史氏鲟免疫球蛋白重链可变区序列及多样性

为了研究史氏鲟免疫球蛋白重链可变区基因的组织结构和多样性,采用RTPCR技术从史氏鲟(Acipenserschrenckii)脾脏总RNA中获得了免疫球蛋白重链可变区cDNA克隆,随机挑取31个阳性克隆进行测序。结果表明:所有序列相同率高于75%,前导肽相同率高于90%,应属于同1个VH家族。其变异主要存在于互补性决定区,特别是CDR3区。在D片段序列中发现大量保守的基因序列(motif)。并发现多个VH基因片段可以共用一个J片段的现象。在基因组DNA重排过程中,VH片段可以与任意的D和J片段结合。此外,史氏鲟免疫球蛋白重链可变区的VH,D和J片段的随机重排外,外切核酸酶作用,以及在重排位点大量N,P片段的插入现象,都大大增加了鲟鱼免疫球蛋白的多样性。

新生儿有限的免疫球蛋白重链可变区基因多样性

目的 比较正常新生儿和健康成人免疫球蛋白重链可变区 (IgH)基因的可变区基因片段 (VH)、多样化基因片段 (D)和连接区基因片段 (JH)的使用 ,VH 上的突变 ,N区 -D基因片段 -N区 (NDN)长度以及开放性阅读框 (ORF)等情况 ,探讨新生儿IgH重排基因特征及其多样性。 方法 10例正常足月新生儿脐血和 8例健康成人外周血DNA被抽提 ,IgH基因被扩增、克隆和测序。结果 ①对于VH 和D的使用 ,新生儿和成人相似 ,即VH3使用率最高、VH7使用率最低 ,D2被优先使用 ;而对于JH 的使用 ,新生儿和成人不同 ,即新生儿偏倚使用JH3 ,成人使用JH 则趋向随机化。②新生儿和成人IgH重排基因的VH-D -JH 连接点处均有N区插入 ,但新生儿的NDN长度 [(2 1.2± 5 .7)bp]短于成人 [(2 6 .6± 6 .5 )bp]。③新生儿的IgH基因序列无碱基缺失而成人存在 ;新生儿IgH基因少有体突变 (2 9.2 % ) ,而 77.1%的成人IgH基因存在体突变。④新生儿有ORF的IgH基因序列为91.7% ,而成人为 10 0 %。结论 正常新生儿和健康成人的IgH重排基因序列存在着异型性。新生儿的IgH重排基因已处于活化状态 ,但由于VH,D和JH 的偏倚使用 ,NDN短以及少有突变 ,其多样性有限。

新生儿免疫球蛋白重链可变区基因多样性分析

目的 构建不同胎龄新生儿IgH基因指纹图谱 ,探讨新生儿成熟度对IgH基因谱型多样性的影响 .方法提取 2 7～ 42周新生儿RNA、进行RT -PCR反应、6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染显色 ,获得不同胎龄新生儿IgH基因指纹图谱 ,用Tiger凝胶图像分析仪进行曲线转化和分析 .结果 各家族指纹图谱转化后的曲线下面积积分值 ,在 2 8～ 3 2周、3 3～ 3 6周和 3 7～ 42周新生儿之间无差异 ;但胎龄 2 7周新生儿曲线下面积小于胎龄 2 8～ 42周新生儿 .结论 2 8周可能是人类IgH基因谱型发育由不完善到趋于完善的一个转折点 ,2

早产儿与足月儿免疫球蛋白重链可变区基因异型性

目的 :分析和比较早产儿和足月儿免疫球蛋白重链可变区 (IgH)基因中的可变区基因片段 (VH)、多样化基因片段 (D)和连接区基因片段 (JH)的使用 ,VH 上的体突变 ,在VH D和D JH 连接点插入的NDN长度以及开放性阅读框 (ORF)等特征及其差异性。方法 :7例胎龄为 2 5 30周的早产儿和 8例胎龄为 37 41周的足月儿的脐带单核细胞DNA被抽提 ,使用套式PCR扩增IgH基因 ,扩增产物被克隆筛选和测序。结果 :在早产儿 ,共有 2 0个不同的VH 被使用 ,其中DP73(V3 家族成员 )被最优先使用 ,使用率为 2 1.4% ,其次是DP75 (V1家族成员 ) ,使用率为 19.0 % ,VH 上有少数体突变 ( 16 .7% )。JH6和JH3使用率分别为 42 .8%和 41.7% ,J1未被使用。IgH重排基因的VH D JH 连接点处偶有N区插入 ,DND长度为 15 .5± 7.3bp。6 4 3%的IgH基因序列具有开放性阅读框。在足月儿 ,32个不同的VH 被使用 ,DP73和DP75的使用率分别降到 11.6 %和8.3 % ,VH 上的突变为 2 9.2 %。JH6和JH3使用率分别降至 19.3 %和 34.1% ,J1仍未被使用。IgH重排基因的VH-D -JH 连接点处有少量N区插入 ,DND为 2 2 .6± 6 .8bp。 91.7%IgH基因序列的阅读框是开放的。结论 :胎龄 2 5周以上的早产儿已有IgH重排基因 ,且大部分处于活化状态 ,但由于VH 和JH 的偏倚使用 。

新生儿免疫球蛋白重链可变区基因重排研究

目的探讨不同胎龄新生儿免疫球蛋白(Ig)重链可变区(VH)基因重排情况。方法排除宫内感染的新生儿,其中胎龄27周4例,28～32周9例、33～36周12例、37～42周13例,提取其外周血RNA、进行逆转录PCR(RT-PCR)扩增其IgVH基因、6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染显色。结果各个胎龄VH1～VH7各家族均有多个重排条带表达,同一个VH家族重排基因的平均中分子量在各个胎龄组间差异无显著性。结论27～42周新生儿IgVH基因VH1～VH7家族重排均具有多样性;对同一个VH家族来说,28～42周各胎龄组IgVH基因重排无显著性差异。

逆转录PCR扩增杂交瘤细胞内特异性免疫球蛋白重链可变区基因

目的 利用细胞内逆转录PCR技术扩增杂交瘤细胞内的特异免疫球蛋白重链可变区基因片段。方法 用 10 %甲醛溶液固定杂交瘤细胞 ,以NP 40渗透化处理细胞后做逆转录PCR。结果 获得了大约 3 5 0bp的特异性免疫球蛋白重链可变区基因片段 ,与用同一对引物得到的常规逆转录PCR扩增产物一致。结论 此方法操作简便 ,效率高 ,可用于获得特定结构基因片段 。

细胞内RT－PCR扩增免疫球蛋白重链可变区基因

通常，逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）需要高质量的ｍＲＮＡ，操作过程复杂，效率低且易受到ＲＮａｓｅ的破坏，为了简化操作，提高效率，用１０％甲醛盐溶液固定杂交瘤细胞，以Ｎｐ－４０渗透化处理细胞后做ＲＴ－ＰＣＲ，获得了大约３５０ｂｐ的特异性免疫球蛋白重链可变区基因片段，与用同一对引物得到的常规ＲＴ－ＰＣＲ扩增产物一致．这项技术可用于获得特定结构基因片段，连结并扩增嵌合蛋白基因及构建多克隆免疫球蛋白文库等．

5种鲟鱼免疫球蛋白重链恒定区序列研究

为了探讨几种鲟鱼免疫球蛋白(IgM)所包含的信息与其亲缘和进化之间的关系,分别对俄罗斯鲟(Acipenser.gueldenstaedtii)、小体鲟(A.ruthenus)、施氏鲟(A.schrenckii)、中华鲟(A.sinensis)和欧鳇(Husohuso)的IgM重链(IgH)恒定区进行了研究。采用RT-PCR的方法对IgH核酸序列进行了克隆,通过软件获得了相应的IgH氨基酸序列。在分别对这5种鲟鱼免疫球蛋白重链恒定区4个区(CH1～CH4)进行研究后发现,其CH4区氨基酸序列相似性最高。通过对CH4区序列氨基酸变异期望值(Kaa),物种分化时间(T)及物种间系统进化树(PhylogeneticTree)等参数的分析,将克隆的5种鲟鱼IgH恒定区序列与已发表的西伯利亚鲟同源序列比对(源于NCBI序列)后发现:西伯利亚鲟与俄罗斯鲟、施氏鲟与欧鳇、小体鲟各构成一个分支,并与中华鲟相对。实验结果从体液免疫系统的演化这个角度,反映了被研究的鲟鱼物种间的分类地位、地理分布及进化关系之间的联系。

欧洲鳗鲡免疫球蛋白M重链基因的原核表达与不同组织中表达变化的定量分析

通过RT-PCR技术从欧鳗(Anguilla anguilla)脾脏总RNA中获得了编码成熟免疫球蛋白(Ig)重链的基因序列(GenBank accession No.GQ249838),该序列长1 686 bp,编码562个氨基酸残基,分子质量为62.2 ku。将该基因片段与pET-his载体连接构建原核表达载体,在大肠杆菌BL21中诱导表达,其表达产物经SDS-PAGE和Western-blotting分析表明新增的66 ku蛋白条带与预期值相符,且能够与兔抗欧鳗IgM血清发生强烈的特异性反应,证实了欧鳗免疫球蛋白重链(IgH)基因能够在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达;利用荧光定量PCR检测了Ig基因在欧鳗背肌注射山羊IgG前后不同组织的表达水平,结果显示欧鳗在免疫前后其肾脏与脾脏Ig基因的表达量均明显高于其它组织,在鳃、肌肉中的表达量也较高,而在肝脏、心脏中的表达量较低。此外,对同一组织免疫前后的Ig基因表达量比较发现,除肝脏外,其它组织Ig基因表达水平在免疫后均上升,在鳃和肌肉中达到显著水平,而在脾脏中达到极显著水平。

毛细胞白血病和毛细胞白血病变异型患者免疫球蛋白重链可变区基因分子特征分析

目的:本研究归纳毛细胞白血病(hairy cell leukemia,HCL)和毛细胞白血病变异型(hairy cell leukemia-variant,HCL-v)患者免疫球蛋白重链可变区(immunoglobulin heavy chain variable region,IGHV)基因分子特征,并探讨其与临床特征及预后的相关性。方法:回顾性分析2004年12月至2020年1月在中国医学科学院血液病医院完善IGHV检测的29例HCL患者和15例HCL-v患者临床和生存资料。结果:44例患者共检测出23种重排片段,VH4和VH4-34分别是两种疾病最常见的V区基因家族和重排片段。HCL和HCL-v患者中IGHV为突变状态的比例分别为72.4%和66.7%,发生VH4-34重排(VH4-34 rearrangement,VH4-34+)的患者IGHV突变率更低(P<0.001)。在HCL中,使用VH1基因家族患者脾大发生率更低(P=0.041);而VH4-34+或IGHV未突变状态(IGHV-unmutated,IGHV-UM)的患者具有更高的乳酸脱氢酶(VH4-34+P=0.049,IGHV-UM P=0.022)和β2微球蛋白(VH4-34+P=0.039,IGHV-UM P=0.036)水平,且VH4-34+患者BRAF V600E突变率更低(20%vs.85%,P=0.012)。单因素预后分析显示,VH4-34+是HCL患者无进展生存(progression-free survival,PFS)(P=0.001)和总生存(P=0.004)的不良预后因素,IGHV-UM则为HCL-v患者PFS(P=0.038)的危险因素。结论:HCL和HCL-v患者对VH4基因家族及VH4-34存在偏向性使用,VH4-34+和IGHV-UM间存在明显共现性。在HCL中,VH4-34+与高肿瘤负荷及更差生存相关,而IGHV-UM是HCL-v患者PFS的危险因素。

急性髓系白血病病人免疫球蛋白κ链C区蛋白和趋化因子配体2表达及意义

目的:探讨急性髓系白血病病人免疫球蛋白κ链C区蛋白(IGKC)、趋化因子配体2(CCL2)表达水平及临床意义。方法:选取急性髓系白血病病人80例作为观察组,另选取同期体检健康者40名作为对照组。采用酶联免疫吸附法检测2组病人血清IGKC、CCL2水平,并比较观察组不同分型病人血清IGKC、CCL2水平;Pearson法分析观察组病人IGKC、CCL2水平与降钙素原(PCT)、C反应蛋白(CRP)的相关性;ROC曲线分析血清IGKC、CCL2、PCT及CRP水平对观察组不同分型病人的诊断价值。结果:观察组病人血清IGKC、CCL2、PCT、CRP水平均明显高于对照组(P<0.01);不同WHO分型、ELN分型病人血清IGKC、CCL2、PCT、CRP水平间差异均有统计学意义(P<0.01),其中,M3~M4型、M5~M6型病人血清IGKC、CCL2、PCT、CRP水平均高于M1~M2型(P<0.05);与良好型病人相比,中等型和不良型病人血清IGKC、CCL2、PCT、CRP水平均高于良好型病人(P<0.05)。Pearson相关分析显示,观察组病人血清IGKC与CCL2、PCT、CRP均呈正相关关系(r=0.393、0.302、0.487,P<0.05),CCL2与PCT、CRP均呈正相关关系(r=0.510、0.516,P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,血清IGKC、CCL2诊断M1~M2型及M5~M6型急性髓系白血病水平较高,AUC均达到0.75以上。结论:急性髓系白血病病人血清IGKC、CCL2均呈高表达,二者对急性髓系白血病有一定的辅助诊断价值。

西伯利亚鲟免疫球蛋白M重链区mRNA的组织分布和细菌感染后的表达

根据GenBank登录的西伯利亚鲟Acipernser baerii免疫球蛋白M重链区mRNA（IgHM mRNA）设计引物,进行SYBR green实时定量。结果表明：鲟的脑、鳃、性腺、心脏、后肠、肝脏、肌肉、脾脏8种组织中,IgHM mRNA在脾脏中表达最高,在肝脏和心脏中表达较少,在脑、鳃、性腺、后肠、肌肉5种组织中几乎不表达;在水温22.6～24.5℃时,按100 g体质量注射0.1 mL菌液,给体质量为（260.2±37.8）g的西伯利亚鲟注射浓度为2.0×107CFU/mL的维氏气单胞菌Aeromonas veronii,注射后40 h鱼开始死亡,62 h后停止死亡,注射后直至62 h时,处理组脾脏IgHM mRNA表达量一直处于对照组水平,93 h时处理组脾脏IgHM mRNA显著升高（P〈0.05）,为93 h对照组含量的3.7倍,说明机体已经开始特异性免疫应答。

犬免疫球蛋白IgM重链恒定区基因序列研究

为了探讨犬免疫球蛋白IgM所包含的生物学信息及其与其他物种的亲缘和进化关系,对犬IgM重链恒定区进行了研究。采用3′RACE及RT-PCR方法,获得了犬IgM重链恒定区全长基因（包括分泌型和跨膜型）,犬具有哺乳动物IgM的典型特征,其恒定区包括CH1-CH4 4个区,其中CH3与CH4区序列相对保守,分泌尾的同源性更高,靠近分子的羧基端同源性有增加的趋势。种系发生树分析发现,犬与大熊猫及猫等食肉目动物位于一个进化树分支上。DNAMAN软件分析显示,犬与大熊猫和猫的核酸序列同源性分别为87.88%和81.58%。

哺乳动物免疫球蛋白重链恒定区基因研究进展

免疫球蛋白分子是由2条相同的重链和2条相同的轻链所构成的多肽链结构,其中重链有5种,与之相应的免疫球蛋白分子为5类,整个免疫球蛋白分子可分为恒定区和可变区2部分。由于免疫球蛋白重链恒定区在免疫过程中起多种效应作用,目前已对多种动物的免疫球蛋白重链恒区基因进行了研究,如哺乳动物、鱼类、两栖类、爬行类、鸟类等。了解哺乳动物免疫球蛋白的结构、功能起到了重要的作用,也对了解免疫系统的起源和进化提供依据。

应用原位突变技术构建免疫球蛋白K链可变区基因克隆及表达载体

设计并合成了一对聚合酶链反应（ＰＣＲ）的通用引物，可以从小鼠杂交瘤的ｃＤＮＡ中扩增出免疫球蛋白（Ｉｇ）Ｋ链可变区（ＶＫ）基因。利用这一对引物和原位突变技术，在小鼠的一个ｇｅｎｏｍｉｃＶＫ基因的两端分别引入一个ＤＮＡ限制性内切酶的酶切位点，构建成一个ＩｇＶＫ基因的通用型克隆载体。并将ＶＫ基因片段同人ｋ链基因区基因片段重组，构建成人－鼠嵌合ｋ链基因表达载体。

鱼类免疫球蛋白重链基因与基因座的研究进展

归纳了脊椎动物中报道的所有的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)的种类,重点阐述了鱼类免疫球蛋白重链(heavy chain,H)基因及其基因座的研究进展。硬骨鱼类中目前已发现有IgM、IgD、IgZ/IgT以及一个嵌合体IgM-IgZ,软骨鱼类中目前只报道了3种免疫球蛋白基因,即IgM、IgNAR和IgW。已报道的硬骨鱼类IgH基因座并非都是以传统的"易位子"排列方式进行排列,一般以(VH)n-(D)n-(JH)n-(Cζ)-(D)n-(JH)n-(Cμ)-(Cδ)的形式排列,不同硬骨鱼类的IgH基因座的结构特点、基因座中重链基因的数目以及基因座的拷贝数都存在一定差异。软骨鱼类中IgH基因座则是以"多簇"形式排列,即VH-D-D-JH-CH区段或VH-D-D-D-JH-CH区段在基因组中作为统一体多次复制。在不同种类的硬骨鱼类中,Ig表达器官或组织方面的研究结果并不完全相同,但一般在免疫器官如胸腺、头肾和脾脏中均有表达。目前对鱼类免疫球蛋白的研究尚不全面,要全面阐明鱼类B细胞个体发生、鱼类免疫球蛋白的结构、抗体产生的规律以及这些不同抗体在免疫反应中的作用等,都需要更进一步的研究。

免疫球蛋白重链和T细胞受体γ基因重排在淋巴细胞来源肿瘤中检测的临床意义

目的 探讨克隆性免疫球蛋白重链 (Ig H )和 T细胞受体γ(TCRγ)基因重排在淋巴细胞来源的肿瘤的检测意义。方法 用多聚酶链反应 (PCR)方法检测 15例急性淋巴细胞性白血病 (AL L )、2 5例非霍奇金淋巴瘤(NHL )、10例多发性骨髓瘤 (MM)、4例慢性 B细胞性淋巴细胞性白血病 (B- CL L )和 2 0例正常人骨髓、周围血和(或 )淋巴结中单个核细胞 (MNCs) Ig H、TCRγ基因重排。结果 Ig H和 (或 ) TCRγ基因重排在淋巴细胞来源的恶性肿瘤检出阳性率为 92 .6 % (5 0 / 5 4) ,在 NHL为 84.0 % (2 1/ 2 5 ) ,在 AL L为 10 0 % (15 / 15 )。Ig H重排在 T- NHL和 B-NHL中阳性率分别为 2 0 .0 % (2 / 10 )和 86 .7% (13/ 15 ) ,TCRγ重排在 T- NHL和 B- NHL中分别为 80 .0 % (8/ 10 )和 5 3.3% (8/ 15 )。2 2例 NHL患者骨髓形态学检查阳性率 5 0 .0 % (11/ 2 2 ) ,基因检测阳性率 81.8% (18/ 2 2 ) ,两者差异有显著性 (P<0 .0 5 )。 10例 MM和 4例 B- CL L均检出 Ig H重排。 2 0例正常人未检测出克隆性 Ig H、TCRγ基因重排。结论 Ig H、TCRγ基因重排检测可用于 NHL、AL L、MM和 CL L等淋巴细胞来源的肿瘤的诊断和鉴别诊断 ,并判断 NHL的早期骨髓浸润和临床预后。 TCRγ、Ig H基因重排在 T。

多发性骨髓瘤患者免疫球蛋白重链基因重排的检测及意义

目的 探讨免疫球蛋白重链 (IgH)基因重排在多发性骨髓瘤 (MM)诊治中的应用。方法 采用半巢式PCR技术 ,分别用MM患者的IgH基因的CDR2和CDR3区的两组引物 ,对 6 1份MM患者的骨髓和外周血单个核细胞进行扩增。结果 2 7份骨髓标本中 ,IgH基因重排Fr2A阳性率为 70 .4 % (19/ 2 7) ,34份外周血标本阳性率 5 8.8% (2 0 / 34)。骨髓标本的Fr2A阳性率略高于外周血标本 ,而Fr3A的阳性率两者无明显差异。MM患者的IgH基因重排与Ig型别、临床分期及浆细胞数有关。IgG型IgH基因重排阳性率高于IgA型及轻链型 ;III期患者IgH基因重排阳性率高于I、II期患者 ;浆细胞数大于 5 %时 ,IgH基因重排阳性率略高 ;7例达临床完全缓解的患者中 ,仅有 1例IgH基因重排Fr2A、Fr3A均转为阴性。结论 PCR技术检测MM患者IgH基因重排可作为诊断、疗效观察、预后判断及微小残留病监测的参考指标之一。