金针菇菌丝体中多糖的分离、结构鉴定及免疫学活性

目的:研究金针菇菌丝体的多糖成分进行理化性质及免疫活性。方法:通过热水提取、去蛋白、除色素、乙醇沉淀得到金针菇多糖(Flammulina velutipes polysaccharides,FVP),再通过离子交换法、凝胶柱层析法进行进一步纯化得到精品FVP-1,FVP-2。运用高效凝胶渗透色谱(HPGPC),柱前衍生化高效液相色谱(PDHPLC),IR和13CNMR等方法测定两种多糖的结构。由淋巴细胞转化试验检测多糖的免疫活性。结果:FVP-1相对分子质量为Mw=1.48×104,FVP-2为Mw=2.73×104。FVP-1单糖摩尔比为葡萄糖(Glc):半乳糖(Gal):甘露糖(Man)=100:2.5:1.5;FVP-2为Glc:Gal:Man:岩藻糖(Fuc)=100:14:7:4。FVP-1主要以[α-D-Glc(1→4)-]为主链,带有α-D-Glc(1→6)分支。FVP-2结构较复杂,存在多种单糖组成,葡萄糖具有α,β两种构型。FVP、FVP-1、FVP-2均有显著的促进细胞增值作用。结论:FVP-1,FVP-2相对分子质量、单糖组成及连接方式均存在差别,其中FVP-2具有更强的免疫增强活性。

日本血吸虫中国大陆株基因重组抗原 Sj22.6kDa 的免疫学活性鉴定

目的：对重组Ｓｊ２２．６ｋＤａ抗原（ｒＳｊ２２．６）进行免疫学活性鉴定，了解其作为疫苗候选抗原的潜力。方法：Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ反应确定ｒＳｊ２２．６的抗原性；将ｒＳｊ２２．６注射家兔，制备特异抗血清；以血吸虫尾蚴对Ｃ５７小鼠进行攻击感染，初步鉴定其免疫保护力。结果：ｒＳｊ２２．６可与特异性抗体发生反应，并刺激家兔产生特异性抗体应答，抗体滴度为１１２８０。攻击感染中，免疫组小鼠的减虫率达７７．２％。结论：ｒＳｊ２２．６具有良好的免疫学活性，在诱导抗日本血吸虫感染方面具有一定的潜力。

藏灵菇发酵乳乳清的抗氧化及免疫学活性研究

藏灵菇培养发酵后,将发酵液加热除去沉淀,获得乳清液,冷冻干燥后得到乳清粉,将其分别配成1%和5%溶液进行小鼠灌胃实验,15 d后,检测昆明种小白鼠力竭游泳时间、血液SOD活性、对鸡红细胞致敏小鼠血清溶血素水平、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性及对二硝基氟苯诱导小鼠迟发型超敏反应的影响。结果表明:5%剂量组的小鼠力竭游泳时间明显延长、红细胞中SOD的活性也明显提高、并能提高血清溶血素水平(P<0.05);而且1%和5%剂量组都具有提高腹腔巨噬细胞吞噬率的作用(P<0.05),这为开发利用藏灵菇提供了新的思路。

猪链球菌2型疫苗候选分子FBP的表达及免疫学活性研究

目的表达SS2纤连蛋白结合蛋白(fibronectin-binding protein,FBP),研究其免疫学活性,探讨其保护活性和作为疫苗候选分子的可能性。方法用PCR技术从SS2临床分离株05ZYH33的基因组DNA中扩增出fbp基因片段,插入表达载体pET-30b(+)中,构建重组表达载体pET30b-fbp。该载体经酶切鉴定和DNA测序鉴定后,转化E.coli.Rosetta,IPTG诱导表达,镍离子亲和层析纯化重组蛋白。Western blot证实目的蛋白的分子量和免疫反应原性。重组蛋白免疫小鼠后收集多抗血清,间接ELISA检测其效价。结果PCR扩增的fbp基因长度约为1700bp,所构建重组表达载体酶切鉴定无误、测序证实碱基序列100%正确且保持正确读框。IPTG诱导表达,目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的10%。亲和层析获得目的蛋白,纯度达80%以上。Western blot检测证实该蛋白能与感染SS2的病人血清发生阳性反应。重组蛋白免疫小鼠后血清效价达1∶25600以上。结论成功构建了表达载体pET30b-fbp,可在工程菌E.coli.Rosetta中表达;表达蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。

香菇多糖微波辅助提取及体外免疫学活性研究

利用微波辅助水浸提法优化影响香菇多糖提取的单因子试验（料液比、浸提温度、浸提时间、微波处理时间等）和多因子的正交试验[L9（34）].结果表明,香菇多糖的最佳提取条件为：料液比1∶30,浸提温度90℃,浸提时间2h,微波处理3min.在此条件下,香菇多糖提取率为4.75%.香菇多糖粗品的体外免疫学研究的结果表明,在25～1600μg/mL的浓度范围内,多糖都具有促进小鼠脾淋巴细胞体外增殖的作用;在25～400μg/mL的浓度范围内,多糖对脾淋巴细胞增殖活性呈现一定的剂量依赖性.

蜗牛多糖的提取和免疫学活性研究

目的提取蜗牛多糖并研究其免疫学活性。方法用碱提醇沉法从江西巴蜗牛中提取多糖,通过溶血空斑实验、巨噬细胞吞噬功能实验、迟发型变态反应和小鼠脾淋巴细胞转化实验研究蜗牛多糖的免疫学活性。结果蜗牛多糖显著增强小鼠溶血空斑形成,提高小鼠巨噬细胞吞噬指数,增强小鼠迟发型变态反应,显著提高小鼠脾淋巴细胞转化率,且有良好的量-效关系。结论蜗牛多糖能提高小鼠的非特异性和特异性细胞免疫功能。

猪瘟病毒四川分离株E2基因的分子克隆、原核表达及免疫学活性分析

分子克隆猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)四川分离株E2基因,并对其进行原核表达及免疫学活性分析。PK-15细胞培养增殖CSFV四川分离株提取总RNA,运用RT-PCR扩增E2基因,定向克隆构建原核重组表达载体,转化E.coli Rosetta-gami-TM(DE3)plysS,IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测蛋白表达,Western blotting分析表达蛋白的免疫学活性。试验结果表明,成功克隆了E2基因,共1119 bp,包含有编码E2蛋白的完整序列,编码373个氨基酸;成功构建了CS-FVE2基因完整阅读框、主要抗原区原核表达载体pET-E2(pe)、pET-mE2(pe);蛋白质电泳结果显示,成功表达出约45.32、28.49 ku两目的蛋白,而且表达的E2(pe)、mE2(pe)融合蛋白均能被CSFV阳性血清所识别,具有良好的免疫学反应活性。因此,本试验成功获得CSFV四川分离株E2基因,表达出具有生物学活性的E2(pe)、mE2(pe)融合蛋白。

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的表达和重组蛋白的纯化及免疫学活性分析

[目的]在基因工程菌中实现猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7基因的高效表达,对表达的重组蛋白进行纯化,并探讨其免疫学活性及应用价值。[方法]将已构建好的重组表达载体pET-ORF7转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG在最适条件下诱导表达,其表达产物用SDS-PAGE和Western Blot进行检测。应用Ni-NTAHis.Bind Resin层析柱在变性条件下纯化表达产物,通过梯度透析进行复性。采用Western Blot及间接ELISA法检测复性后重组蛋白的免疫学活性。[结果]重组质粒pET-ORF7在大肠杆菌中以融合形式成功表达,融合表达产物主要以包涵体形式存在。SDS-PAGE检测所表达的重组蛋白分子量为33 kD左右,与预期大小相符。Band-scan软件对表达蛋白分析发现,表达产物约占菌体蛋白的50%。Western Blot及间接ELISA法显示复性后的重组蛋白与PRRSV阳性血清有特异性结合反应,表明其具有良好的免疫学活性。[结论]该试验将为进一步研制PRRSV单克隆抗体及诊断试剂盒奠定基础。

苦荞过敏蛋白全长基因的克隆、表达及免疫学活性研究

养麦属于一种常见的植物性过敏原。本实验在以往研究的基础上,以苦荞种子总RNA为模板,通过RT- PCR和5'-RACE等方法,扩增、克隆获得苦荞过敏蛋白全长cDNA序列。分析表明,该序列编码一个南515个氨基酸残基组成的功能蛋白,并与甜荞过敏性贮藏蛋白的氨基酸序列同源性达到90%以上。经原核表达及一步亲和纯化后得到纯度较高的重组苦荞过敏蛋白(rTBt)。采用竞争性ELISA对其免疫活性分析显示,目的蛋白与荞麦过敏病人血清中的IgE抗体可以特异结合。

日本血吸虫抗原模拟表位免疫学活性的初步研究

目的 研究从噬菌体 12肽库中筛选得到的日本血吸虫抗原模拟表位的免疫学活性。 方法 以日本血吸虫急感患者血清免疫球蛋白 (Ig)作为靶分子 ,筛选噬菌体 12肽库。经过 3轮吸附 -洗脱 -扩增的淘筛过程 ,在筛选得到的阳性噬菌斑中随机挑取 42个扩增 ,用ELISA检测不同寄生虫病患者和正常人血清 ,以分析其敏感性和特异性。并进一步免疫昆明株小鼠 ,经日本血吸虫尾蚴攻击感染后剖检 ,计算减虫率和减卵率 ,以分析其在小鼠体内诱导的免疫保护性。 结果 在挑取的 42个阳性克隆中 ,有 9个与日本血吸虫急感患者血清有不同程度的结合 (6.2 5 %～ 10 0 % )。除其中 1个灵敏性较低的克隆与其它寄生虫病患者血清有一定的交叉反应外 ,其余均未发现。而经其免疫后的小鼠也分别获得了 2 9.3 %减虫率和 3 5 .9%减卵率。 结论 从噬菌体 12肽库中筛选到的日本血吸虫抗原模拟表位具有较高的特异性和敏感性 ,并能够在小鼠体内诱导一定的免疫保护力。

幽门螺杆菌融合蛋白HspA-UreB的表达和免疫学活性

目的:构建表达幽门螺杆菌(H pylori)融合蛋白HspA-UreB 的重组表达质粒,并研究其免疫学活性. 方法:定向克隆方法将郑州分离Hp菌株MEL-HP27的hspA 和ureB基因融合连接入原核表达载体pET30(a),构建重组表达质粒pET-HU27.该质粒转化大肠杆菌BL21后经IPTG诱导,SDS-PAGE分析融合蛋白HspA-UreB表达情况.Ni2+柱亲和层析纯化融合蛋白,与小鼠免疫血清进行Western blot分析,检测融合蛋白的免疫反应性. 结果:特异PCR法与质粒酶切鉴定证实重组表达质粒pET- HU27构建成功.SDS-PAGE分析显示在82.1 KDa处出现特异蛋白带,占菌体总蛋白的21%,亲和层析法获得纯度为91%的纯化融合蛋白,经免疫小鼠制备的血清可以识别该融合蛋白. 结论:成功构建表达H pylori HspA-UreB融合蛋白的重组表达质粒,表达的融合蛋白具有良好的免疫反应性.

EspA-Stx2A1融合蛋白的表达、纯化及其免疫学活性

目的在原核表达系统中表达肠出血性大肠杆菌O157∶H7(EHECO157∶H7)Ⅲ型分泌蛋白EspA与Stx2毒素A1亚单位(Stx2A1)的融合蛋白,并对表达蛋白进行纯化及免疫学活性检测。方法PCR扩增espA和stx2A1全长基因,利用重叠延伸PCR技术获得espA-stx2A1融合基因,T-A克隆后插入表达载体pET-28a(+),构建原核表达质粒pET-28a(+)-espA-stx2A1,转化大肠杆菌BL21(DE3),分别在37℃和25℃用IPTG诱导表达。以EspA单克隆抗体亲和层析柱纯化目的蛋白,免疫小鼠,检测其免疫原性及抗血清的反应原性,并以天然Stx2毒素攻击,观察保护效果。通过细胞毒试验检测免疫小鼠抗血清的体外中和作用。结果重叠延伸PCR方法扩增出1319bp的融合基因片段,重组表达质粒构建正确;目的蛋白在25℃时的表达量明显高于37℃,约占菌体总蛋白的40%。两种温度下,目的蛋白均主要以包涵体形式存在;纯化后蛋白纯度可达90%。Western blot结果证实,融合蛋白与EspA单克隆抗体和Stx2A1单克隆抗体均发生特异性反应。融合蛋白免疫小鼠制备的抗血清能分别与O157∶H7的EspA、Stx2A发生特异性免疫反应。融合蛋白免疫小鼠能够抵御致死剂量天然Stx2毒素的攻击,保护率达95%。免疫小鼠血清可以中和天然Stx2毒素对HeLa细胞的毒性作用。结论已成功表达了EspA-Stx2A1融合蛋白,纯化的蛋白显示出较好的免疫保护效果,为研制EHECO157∶H7基因工程多亚单位疫苗奠定了基础。

微甘菊次生代谢产物的免疫学活性研究

为了探讨微甘菊次生代谢产物的免疫学活性,用微甘菊水溶性和脂溶性提取物喂食小鼠,用流式细胞仪测定小鼠T淋巴细胞亚群的变化规律,分析微甘菊提取物的免疫学活性。结果显示,微甘菊水溶性和脂溶性提取物均能刺激小鼠CD4+和CD8+细胞的产生,与对照相比,CD4+/CD8+比值均明显增加,水溶性提取物的效果更明显。微甘菊次生代谢产物中可能含有某些刺激动物免疫活性和提高抗癌能力的物质。

鸡贫血病毒细胞凋亡素基因的原核表达及其免疫学活性

将鸡贫血病毒 (CAV)细胞凋亡素基因克隆入表达性载体 p GEX- 5 X- 3,在大肠杆菌中以融合蛋白的形式获得表达。再以表达产物免疫小鼠 ,制备抗 CAV凋亡素的多克隆抗体。以其对 CAV感染的 MSB1细胞作间接免疫荧光试验(IFA)检测呈阳性 ,表明表达产物保留了其相关的天然抗原特性。

硫酸化甲壳素和硫酸化壳聚糖免疫学活性研究

对甲壳素的衍生物———硫酸化甲壳素和硫酸化壳聚糖的免疫学活性进行了实验研究.实验结果表明,硫酸化甲壳素和硫酸化壳聚糖对小白鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能均有促进作用,吞噬率均比对照提高1.5倍,吞噬指数分别比对照提高1.5倍和1.2倍.对处理组和对照组数据做t检验,分别有P=6.915×10-10和P=1.580×10-8,差异均达到极显著水平.

PRRSV GP5基因的优化、表达及其表达产物的免疫学活性分析

PRRSV GP5基因含有一段信号肽及3个跨膜功能区,这些区域可以使翻译的GP5停留在内质网,从而抑制其表达.根据实验室分离测定的PRRSV T1株GP5基因序列进行优化设计,通过人工合成获得GP5-ShortDNA并构建表达载体pGEX-GP5,将其转入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达获得约41kD的目的融合蛋白.通过Western-blot检测,结果显示该融合蛋白可与PRRSV阳性血清发生特异性反应,表明该蛋白具有免疫学活性.研究结果为PRRSV基因工程苗的研究奠定了基础,同时也为基因的优化提供了借鉴.

抗鼠CTLA-4单链抗体的构建与表达及其免疫学活性的鉴定

目的构建具有免疫学活性的抗小鼠细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)单链抗体ScFv(single chain fragment of variety region),为进一步将其应用到动物体内奠定基础。方法采用RT-PCR技术,从分泌抗小鼠CTLA-4单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞中扩增mAb的VH、VL基因,并进一步将其组装成VH-Linker-VL型的ScFv片段。将ScFv片段亚克隆至pGMET载体,测序正确后将其克隆至真核分泌型表达载体pSect2-GFP,将pSect2-GFP-ScFv纯化质粒转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)并进行表达,同时经Zeocin筛选稳定表达株。用Western blot方法检测ScFv融合蛋白的表达,采用ELISA检测ScFv的亲和活性。结果经Zeocin筛选2周后,CHO细胞株可稳定表达GFP-ScFv蛋白。Western blot法证实GFP-ScFv蛋白在细胞上清和细胞裂解液中均有表达,大小约55kD。ELISA检测表明,CHO培养上清中的GFP-ScFv蛋白经浓缩初纯后能与重组小鼠CTLA-4纯化抗原结合,并具有抑制亲本单抗与其结合的能力。结论成功构建了抗小鼠CTLA-4的ScFv真核表达载体,并能有效表达出具有免疫学活性的ScFv融合蛋白。

兔IL-15蛋白在毕赤酵母中的表达及其免疫学活性

用特异性引物扩增出兔IL-15基因片段，用KpnⅠ和NotⅠ双酶切后将其定向克隆到pPICZαA中，构建出重组质粒pPICZαAIL-15。将pPICZαAIL-15用SacⅠ内切酶线性化后，电转化感受态GS115酵母细胞，用PCR法筛选阳性重组子。用1．5％的甲醇诱导重组酵母菌，取培养物上清进行重组蛋白的检测。结果SDS-PAGE电泳可在重组酵母菌培养物上清中检测到分子量为18．6kDa大小的重组蛋白。凝胶薄层扫描分析表明，3株重组酵母菌在1．5％甲醇诱导144h后，重组IL-15表达量约占培养物上清总蛋白量的6．1％-8．6％。将重组IL-15用Ni离子亲和层析纯化后，在MTT试验中表现出明显的促进淋巴细胞的增殖反应，证实表达的重组IL-15具有天然蛋白的免疫学活性。

ctxB和ureB抗原表位的融合表达及其免疫学活性

为研制新型有效的幽门螺杆菌疫苗,设计了一个由ctxB(去除信号肽部分)和ureB抗原表位融合的新型分子。PCR扩增霍乱弧菌的ctxB基因,插入到质粒pET32a上,再将化学合成的ureB抗原表位序列(编码的氨基酸为CHHLDKSIKEDVQFADSRI)连接到ctxB下游,融合基因命名为ctube。将含有融合基因的pET32a转化到大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达后SDS-PAGE测定融合蛋白ctube的分子质量,ELISA法检测ctube对神经节苷脂GM1的结合活性,Western blotting检测对兔抗幽门螺杆菌(Hp)多抗的结合活性。序列分析结果表明,ctube基因全长387bp,编码129个氨基酸,其中ctxB的密码子与GenBank上的序列同源性达到99％。转化后的大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导表达后,产生了一个分子质量为2.5万的蛋白,经肠激酶酶切后的产物为ctube。ELISA试验和West Blotting表明,ctube与神经节苷脂性GM1、兔抗Hp多抗均具有很好的结合活性,有希望成为一个具有抗幽门螺杆菌感染的新的活性分子。

CpG DNA的免疫学活性及在鱼类疾病防治中的应用

研究发现,细菌中的CpGDNA和人工合成的CpGODN可激活T细胞、B细胞、NK细胞等免疫活性细胞,产生多种细胞因子,增强机体的非特异性和特异性免疫,并诱导Th1型介导的免疫反应,是高效、安全的新型免疫佐剂。该文简要介绍CpGDNA的结构特点、免疫学性质以及在鱼类疾病防治中的应用。