组相比,A19ΔBtpA组淋巴细胞IFN-γ表达水平显著升高(P<0.05),使小鼠产生的IFN-γ阳性CD4^(+)、CD8^(+)T淋巴细胞以及CD4^(+)/CD8^(+)T细胞比值显著增高(P<0.05)。BtpA基因缺失不会影响布鲁氏菌A19体外胞内增殖,但可能参与布鲁氏菌抗高渗环境能力相关。此外,A19ΔBtpA缺失株比A19株更好地诱导Th1型免疫应答,诱导宿主产生与A19株相当的IgG特异性抗体,具有布鲁氏菌基因缺失疫苗的潜力。该研究将为进一步探究布鲁氏菌的致病机制和开发基因缺失株疫苗提供理论基础和数据支持。

副鸡禽杆菌lpxM蛋白的原核表达及免疫原性研究

[目的]探究副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum)外膜蛋白lpxM的免疫原性,为预防鸡传染性鼻炎提供理论参考。[方法]构建pET-28a-lpxM原核表达载体,经PCR扩增和双酶切鉴定后将阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG进行诱导表达,并对诱导时间和诱导浓度进行优化,用尿素缓冲液纯化重组蛋白lpxM并进行SDS-PAGE分析。利用Western blotting鉴定重组蛋白的特异性。将重组蛋白与MONTANIDEISA 71 VG佐剂制备成疫苗v-lpxM,通过动物试验观察重组蛋白的免疫效果。[结果]重组质粒pET-28a-lpxM转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后成功表达,在37 ku处有目的蛋白特异性条带,在37℃、700 mmol/L IPTG、诱导4 h时蛋白表达量最高;重组蛋白lpxM在上清和沉淀中均有表达,且在沉淀中表达量相对较高;Western blotting结果显示,C型副鸡禽杆菌Modesto株的阳性鸡血清与纯化后的重组蛋白可发生免疫反应。免疫保护试验结果显示,v-lpxM疫苗对A、B和C型副鸡禽杆菌的保护率分别为0、20%和60%。[结论]本研究成功构建了原核表达载体pET-28a-lpxM,实现了lpxM重组蛋白的高效表达,且表现出良好的免疫原性。研究结果为探究副鸡禽杆菌外膜蛋白lpxM的免疫学特性以及为鸡传染性鼻炎的预防和疫苗的研发奠定了基础。

禽致病性大肠杆菌HlyE蛋白的免疫原性研究

为评估禽致病性大肠杆菌(APEC)溶血素HlyE蛋白的免疫原性,本研究对APEC溶血素HlyE蛋白进行原核表达和纯化,并对表达的重组蛋白进行SDS-PAGE和western blot分析,将纯化蛋白利用透析袋在4℃透析后,利用血琼脂平板对其溶血活性进行检测。SDS-PAGE和western blot结果显示,表达并纯化到分子量约为36 ku的重组HlyE蛋白(rHlyE),经ND-2000超微量核酸蛋白测定仪测定纯化后蛋白浓度为0.65 mg/mL;溶血活性检测结果显示,rHlyE具有溶血活性。以透析后的rHlyE作为抗原,按照50μg/只的剂量免疫小鼠,对照组于相同时间点注射等量PBS,共免疫3次间隔14 d,并于首免后不同时间采血,采用间接ELISA方法检测两组小鼠血清特异性抗体水平,并于三免后18 d以2 LD_(50)的APEC菌液攻毒小鼠,观察7 d内小鼠的死亡情况;于首免后28 d剖杀各组小鼠取其脾脏制备脾淋巴细胞,采用流式细胞术分别检测CD3^(+)、CD4^(+)、CD8^(+)T淋巴细胞亚型比率,对rHlyE的免疫原性进行评估。间接ELISA检测结果显示,该蛋白能够诱导机体产生体液免疫应答,分泌高表达量的IgG抗体,抗体水平于三免后15 d达到最高水平。rHlyE免疫攻毒保护试验结果显示,免疫组小鼠基本无明显临床症状,7 d内存活率达80%;而对照组小鼠表现明显临床症状,于攻毒后3 d内全部死亡。流式细胞术结果显示,与对照组相比,免疫组小鼠的CD3^(+)、CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞亚型比率均升高。上述结果表明,rHlyE在大肠杆菌BL21中为部分可溶性表达,将其免疫小鼠后可诱导小鼠产生较高水平的体液免疫应答,并且可对小鼠产生较好的免疫保护效果。本研究明确了APEC HlyE蛋白的免疫原性,为APEC免疫保护蛋白的筛选以及疫苗研发提供了借鉴与参考。

杆状病毒表达系统表达BCoV纤突蛋白及其对小鼠的免疫原性

旨在为表达牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCoV)的纤突蛋白(S蛋白),并评价其作为免疫原免疫小鼠后的免疫效果。本研究以BCoV/SWUN/HXD-4/2021株的全长S基因为模板,针对昆虫细胞进行密码子优化和合成,构建重组质粒pFastBac-Dual-S,与DH10Bac同源重组后转染昆虫细胞收获重组杆状病毒rpFastBac-S,利用基因组PCR、免疫印迹法(Western blot)和间接免疫荧光试验对其进行鉴定,测定杆状病毒滴度。优化和筛选感染剂量对蛋白表达的影响,超速离心纯化蛋白,免疫小鼠和评估其免疫效果。结果显示:优化后全长4108 bp的BCoV S基因CAI(密码子适应指数)从0.39调整为0.87,平均GC含量从35.8%调整为50.6%。经双酶切、PCR验证,重组质粒与重组杆粒均构建成功。用5μg重组杆粒Bacmid-S转染Sf9细胞并传代至第四代后细胞病变趋于稳定,感染杆状病毒约20 h后产生典型病变,收获重组杆状病毒进行鉴定。PCR电泳结果显示重组杆粒携带S目的蛋白基因;间接免疫荧光试验显示,试验组观察到特异性绿色荧光;Western blot结果显示重组杆状病毒rpFastBac-S所表达的蛋白为S目的蛋白,目的条带位于250 ku左右,感染剂量MOI=0.5时蛋白表达量最高。将50μg蛋白、20μg CpG免疫增强剂与等体积MF59佐剂充分混合乳化后,肌肉注射免疫小鼠,间接ELISA试验结果显示,小鼠免疫蛋白后产生了IgG特异性抗体,且抗体水平高于佐剂对照组(P<0.001),最高抗体效价达1∶12800;微量中和试验结果显示,小鼠血清中和效价最高达1∶224,试验组中和效价平均值高于灭活病毒组,但统计学差异不显著(P>0.05)。本研究利用杆状病毒表达系统表达了牛冠状病毒S蛋白,并对S蛋白免疫保护效果做了进一步评价,为后续牛冠状病毒疫苗研究提供了理论依据。

猪流行性腹泻病毒nsp1、nsp5和N蛋白的重组腺病毒载体的构建及免疫原性比较

为研究猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)nsp1、nsp5和N蛋白的免疫原性,试验以复制缺陷型人腺病毒5型(AdMax系统)为载体,利用PEDV-GDgh毒株(登录号为MG983755),通过PCR方法扩增出GDgh毒株nsp1、nsp5、N基因,并将其连接到腺病毒穿梭载体上,构建重组穿梭质粒。将3个重组穿梭质粒和腺病毒骨架载体共转染至HEK-293A细胞中获得第1代重组腺病毒,分别命名为rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N。用第1代3株重组腺病毒接种HEK-293A细胞,连续传代,通过RT-PCR和Western-blot方法鉴定第3代重组腺病毒,并采用Reed-Muench法计算病毒半数组织培养感染剂量(TCID_(50))。以3株重组腺病毒的第3代病毒液免疫小鼠,收集血清并检测特异性IgG抗体水平。结果表明:试验成功构建出带有nsp1、nsp5、N基因的重组穿梭质粒;分别用重组腺病毒rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N感染正常HEK-293A细胞,可产生典型的细胞病变并观察到荧光信号;目的基因正常转录后得到的目的蛋白可正确表达;3株重组腺病毒rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N的TCID_(50)依次为1×10^(-8.35)/mL、1×10^(-8.50)/mL、1×10^(-7.66)/mL;免疫小鼠后均可产生针对目的蛋白的特异性抗体。说明试验成功构建的3株正常表达目的蛋白的重组腺病毒均具有免疫原性。

阿达木单抗生物类似药和原研药治疗类风湿关节炎的有效性、安全性和免疫原性的Meta分析

目的:系统评价阿达木单抗生物类似药与阿达木单抗原研药治疗类风湿关节炎(RA)的有效性、安全性和免疫原性。方法:通过检索中英文数据库,筛选符合纳入标准、不符合排除标准的随机对照研究,并提取数据,通过偏倚风险评估工具对纳入的研究进行文献质量评价后,采用RevMan 5.4.1统计软件进行Meta分析。结果:共纳入14项研究,10种生物类似药,合计6933例RA患者。结果显示,两组疗效评估美国风湿病学会20%改善标准(ACR20)、抗药抗体阳性率比较差异均无统计学意义;两组总不良反应发生率相比具有统计学差异,试验组总不良反应发生率和严重不良反应发生率较对照组低;亚组分析结果显示均无统计学差异。结论:阿达木单抗生物类似药治疗RA在疗效和免疫原性上与原研药相当,安全性不亚于原研药。