基于Me-MLiverpool重组蛋白的新孢子虫胶体金免疫层析检测方法的建立

根据GenBank公布的Nc-livepoor的基因序列,分析Nc-livepoor免疫蛋白的优势线性抗原表位,依据分析结果选取Nc-Liverpool的优势抗原表位集中片段进行串联,构建合成Me-Nc-MLiverpool基因。将该基因克隆至pET-30a(+)质粒中构建重组蛋白质粒pET-30a-Me-Nc-MLiverpool原核表达载体,再进行IPTG诱导表达、分析和纯化及SDS-PAGE和Western blot验证。以0.75 mg/mL的SPA做金标抗原,用纯化后浓度为1 mg/mL的重组蛋白和牛IgG分别做检测线和质控线,建立了检测新孢子虫抗体的胶体金免疫层析检测方法(CGIA)。重组质粒pET-30a-Me-Nc-MLiverpool双酶切验证结果显示,在636 bp的位置有条带,说明重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白大小为39.32 ku;Western blot结果显示,该重组蛋白可与新孢子虫阳性血清特异性识别,表明重组蛋白有较强的反应原性;特异性试验结果显示,新孢子虫CGIA与弓形虫、肝片吸虫、包虫阳性血清不发生交叉反应;敏感性分析显示,GICA可检测出的Nc阳性血清最大稀释倍数为1∶512;对92份牛血清样品进行检测,与商品化的新孢子虫ELISA检测试剂盒检测结果一致,表明建立的GICA准确性较高。综上所述,研究建立的基于新孢子虫Nc-livepoor基因胶体金免疫层析检测试纸条具有较高的灵敏性和特异性,可为新孢子虫病的诊断提供技术支撑。

保健食品中违法添加双氯芬酸钠免疫层析筛查方法的建立

目的为了筛查食品中违法添加的双氯芬酸钠,本研究建立相关胶体金免疫层析检测方法(ICA)。方法以活泼酯机制将双氯芬酸钠连接到不同蛋白质载体,分别合成免疫抗原和检测抗原,免疫家兔获得针对双氯芬酸钠的特异性抗体;抗体标记的胶体金(40 nm)包被在胶体金垫,检测抗原和二抗喷涂在硝酸纤维素膜(NC膜)上,分别构建检测线(T线)和质控线(C线)。组装胶金垫、NC膜、样品垫和吸水垫,组成ICA试剂条。结果在ELISA体系检测双氯芬酸钠的IC50值为9.3 ng·mL^(-1),与8种相关药物交叉反应率都小于0.01%,以ICA试剂条对双氯芬酸钠的最低检测限为2.0 ng·mL^(-1)。IAC试剂对60个市售样品的检测结果,HPLC验证完全吻合。结论本方法简便、价廉、灵敏、特异,适用于筛查食品中违法添加的双氯芬酸钠。

筛查食品中违法添加奥沙普嗪荧光免疫层析方法研究

目的本研究建立了一种筛查食品中违法添加的奥沙普嗪胶体金免疫检测试纸条(ICA);方法以改良活泼酯法将奥沙普嗪发表连接到BSA和OVA,合成免疫抗原和检测抗原,免疫家兔获得针对抗奥沙普嗪抗体;以胶金垫、NC膜、样品垫和吸水垫组装IAC试剂条,以标记抗体的40nm胶体金,分别与NC膜上的检测抗原和山羊抗兔IgG二抗进行免疫反应,形成检测线(T线)和质控线(C线)。结果在ELISA体系检测奥沙普嗪的IC_(50)值为13.2ng·mL^(-1),与8种相关药物交叉反应率都小于0.1%,优化IAC试剂条对奥沙普嗪的最低检测限为2.0ng·mL^(-1)。IAC试剂对30个市售样品的检测结果,与HPLC验证结果吻合。结论本方法灵敏、特异、简便、快速,是对违法添加奥沙普嗪的食品进行筛查的有效工具。