M受体亚型放射配基结合－免疫沉淀分析方法的建立及考核

利用１％洋地黄皂甙溶解大鼠脑匀浆Ｍ受体，用非选择性配基３Ｈ－ＱＮＢ标记可溶性Ｍ受体，以自制的Ｍ１、Ｍ２亚型抗血清和固相二抗分别特异性地免疫沉淀相应的亚型，分析单一受体亚型。对方法进行了考核，包括受体的溶解效率、抗原抗体反应时间、抗血清稀释度、反应温度等对分析结果的影响。对大鼠脑Ｍ受体的试验表明，用两种亚型抗血清进行的免疫沉淀分析呈典型的单位点饱和曲线，抗体对配基与受体的结合反应无影响。

抗人Elp3的N末端抗体制备及在染色质免疫沉淀中的应用

人Elp3(human elongator protein 3,hElp3)具有组蛋白乙酰转移酶活性,是与延伸中的RNA聚合酶Ⅱ结合的elongator复合物的催化亚基,可参与组蛋白的乙酰化修饰与基因的转录延伸.Elp3及其复合物功能异常与人类多种疾病相关.为运用染色质免疫沉淀等手段深入研究Elp3功能,PCR法克隆pYES2-hElp3质粒中编码hElp3的N端亲水区段(1～69氨基酸残基),构建原核表达载体pMXB10-hElp3-210,经IPTG诱导和几丁质柱纯化后,免疫兔制备多克隆抗体.ELISA检测显示,该抗体有较高的效价(不低于1∶2 500).免疫印迹实验结果表明,该抗体可与纯化的及HeLa细胞中的hElp3蛋白特异性结合.运用该抗体对转入elp3Δ菌株的人Elp3的染色质免疫沉淀实验结果表明,人Elp3可参与酵母SSA3基因的转录调控,这可能是人Elp3能够部分补偿酵母SSA3基因延迟表达缺陷的原因.

氢醌对人骨髓单个核细胞TOPO Ⅱα表达的影响及其可能机制

目的:观察苯代谢物氢醌(hydroquinone,HQ)对人骨髓单个核细胞拓扑异构酶Ⅱα(TOPOⅡα)表达的影响,探讨TOPOⅡα在HQ所致造血毒性中的作用及其调控机制。方法:50μmol/L HQ培养10h的正常人骨髓单个核细胞设为实验组,等体积灭菌蒸馏水培养10h为对照组。Western blot测定TOPOⅡα含量的变化,RT-PCR测定TOPOⅡαmRNA表达水平的改变,ChIP技术观察HQ对骨髓单个核细胞TOPOⅡα启动子组蛋白乙酰化、甲基化水平的影响。结果:①与对照组相比,人骨髓单个核细胞50μmol/L HQ处理10h后,TOPOⅡα含量、TOPOⅡαmRNA水平明显下降,差异有显著性(P<0.01);②TOPOⅡα含量降低伴随着TOPOⅡα启动子组蛋白H4乙酰化、组蛋白H3K4甲基化水平的明显降低(P<0.01)、组蛋白H3K9甲基化水平升高(P<0.05),不伴有组蛋白H3乙酰化水平的改变(P>0.05)。结论:HQ能抑制造血细胞TOPOⅡα的表达;组蛋白化学修饰可能在苯代谢物所致的造血毒性中发挥一定的作用。

TOPO Ⅱα启动子调控因子组蛋白甲基化修饰在苯中毒致造血毒性中的作用

目的:研究拓扑异构酶(TOPO)Ⅱα启动子调控因子(SP1、ATF-2、SP3、NF-YA、NF-M、P53、CMYB、C-JUN、ICBP90)组蛋白甲基化修饰在苯中毒致造血毒性中的作用。方法:25例临床慢性苯中毒患者骨髓单个核细胞为病例组,25例正常人骨髓单个核细胞为对照组,染色质免疫沉淀分析(Ch IP)技术探讨TOPOⅡα启动子各调控因子组蛋白甲基化水平的变化,RT-PCR法测定TOPO Ⅱα启动子各调控因子m RNA表达水平的改变。结果:1与对照组比较,病例组TOPO Ⅱα启动子调控因子NF-M、C-JUN组蛋白H3K4甲基化水平下降,差异有统计学意义(P<0.05),SP1、ATF-2、SP3、NF-YA、P53、C-MYB、ICBP90组蛋白H3K4甲基化水平无明显改变(P>0.05);SP1、NF-M组蛋白H3K9甲基化水平升高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),而ATF-2、SP3、NF-YA、P53、C-MYB、C-JUN、ICBP90组蛋白H3K9甲基化水平无明显改变(P>0.05)。2与对照组比较,病例组TOPO Ⅱα启动子调控因子SP1、NF-YA、C-MYB、NF-M及C-JUN m RNA表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),ATF-2、ICBP90 m RNA表达水平不变(P>0.05),SP3、P53 m RNA表达水平则升高(P<0.05或P<0.01)。结论:1慢性苯中毒TOPO Ⅱα启动子调控因子组蛋白化学修饰水平的改变伴随着调控因子m RNA水平的变化。2TOPO Ⅱα启动子调控因子组蛋白甲基化修饰在苯中毒所致的造血毒性中发挥一定的作用。