西伯利亚鲟免疫球蛋白M重链区mRNA的组织分布和细菌感染后的表达

根据GenBank登录的西伯利亚鲟Acipernser baerii免疫球蛋白M重链区mRNA（IgHM mRNA）设计引物,进行SYBR green实时定量。结果表明：鲟的脑、鳃、性腺、心脏、后肠、肝脏、肌肉、脾脏8种组织中,IgHM mRNA在脾脏中表达最高,在肝脏和心脏中表达较少,在脑、鳃、性腺、后肠、肌肉5种组织中几乎不表达;在水温22.6～24.5℃时,按100 g体质量注射0.1 mL菌液,给体质量为（260.2±37.8）g的西伯利亚鲟注射浓度为2.0×107CFU/mL的维氏气单胞菌Aeromonas veronii,注射后40 h鱼开始死亡,62 h后停止死亡,注射后直至62 h时,处理组脾脏IgHM mRNA表达量一直处于对照组水平,93 h时处理组脾脏IgHM mRNA显著升高（P〈0.05）,为93 h对照组含量的3.7倍,说明机体已经开始特异性免疫应答。

犬免疫球蛋白IgM重链恒定区基因序列研究

为了探讨犬免疫球蛋白IgM所包含的生物学信息及其与其他物种的亲缘和进化关系,对犬IgM重链恒定区进行了研究。采用3′RACE及RT-PCR方法,获得了犬IgM重链恒定区全长基因（包括分泌型和跨膜型）,犬具有哺乳动物IgM的典型特征,其恒定区包括CH1-CH4 4个区,其中CH3与CH4区序列相对保守,分泌尾的同源性更高,靠近分子的羧基端同源性有增加的趋势。种系发生树分析发现,犬与大熊猫及猫等食肉目动物位于一个进化树分支上。DNAMAN软件分析显示,犬与大熊猫和猫的核酸序列同源性分别为87.88%和81.58%。

利用原位杂交技术检测免疫球蛋白重链mRNA在T和B淋巴瘤内的表达

应用原位杂交技术和免疫组织化学法对８例Ｂ淋巴瘤和４例Ｔ淋巴瘤进行了ＩｇＨｍＲＮＡ和ＩｇＭ，κ，λ的检测。结果显示，８例Ｂ淋巴瘤ＩｇＨｍＲＮＡ均为阳性，位于胞核周围，有的ｍＲＮＡ阳性反应成点状位于胞质的一侧。７例胞质中ＩｇＭ，κ或λ为阳性。１例胞质内无ＩｇＭ，κ或λ，但胞核内ＩｇＨｍＲＮＡ阳性反应成点状分布，可能是初级ＲＮＡ转录。在Ｔ淋巴瘤中，只有一例胞核内出现初级ＲＮＡ转录，因为早期Ｔ淋巴瘤，也有Ｄ。

5种鲟鱼免疫球蛋白重链恒定区序列研究

为了探讨几种鲟鱼免疫球蛋白(IgM)所包含的信息与其亲缘和进化之间的关系,分别对俄罗斯鲟(Acipenser.gueldenstaedtii)、小体鲟(A.ruthenus)、施氏鲟(A.schrenckii)、中华鲟(A.sinensis)和欧鳇(Husohuso)的IgM重链(IgH)恒定区进行了研究。采用RT-PCR的方法对IgH核酸序列进行了克隆,通过软件获得了相应的IgH氨基酸序列。在分别对这5种鲟鱼免疫球蛋白重链恒定区4个区(CH1～CH4)进行研究后发现,其CH4区氨基酸序列相似性最高。通过对CH4区序列氨基酸变异期望值(Kaa),物种分化时间(T)及物种间系统进化树(PhylogeneticTree)等参数的分析,将克隆的5种鲟鱼IgH恒定区序列与已发表的西伯利亚鲟同源序列比对(源于NCBI序列)后发现:西伯利亚鲟与俄罗斯鲟、施氏鲟与欧鳇、小体鲟各构成一个分支,并与中华鲟相对。实验结果从体液免疫系统的演化这个角度,反映了被研究的鲟鱼物种间的分类地位、地理分布及进化关系之间的联系。

史氏鲟免疫球蛋白重链可变区序列及多样性

为了研究史氏鲟免疫球蛋白重链可变区基因的组织结构和多样性,采用RTPCR技术从史氏鲟(Acipenserschrenckii)脾脏总RNA中获得了免疫球蛋白重链可变区cDNA克隆,随机挑取31个阳性克隆进行测序。结果表明:所有序列相同率高于75%,前导肽相同率高于90%,应属于同1个VH家族。其变异主要存在于互补性决定区,特别是CDR3区。在D片段序列中发现大量保守的基因序列(motif)。并发现多个VH基因片段可以共用一个J片段的现象。在基因组DNA重排过程中,VH片段可以与任意的D和J片段结合。此外,史氏鲟免疫球蛋白重链可变区的VH,D和J片段的随机重排外,外切核酸酶作用,以及在重排位点大量N,P片段的插入现象,都大大增加了鲟鱼免疫球蛋白的多样性。

新生儿有限的免疫球蛋白重链可变区基因多样性

目的 比较正常新生儿和健康成人免疫球蛋白重链可变区 (IgH)基因的可变区基因片段 (VH)、多样化基因片段 (D)和连接区基因片段 (JH)的使用 ,VH 上的突变 ,N区 -D基因片段 -N区 (NDN)长度以及开放性阅读框 (ORF)等情况 ,探讨新生儿IgH重排基因特征及其多样性。 方法 10例正常足月新生儿脐血和 8例健康成人外周血DNA被抽提 ,IgH基因被扩增、克隆和测序。结果 ①对于VH 和D的使用 ,新生儿和成人相似 ,即VH3使用率最高、VH7使用率最低 ,D2被优先使用 ;而对于JH 的使用 ,新生儿和成人不同 ,即新生儿偏倚使用JH3 ,成人使用JH 则趋向随机化。②新生儿和成人IgH重排基因的VH-D -JH 连接点处均有N区插入 ,但新生儿的NDN长度 [(2 1.2± 5 .7)bp]短于成人 [(2 6 .6± 6 .5 )bp]。③新生儿的IgH基因序列无碱基缺失而成人存在 ;新生儿IgH基因少有体突变 (2 9.2 % ) ,而 77.1%的成人IgH基因存在体突变。④新生儿有ORF的IgH基因序列为91.7% ,而成人为 10 0 %。结论 正常新生儿和健康成人的IgH重排基因序列存在着异型性。新生儿的IgH重排基因已处于活化状态 ,但由于VH,D和JH 的偏倚使用 ,NDN短以及少有突变 ,其多样性有限。

乌鳢免疫球蛋白M重链和免疫球蛋白轻链的克隆与特征分析

应用RACE-PCR方法克隆并鉴定了乌鳢免疫球蛋白M(i mmunoglobulin M,Ig M)重链(H)和免疫球蛋白轻链(L)全长cDNA。乌鳢IgH cDNA全长1 912个核苷酸(nt),包含1 797 nt的开放阅读框,编码598个氨基酸(aa)。IgH恒定区(CH)均包含1对保守的半胱氨酸残基形成链内二硫键,其中CH1区氨基末端存在保守的半胱氨酸残基与轻链形成链间二硫键,4个推测的N-糖基化位点(NXT和NXS)则分别位于CH1、CH2和CH4。序列比对发现乌鳢IgHCH1与CH2交界处氨基酸序列的插入使铰链区肽段较其他硬骨鱼IgH长,此外IgH CH4区羧基末端参与单体间聚合的半胱氨酸被赖氨酸替换,这反映乌鳢IgH分子结构的特异性。序列相似性比较显示乌鳢IgH与点带石斑鱼、黑鳍冰鱼、牙鲆、虹鳟的相似性依次为55%、50%、45%和36%,与斑马鱼类的相似性较低(为28%)。乌鳢IgL cDNA全长941 nt,包含729 nt的开放阅读框,编码242个aa。轻链可变区(VL)和恒定区(CL)均包含保守的半胱氨酸,形成链内和链间二硫键。序列比对分析表明乌鳢IgL与五条鰤和花狼IgL的相似性为78%和77%,而与斑点叉尾鮰和虹鳟的相似性仅为32%和31%。根据IgH和IgL恒定区氨基酸序列构建系统进化树,鱼类IgH形成硬骨鱼和软骨鱼两大分支,其中乌鳢IgH与河豚IgH的亲缘关系较近;硬骨鱼IgL系统树显示3个主要的分支:L1、L2和L3,乌鳢IgL位于L1分支的L1 A亚类。

新生儿免疫球蛋白重链可变区基因多样性分析

目的 构建不同胎龄新生儿IgH基因指纹图谱 ,探讨新生儿成熟度对IgH基因谱型多样性的影响 .方法提取 2 7～ 42周新生儿RNA、进行RT -PCR反应、6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染显色 ,获得不同胎龄新生儿IgH基因指纹图谱 ,用Tiger凝胶图像分析仪进行曲线转化和分析 .结果 各家族指纹图谱转化后的曲线下面积积分值 ,在 2 8～ 3 2周、3 3～ 3 6周和 3 7～ 42周新生儿之间无差异 ;但胎龄 2 7周新生儿曲线下面积小于胎龄 2 8～ 42周新生儿 .结论 2 8周可能是人类IgH基因谱型发育由不完善到趋于完善的一个转折点 ,2

早产儿与足月儿免疫球蛋白重链可变区基因异型性

目的 :分析和比较早产儿和足月儿免疫球蛋白重链可变区 (IgH)基因中的可变区基因片段 (VH)、多样化基因片段 (D)和连接区基因片段 (JH)的使用 ,VH 上的体突变 ,在VH D和D JH 连接点插入的NDN长度以及开放性阅读框 (ORF)等特征及其差异性。方法 :7例胎龄为 2 5 30周的早产儿和 8例胎龄为 37 41周的足月儿的脐带单核细胞DNA被抽提 ,使用套式PCR扩增IgH基因 ,扩增产物被克隆筛选和测序。结果 :在早产儿 ,共有 2 0个不同的VH 被使用 ,其中DP73(V3 家族成员 )被最优先使用 ,使用率为 2 1.4% ,其次是DP75 (V1家族成员 ) ,使用率为 19.0 % ,VH 上有少数体突变 ( 16 .7% )。JH6和JH3使用率分别为 42 .8%和 41.7% ,J1未被使用。IgH重排基因的VH D JH 连接点处偶有N区插入 ,DND长度为 15 .5± 7.3bp。6 4 3%的IgH基因序列具有开放性阅读框。在足月儿 ,32个不同的VH 被使用 ,DP73和DP75的使用率分别降到 11.6 %和8.3 % ,VH 上的突变为 2 9.2 %。JH6和JH3使用率分别降至 19.3 %和 34.1% ,J1仍未被使用。IgH重排基因的VH-D -JH 连接点处有少量N区插入 ,DND为 2 2 .6± 6 .8bp。 91.7%IgH基因序列的阅读框是开放的。结论 :胎龄 2 5周以上的早产儿已有IgH重排基因 ,且大部分处于活化状态 ,但由于VH 和JH 的偏倚使用 。

新生儿免疫球蛋白重链可变区基因重排研究

目的探讨不同胎龄新生儿免疫球蛋白(Ig)重链可变区(VH)基因重排情况。方法排除宫内感染的新生儿,其中胎龄27周4例,28～32周9例、33～36周12例、37～42周13例,提取其外周血RNA、进行逆转录PCR(RT-PCR)扩增其IgVH基因、6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染显色。结果各个胎龄VH1～VH7各家族均有多个重排条带表达,同一个VH家族重排基因的平均中分子量在各个胎龄组间差异无显著性。结论27～42周新生儿IgVH基因VH1～VH7家族重排均具有多样性;对同一个VH家族来说,28～42周各胎龄组IgVH基因重排无显著性差异。

逆转录PCR扩增杂交瘤细胞内特异性免疫球蛋白重链可变区基因

目的 利用细胞内逆转录PCR技术扩增杂交瘤细胞内的特异免疫球蛋白重链可变区基因片段。方法 用 10 %甲醛溶液固定杂交瘤细胞 ,以NP 40渗透化处理细胞后做逆转录PCR。结果 获得了大约 3 5 0bp的特异性免疫球蛋白重链可变区基因片段 ,与用同一对引物得到的常规逆转录PCR扩增产物一致。结论 此方法操作简便 ,效率高 ,可用于获得特定结构基因片段 。

细胞内RT－PCR扩增免疫球蛋白重链可变区基因

通常，逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）需要高质量的ｍＲＮＡ，操作过程复杂，效率低且易受到ＲＮａｓｅ的破坏，为了简化操作，提高效率，用１０％甲醛盐溶液固定杂交瘤细胞，以Ｎｐ－４０渗透化处理细胞后做ＲＴ－ＰＣＲ，获得了大约３５０ｂｐ的特异性免疫球蛋白重链可变区基因片段，与用同一对引物得到的常规ＲＴ－ＰＣＲ扩增产物一致．这项技术可用于获得特定结构基因片段，连结并扩增嵌合蛋白基因及构建多克隆免疫球蛋白文库等．

黄颡鱼免疫球蛋白M重链基因原核表达研究

在前期研究克隆得到黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)全长cDNA的基础上,为进一步研究黄颡鱼免疫球蛋白M(IgM)重链的生物学功能,设计特异性引物PCR扩增获得了编码成熟免疫球蛋白M重链基因的编码序列。将该基因编码片段连接到原核表达载体pQE30中,构建黄颡鱼IgM重链的重组表达质粒IgM-pQE30。该重组质粒经酶切和测序鉴定后,转入表达宿主大肠杆菌M15中诱导表达,在30℃下,经0.2 mmol/L IPTG诱导表达8 h,可获得大量以包涵体形式存在的黄颡鱼IgM重链蛋白,经SDS-PAGE电泳和Western blotting分析表明,新增的62 kDa蛋白条带与预期值相符,且能与鼠源抗6×His的单克隆抗体特异性结合,证明黄颡鱼IgM重链基因获得了高效原核表达。为进一步纯化该蛋白制备特异抗体,研究其生物学功能奠定了基础。

SHM对山羊免疫球蛋白重链表达多样性的影响研究

山羊是重要家畜之一,目前关于其免疫球蛋白基因座的结构和表达多样性机制研究还较少。以西农萨能奶山羊为对象,通过体外克隆其免疫球蛋白重链重组的可变区并与潜在功能胚系基因比对,探究体细胞高突变在山羊免疫球蛋白重链可变区基因表达中的作用和机制。结果表明:山羊免疫球蛋白重链可变区表达过程中体细胞高突变的主要表现形式为碱基突变,插入/缺失突变较少。碱基替换突变偏好发生在A和G碱基,突变频率以A→G最高,其次为G→A和C→T;碱基发生转换的频率高于颠换,嘌呤碱基替换的数目是嘧啶的2倍左右;多数碱基替换发生在体细胞高突变的第二阶段,碱基改变集中在A:T碱基对上。碱基替换突变在可变区不同区域的替换频数表现为CDR2高于CDR1,FR3高于FR1和FR2。碱基的插入/缺失突变主要发生在CDRs,插入/缺失的碱基数目多为3或者3的倍数。总之,山羊免疫球蛋白重链可变区基因在表达过程中存在较为丰富的碱基突变,体细胞高突变是其重链可变区表达谱多样化的重要机制。

毛细胞白血病和毛细胞白血病变异型患者免疫球蛋白重链可变区基因分子特征分析

目的:本研究归纳毛细胞白血病(hairy cell leukemia,HCL)和毛细胞白血病变异型(hairy cell leukemia-variant,HCL-v)患者免疫球蛋白重链可变区(immunoglobulin heavy chain variable region,IGHV)基因分子特征,并探讨其与临床特征及预后的相关性。方法:回顾性分析2004年12月至2020年1月在中国医学科学院血液病医院完善IGHV检测的29例HCL患者和15例HCL-v患者临床和生存资料。结果:44例患者共检测出23种重排片段,VH4和VH4-34分别是两种疾病最常见的V区基因家族和重排片段。HCL和HCL-v患者中IGHV为突变状态的比例分别为72.4%和66.7%,发生VH4-34重排(VH4-34 rearrangement,VH4-34+)的患者IGHV突变率更低(P<0.001)。在HCL中,使用VH1基因家族患者脾大发生率更低(P=0.041);而VH4-34+或IGHV未突变状态(IGHV-unmutated,IGHV-UM)的患者具有更高的乳酸脱氢酶(VH4-34+P=0.049,IGHV-UM P=0.022)和β2微球蛋白(VH4-34+P=0.039,IGHV-UM P=0.036)水平,且VH4-34+患者BRAF V600E突变率更低(20%vs.85%,P=0.012)。单因素预后分析显示,VH4-34+是HCL患者无进展生存(progression-free survival,PFS)(P=0.001)和总生存(P=0.004)的不良预后因素,IGHV-UM则为HCL-v患者PFS(P=0.038)的危险因素。结论:HCL和HCL-v患者对VH4基因家族及VH4-34存在偏向性使用,VH4-34+和IGHV-UM间存在明显共现性。在HCL中,VH4-34+与高肿瘤负荷及更差生存相关,而IGHV-UM是HCL-v患者PFS的危险因素。

免疫球蛋白γ-1重链恒定区在皮肤黑色素瘤中的表达及预后意义

目的:基于TCGA和GTEx数据库探讨人免疫球蛋白γ-1重链恒定区(immunoglobulin γ-1 heavy chain constantreg ion,IGHG1)基因在皮肤黑色素瘤中的表达及其临床价值。方法:应用Wilcox检验和logistic回归分析IGHG1与临床病理特征之间的关系。应用Cox回归和Kaplan-Meier法分析皮肤黑色素瘤患者的临床病理特征与总生存率的关系。使用基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)探索IGHG1基因在皮肤黑色素瘤进展中的潜在机制。结果:与正常皮肤组织相比,皮肤黑色素瘤组织中IGHG1基因呈现高表达。皮肤黑色素瘤患者IGHG1表达量与T分期及临床分期有统计学意义(P<0.001);Kaplan-Meier生存分析表明IGHG1高表达明显优于低表达患者(P<0.001);单因素Cox分析显示IGHG1高表达能改善患者预后(P=0.002);多因素Cox回归分析显示IGHG1表达情况可作为皮肤黑色素瘤患者预后的独立指标(P=0.014)。GSEA显示T细胞受体信号通路、JAK-STAT信号通路等表型和信号通路在IGHG1高表达组发生不同程度的富集。结论:IGHG1表达量与皮肤黑色素瘤患者预后有显著相关性,并参与调节多种免疫学通路,影响肿瘤的发生、发展。

从兔外周血直接克隆IgG重链可变区

目的从兔外周血总RNA中直接扩增出IgG重链可变区基因。方法先从IMGT/GENE-DB数据库中获取编码大耳白兔免疫球蛋白(Ig)重链可变区(VH)的3个胚系基因片段VH(IGHV)、D(IGHD)和JH(IGHJ),以及编码γ重链恒定区(CH)基因Cγ(IGHG)的cDNA序列,然后设计嵌套引物,以兔外周血总RNA为模板,进行RT-PCR和Nested-PCR扩增,产物经胶回收后克隆到T载体,随机挑选白色克隆测序,最后将序列用Bioedit软件的Local Blast功能比对出Cγ的基因型,同时提交到IMGT/V-QUEST分析出所属的VH、D和JH胚系基因。结果获得25个克隆的插入子序列,每个克隆均为兔IgG重链可变区的编码基因,且包含了完整的VH、D、JH胚系基因片段,以及Cγ基因第1个外显子(CH1)序列的5’端部分,但没有任何2个克隆的序列完全相同。37个IGHV功能基因出现了2个;11个IGHD功能基因出现了8个;11个IGHJ功能基因出现了4个。VH-D-JH组合方式共出现18种,即使VH-D-JH组合方式相同,序列仍具有明显的差异。结论从兔外周血总RNA中直接扩增出了IgG重链可变区,自行设计的引物显示出了高度的特异性和良好的兼并性。

乙肝免疫球蛋白抗体的多样性

目的基于重链可变区的编码基因序列对乙肝免疫球蛋白(HBIG)中的IgG抗体进行分类。方法借用文献提供的引物,以HBsAb强阳性健康个体外周血中的总RNA为模板进行RT-PCR和Nested-PCR扩增,通过将产物克隆到T载体、随机挑选测序,分析并统计出插入子的VH-D-JH-Cγ组合方式。结果共获得56个有效克隆,全部为人VH3-D-JH-Cγ序列,可分成49种序列,其中5种序列有2或3个序列完全相同的克隆。4个Cγ功能基因也全部出现,其中IGHG2频率最高(28次);23个VH3功能基因有11个出现,其中频率最高的是IGHV3-23(29次);23个D功能基因有16个出现,其中频率最高的是IGHD1-26(8次);6个JH功能基因则全部出现,其中频率最高的是IGHJ4(33次)。VH3-D-JH组合有33种,频率最高的是IGHV3-23/IGHD1-26/IGHJ4(8次),其中5种与IGHG2拼接,但这5种VH3-D-JH-Cγ2序列仍有明显的差异。结论成功地从HBsAb强阳性健康个体外周血中克隆到由VH3亚家族参与重排的IgG重链可变区序列;初步证实可变区序列不仅在VH3-D-JH-Cγ组合方式上具有极大的多样性,而且在序列上也具有明显的差异性;基于可变区测序对IgG抗体或B细胞进行分类是可行的,但需大大提高挑取克隆的数量或改用新一代大规模测序技术。