基于多数据集分析骨髓增生异常综合征相关的原发性免疫缺陷核心基因

目的利用生物信息学方法探索骨髓增生异常综合征(MDS)发生发展机制,为筛选早期MDS辅助诊断指标提供理论依据。方法选择来源于Gene Expression Omnibus数据库的人类MDS基因芯片或高通量转录组测序数据,利用R语言及相关包对数据集进行差异表达分析,采用STRING结合CytoHubba分析差异表达基因互作网络关系,并获取degree值前10的核心基因;利用GSEA对数据集进行通路富集,从而获取与显著富集通路相关的核心基因并评价其诊断效能。结果本研究以正常组为对照,对基因芯片数据GSE58831和高通量测序数据GSE114922进行差异表达分析,共筛选74个共同差异基因,其中NFE2、GFT1B及KCNK5在MDS中上调,71个基因在MDS中表达下调;STRING结合CytoHubba共筛选出10个核心基因:IL6、IL7R、CD79A、CD19、RAG1、CXCR4、PAX5、RAG2、EBF1以及DNTT;GSEA分析显示原发性免疫缺陷基因集在MDS组为整体低表达,包含IL7R、CD79A、CD19、RAG1及RAG2;受试者工作特征曲线分析显示CD79A、CD19、RAG1及RAG2均具有较好的诊断效能。结论本研究利用生物信息学初步揭示了原发性免疫缺陷可能是MDS发生发展的重要机制,其中RAG1、RAG2、CD19及CD79A等免疫相关指标具有潜在的辅助诊断价值。

基于纳米ZnO/壳聚糖复合膜DNA电化学传感器用于HIV基因的免标记检测

以室温固相合成法制备纳米ZnO，通过壳聚糖（CHIT）的成膜效应将纳米ZnO固定在玻碳电极（GCE）表面，制得的ZnO／cHIT／GCE电极成为DNA固定和杂交的良好平台。DNA的固定和杂交通过电化学交流阻抗进行表征。以电化学交流阻抗免标记法检测目标DNA，固定于电极表面的DNA探针与目标DNA杂交后使电极表面的电子传递电阻增大，以此作为检测信号可以高灵敏度地测定目标DNA。电化学阻抗谱检测人类免疫缺陷病毒（HIV）基因片段的线性范围为2．0×10^-11～2．0×10^-6mol／L，检出限为2．0×10^-12mol／L。

基于Nafion-AuNPs复合膜的电化学传感器用于HIV基因的高灵敏检测

将合成制备的纳米金粒子(AuNPs),通过Nafion (全氟代磺酸醋)的成膜效应将纳米金固定在玻碳电极(GCE)表面,制得的AuNPs/Nafion/GCE修饰电极成为DNA固定和检测的良好平台。以电化学交流阻抗法检测目标DNA,目标DNA的单链与固定于电极表面的单链DNA探针杂交后使电极表面的电子传递电阻增大,以此作为检测信号可以高灵敏度地测定目标DNA。电化学阻抗法检测人类免疫缺陷病毒(HIV)基因片段的线性范围为1.0 ×10^-11~1.0 ×10^-6 mol/L,检测限为3.0 ×10^-12 mol/L。

FBI-1通过TGF-β1/Smads通路对肺腺癌细胞迁移、侵袭及EMT转化的机制研究

目的 探讨沉默原癌基因人类免疫缺陷病毒短转录诱导物连接因子1(FBI-1)对肺腺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制。方法 qRT-PCR法检测人正常肺上皮细胞株CCD-8L和人非小细胞肺癌细胞株A549中FBI-1 mRNA表达水平。将A549细胞分为对照组、shRNA-NC组、shRNA-FBI-1组、shRNA-FBI-1+TGF-β1组,各组细胞分别转染对应的慢病毒,shRNA-FBI-1+TGF-β1组细胞转染慢病毒后,10 ng/mL转化生长因子β1(TGF-β1)处理24 h,MTT法检测细胞存活率、Transwell实验检测细胞侵袭和迁移能力,蛋白印迹法检测FBI-1、TGF-β1、p-Smad2、上皮钙粘蛋白(E-cad)、神经钙粘蛋白(N-cad)和波形蛋白(Vimentin)相对表达水平。结果 肺癌细胞A549中FBI-1 mRNA表达升高;与对照组和shRNA-NC组比较,shRNA-FBI-1组细胞存活率、迁移和侵袭能力以及FBI-1、TGF-β1、p-Smad2、N-cad和Vimentin蛋白表达降低,E-cad蛋白表达升高(P<0.05);与shRNA-FBI-1组比较,shRNA-FBI-1+TGF-β1组细胞存活率、迁移和侵袭能力、FBI-1、TGF-β1、p-Smad2、N-cad和Vimentin蛋白表达升高,E-cad蛋白表达降低(P<0.05)。结论 沉默FBI-1可抑制肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭,其可能是通过抑制TGF-β1/Smads信号通路发挥作用。

成功治疗以毛细血管渗漏综合征为首发症状的噬血细胞综合征1例并文献复习

噬血细胞综合征(hemophagocytic syndlome,HPS)又称噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(hemophagocytic lymphohistiocytosis,HLH)是一组由各种因素导致淋巴细胞和组织细胞的异常激活,分泌大量细胞因子,累及全身多系统的炎症反应性疾病[1]。分为原发性噬血细胞综合征(primary hemophagocytic lymphohistiocytosis,pHLH)与继发性噬血细胞综合征(secondary hemophagocytic lymphohistiocytosis,sHLH),而后者的发生与感染,自身免疫性疾病,药物使用或肿瘤等多种因素有关[2]。

HIV-1 Tat真核表达载体的构建及在Huh-7细胞中表达

目的构建1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)反式激活因子(Tat)基因真核表达质粒,并研究该质粒在真核细胞中的有效表达。方法以含有HIV-1全长基因的质粒pNL4-3为模板,通过PCR扩增HIV-1tat第一外显子,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入真核表达质粒pCDNA3.1(+),构建重组真核表达质粒pCDNA3.1-tat,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,应用脂质体转染技术转染入人体肝癌细胞系Huh-7细胞。RT-PCR检测其基因转录情况,Westernblot鉴定其是否能够表达相应的目的蛋白质。结果成功扩增了Tat基因,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pCDNA3.1-tat,RT-PCR和Westernblot方法证实该质粒能在Huh-7真核细胞中有效表达HIV-1Tat目的蛋白质。结论成功构建了HIV-1Tat基因的真核表达质粒载体,并在Huh-7细胞中表达,为在Huh-7细胞模型中研究Tat的功能奠定了基础。

PPARγ激动剂通过Akt信号转导通路抑制HIV-1 Tat诱导的血管炎性反应

目的探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)对人类免疫缺陷病毒-1型反式转录激活因子(HIV-1transactivator of transcription,HIV-1Tat)诱导的脑微血管内皮细胞中黏附分子反应的影响及其作用机制。方法将培养的人脑微血管内皮细胞(human cerebral microvascular endothelial cells,hCMEC/D3)给予HIV-1Tat、PPARγ激动剂罗格列酮、PPARγ拮抗剂GW9662、蛋白激酶B(Akt)抑制剂KP3721进行干预,并设立对照组。分别以蛋白免疫印迹法和实时反转录聚合酶链式反应检测hCMEC/D3中细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)蛋白和mRNA表达。结果 HIV-1Tat可诱导黏附分子ICAM-1和VCAM-1的蛋白(P<0.05,P<0.01)及其mRNA表达增加(均P<0.01),PPARγ激动剂罗格列酮可抑制HIV-1Tat诱导的ICAM-1蛋白(P<0.05)与mRNA以及VCAM-1的mRNA表达(均P<0.01),而这种抑制作用可被PPARγ拮抗剂GW9662和Akt抑制剂KP3721逆转(均P<0.01)。罗格列酮可抑制HIV-1Tat诱导的Akt磷酸化反应(P<0.01)。结论 PPARγ可抑制HIV-1Tat诱导的脑微血管内皮细胞中黏附分子反应,Akt信号转导通路在PPARγ激动剂抑制血管内皮细胞炎性反应中起到重要的作用。

HIV-1始祖病毒Vpu和Vif拮抗宿主限制因子的能力

目的研究始祖病毒的生物学和早期进化特征,有助于阐明HIV-1建立感染的关键因素。方法以过表达的方法比较了始祖病毒和同一亚型的慢性感染病毒Vpu蛋白降解宿主限制因子BST-2的能力,利用流式细胞术检测两者对内源性BST-2细胞表面水平的影响。利用已构建的含荧光素酶报告基因的单循环感染始祖病毒表达质粒,比较了始祖病毒与同一亚型的慢性感染株下调BST-2的能力。用过表达的方法检测了Vif蛋白拮抗宿主限制因子h A3G的能力。结果对过表达以及细胞表面内源性BST-2,始祖病毒Vpu蛋白降解宿主限制因子BST-2的能力均显著高于同一亚型的慢性感染病毒。但在始祖病毒拮抗BST-2抗病毒活性的能力分析中,尽管始祖病毒Vpu表现出较强的下调BST-2的能力,仍然不足以拮抗外源过量表达的BST-2的抗病毒活性。在Vif降解hA 3G的实验中,始祖病毒Vif降解h A3G的能力弱于慢性感染病毒p MJ4或与之类似。结论始祖病毒具有更高的拮抗宿主天然免疫的能力,有助于其建立早期感染。

HIV-1 HXB2株Tat核心碱性区多肽Tat_(38-61)的原核表达及其免疫反应性

目的 构建HIV-1 Tat核心碱性区多肽Tat38-61重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白并进行纯化及免疫反应性检测。方法采用PCR法从HIV-1 HXB2株Tat1-101基因中扩增编码Tat38-61的基因序列,克隆至原核表达载体pET32a(+)中,构建重组原核表达质粒pET32a(+)-Tat38-61。转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经Ni2+-NTA柱亲和层析法纯化后,ELISA法鉴定其免疫反应性。结果重组原核表达质粒pET32a(+)-Tat38-61经双酶切及测序表明构建正确;SDS-PAGE分析显示,在相对分子质量约21 300处可见目的 蛋白条带,表达量占菌体总蛋白的67.4%,主要以可溶形式表达;纯化后融合蛋白的纯度可达97%以上;ELISA结果显示,该融合蛋白与兔抗PEPTIDE-Tat1-101血清及HIV阳性血清均呈特异性反应。结论已成功构建了HIV-1 Tat核心碱性区多肽Tat38-61的重组原核表达质粒,表达并纯化了PET32a(+)-Tat38-61融合蛋白,该融合蛋白碱性区表位得到较好的保留,为Tat38-61噬菌体突变文库的构建及亲和筛选奠定了基础。

中国HIV-1 vpr基因多态性及其进化树的分析

目的分析中国各地HIV-1感染者的vpr基因多态性，比较HIV-1 vpr基因变异的基本特征及其与国外以往研究的异同，为进一步探索HIV-1 vpr的致病机理及可能的基因治疗靶位打下基础。方法提取348例中国各地区HIV-1感染者血浆病毒RNA，运用逆转录聚合酶链式反应（RT—PCR）扩增HIV-1 vpr基因，凝胶电泳鉴定后行基因测序。用Blast、ClustalW、Mega4．0等相关生物分析软件进行vpr基因核苷酸和Vpr氨基酸序列分析，并构建进化树，分析中国HIV．1感染者的vpr基因的多态性、变异特征和亚型的分子流行病学特征。结果按vpr基因分型共发现AB、AE、BC、B、C5种HIV-1亚型，分别占2．60％，55．19％，2．60％，18．18％，21．43％，其中AE亚型比例最大。观察到Vpr氨基酸序列有9个变异率大于20％的位点。结论首次分析中国感染者的HIV-1vpr基因多态性及其基因进化树的特征，发现一些vpr变异率较大的氨基酸位点，这些Vpr氨基酸序列的变异与其致病能力的关系有待进一步研究。

云南省德宏和昆明地区高效抗逆转录病毒治疗后HIV-1流行毒株pol区基因变异分析

目的 调查云南省德宏和昆明两个地区HIV-1流行毒株pol区基因在接受HAART后的变异情况.方法 选择接受HAART 1年以上血浆HIV-1病毒载量＞1 000拷贝/ml的139例HIV/AIDS患者,提取血浆中HIV-1 RNA,采用RT-nested-PCR扩增HIV-1的pol区基因蛋白酶（PR）和逆转录酶（RT）基因片段,测定DNA序列.经拼接整理后与美国斯坦福大学网站提供的HIV耐药数据库（Stanford HIV Drug Resistance Database）进行比对,分析耐药突变位点,采用MEGA 4.1构建系统进化树以确定HIV的亚型,结合HIV/AIDS患者流行病学资料进行综合分析.结果 昆明地区患者HIV以T215F/NY/I、M41L/M和T69G/N/I/S/A/D突变较多,突变率分别为39%（24/62）、27%（17/62）和27%（17/62）,高于德宏地区患者HIV的相应突变率[分别为16%（11/69）、13%（9/69）和9%（6/69）],差异有统计学意义（x2值分别为8.646、4.242和7.909,P均＜0.05）.德宏地区HIV-1流行毒株pol区基因亚型主要为CRF01_AE亚型为32%（22/69）、C亚型为25%（17/69）、B亚型19%（13/69）.而昆明地区主要是08_BC亚型60%（37/62）、CRF01_AE亚型21%（13/62）和07_BC亚型15%（9/62）.结论 云南省德宏、昆明两地区HIV-1流行毒株pol区基因PR、RT基因突变频率存在部分差异,昆明地区T215F/N/Y/I、M41L/M和T69G/N/I/S/A/D突变率高于德宏地区.两地共检出HIV-1流行毒株pol区基因CRF01_AE、B、C、BC、08_BC和07_BC共6种基因亚型.

PTD4-Cu,Zn-SOD原核重组表达载体的构建

目的 构建蛋白质转导结构域4-铜锌超氧化物歧化酶（PTD4-Cu,Zn-SOD）原核重组表达载体.方法 利用基因重组技术,设计Cu,Zn-SOD特异性引物和PTD4寡核苷酸序列,Cu,Zn-SOD基因进行PCR反应,产物进行鉴定、回收和纯化,以pET16b为载体,经Xho Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切反应、连接反应和质粒转化,构建pET16b-Cu,Zn-SOD原核重组表达载体,再分别将PTD4基因和pET16b-Cu,Zn-SOD载体经Nde Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切反应、连接反应和质粒转化,构建pET16b-PTD4-Cu,Zn-SOD原核重组表达载体,并进行限制性内切酶谱分析和基因测序.结果 成功构建了长度为6 207 bp的pET16b-PTD4-Cu,Zn-SOD原核重组表达载体,用Nde Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切,得到约5.7 kb的载体片段和约510 bp的PTD4-Cu,Zn-SOD基因片段,与预期结果一致.pET16b-PTD4-Cu,Zn-SOD原核重组表达载体基因测序结果与预期的基因序列相比,碱基序列均正确.结论 成功构建了PTD4-Cu,Zn-SOD原核重组表达载体.