影响外周血CD34^+细胞纯化的相关因素

背景:造血干细胞具有良好的自我复制和更新的能力,CD34+细胞具备有造血干细胞的标志。目的:分析影响外周血CD34+细胞纯化的因素。方法:90例患者,经粒细胞集落刺激因子5μg/(kg·d)动员1～3d后,应用COBE血细胞分离机采集外周血单个核细胞液80～100mL,经CliniMACS免疫磁珠分选技术纯化CD34+细胞。结果与结论:90例CD34+细胞平均数为(1.73±1.15)×107,经流式细胞仪分析,CD34+细胞阳性率大于80%。COBE血细胞分离机单次收集的循环血量在980～1100mL时,利于CD34+细胞收集(P=0.005);动员后白细胞浓度在(16～21)×109L-1时,利于CD34+细胞收集(P<0.05);中间细胞和淋巴细胞总比例超11%时,利于CD34+细胞收集(P<0.05);单个核细胞液血小板小于2100×109L-1时,利于CD34+细胞的收集(P<0.05);年龄小于16岁,CD34+细胞数高(P=0.003);CD34+细胞抗体的温度、磁性标记及细胞处理时离心力的大小,均有影响。结果提示,经CliniMACS免疫磁珠细胞分选技术纯化的CD34+细胞能满足临床需要,实验稳定性好,重复性好;注重相关因素的影响,可提高纯化的CD34+细胞数量。

使用链脲佐菌素造模对1型糖尿病大鼠调节性T细胞的影响

目的研究使用链脲佐菌素造模1型糖尿病大鼠发病机制与调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)数量和功能变化的关系。方法使用链脲佐菌素(streptozocin,STZ)对健康SD大鼠造模,分别选取造模成功大鼠和健康大鼠各12只,各项体征均符合成模标准后,分别选取模型和健康大鼠各6只(雌雄各半)解剖,取脾脏、胸腺和外周血使用流式细胞仪检测CD4+CD25+Foxp3+(Tregs)水平状况,剩余大鼠解剖取脾脏分选CD4+CD25+细胞后检测其免疫抑制功能。结果两组大鼠脾脏、胸腺和外周血CD4+CD25+Foxp3+水平比较无统计学差异(P>0.05),自体和异体大鼠CD4+CD25-细胞增殖率比较无统计学差异(P>0.05)。结论使用链脲佐菌素造模的1型糖尿病大鼠调节性T细胞数量和功能无显著变化,其发病机制与Tregs无直接关系。

人鼻咽癌细胞株中肿瘤干细胞分离鉴定方法及肿瘤多药耐药机制

目的:研究人鼻咽癌细胞株中肿瘤干细胞分离鉴定方法及对肿瘤多药耐药机制。方法:取鼻咽癌细胞株(SUNE),进行细胞的培养、传代及鉴定,采用免疫荧光细胞化学技术联合流式细胞仪检测SUNE中CD133^-及CD133^+细胞体外分化能力。利用免疫磁珠分选技术完成CD133^+肿瘤细胞纯化,测定CD133^+细胞体外增殖能力,将其与未分选及CD133^-细胞进行比较。取顺铂、紫杉醇化疗药物,采用CCK^-8法测定CD133^+细胞耐药性。取10只4周龄ICR小鼠,皮下注射人鼻咽癌细胞株和普通细胞株,分析耐药性。结果:分离培养的SUNE在含有血清的培养基中呈贴壁生长,并且生长活跃,培养2~3 d后倒置显微镜下显示细胞呈梭形、扁平状,光泽度良好,培养2周左右细胞融合瓶底80.00%;流式细胞仪检测结果显示:约0.35%细胞表面膜存在抗原CD133。免疫细胞化学显示:SUNE细胞贴壁爬行,部分细胞能与SUNE中的CD133^-相互结合,荧光显微镜下显示呈现橙红色,球状;向经免疫磁珠分选后的细胞中加入培养基,细胞呈单细胞,球形,悬浮生长。随着培养时间的不断延长,细胞开始出现团状生长,体积增加,细胞数量增多,培养24 h后细胞开始贴壁生长,培养7 d后呈串状生长;CD133^+肿瘤细胞、CD133^-肿瘤细胞及未分选细胞随着时间的延长细胞均出现增长,且CD133^+肿瘤细胞增殖能力显著高于CD133^-肿瘤细胞及未分选细胞(P<0.05)。10只小鼠均可见瘤体形成,种植人鼻咽癌细胞株组的瘤体体积显著大于普通细胞株组(P<0.05)。结论:鼻咽癌干细胞中CD133^+对化疗药物的耐药性强。

外周血中自然杀伤细胞分选纯化方法的比较

目的比较荧光激活细胞分选技术（FACS）及免疫磁珠分选技术（MACS）对外周血自然杀伤（NK）细胞分选纯化的效率，为外周血中低比例细胞的深入研究创造基本条件。方法选择20名健康志愿者及3例造血干细胞移植（HSCT）后早期（＋14d）患者，通过FACS及MACS各自分选其外周血中NK细胞。结果分选前健康志愿者外周血NK细胞百分数为（12．86±3．62）％，FACS分选后NK细胞纯度达（96．15±2．03）％，回收率为（95．08±2．16）％；MACS分选后纯度达（93．35±3．61）％，回收率为（94．11±3．01）％。移植后早期患者外周血中NK细胞百分数为（11．01±2．08）％，FACS分选后纯度达（96．22±2．16）％，回收率为（95．27±1．18）％；MACS分选后纯度达（90．98±1．94）％，回收率为（94．54±3．52）％。两种方法分选NK细胞纯度差异有统计学意义（t=5．925，P〈0．05），而回收率差异无统计学意义（t=0．789，P〉0．05）。结论FACS较MACS可以更高效、快速、简便地分离纯化外周血中NK细胞，尤其适于分选移植后早期重建的NK细胞。

CD4^+CD25^+CD127^(dim/-) Tregs细胞在乳腺癌患者外周血中表达及意义

目的研究CD4+CD25+CD127dim/-调节性T(Treg)细胞在乳癌患者和阴性对照组(纤维瘤)患者外周血中表达及意义;探索应用免疫磁珠分选技术分选人(乳腺癌患者)外周血CD4+CD25+CD127dim/-Treg细胞方法及体外培养方法。方法流式细胞术检测15例单纯乳腺癌患者和15例单纯乳腺纤维腺瘤患者外周血CD4+CD25+CD127adim/-Treg细胞表达水平,并行相关性分析;应用免疫磁珠分选技术分选乳腺癌患者外周血CD4+CD25+CD127dim/-Treg细胞;抗CD3包被,CD28,IL-2刺激体外增殖培养,流式细胞术检测纯度。结果乳腺癌患者外周血中CD4+CD25+CD127dim/-Treg细胞阳性率明显大于乳腺纤维瘤(P<0.05);乳腺癌患者外周血免疫磁珠分选CD4+CD25+CD127dim/-Treg,细胞计数板计数细胞量为4×105个,细胞流式检测阳性率为94.16%,体外增殖培养5 d后细胞计数为1×106个,流式检测CD4+CD25+CD127dim/-Treg细胞阳性率为90.09%。结论CD4+CD25+CD127dim/-Tregs细胞可能是乳腺癌发生发展的重要因素之一,调节性T细胞可以作为区别乳腺良恶性肿瘤生物学行为具有重要参考价值的标记物;应用免疫磁珠分选技术分选,抗CD3包被,CD28,IL-2刺激体外增殖培养后可获理想纯度CD4+CD25+CD127dim/-Tregs细胞,为进一步研究乳腺癌患者外周血Tregs细胞的TCR CDR3分子特征奠定基础。

不同细胞因子组合对人自然杀伤细胞体外高纯度扩增的实验研究

目的探讨人自然杀伤细胞（NK）高效扩增培养技术，以获得一种优化的诱导扩增临床应用级别NK细胞的方法。方法提取健康人外周血单个核细胞（PBMCs），应用免疫磁珠分选法（MACS）阴性分离出高纯度的CD3-CD56＋CD16＋NK细胞，采用X-VIVO培养基，在均含有白细胞介素（IL）-2、CD3单抗的基础上用不同的细胞因子组合对其进行体外扩增和诱导。采用细胞计数法、流式细胞术免疫表型分析比较NK细胞增殖后的数量与NK细胞纯度。结果IL-7／IL-15／IL-21的优化组合刺激NK细胞增殖的效果为最佳，培养18d可使经免疫磁性珠阴性纯化的NK细胞扩增124倍，使未经纯化的PBMCs细胞增殖108倍。在NK细胞纯度方面，培养18d可使经免疫磁性珠阴性纯化的NK细胞扩增后的CD3-CD16＋CD56＋NK细胞纯度达81．5％，CD3-CD16＋CD56＋NK细胞阳性率为10．3％，NK细胞总纯度为91．8％；使未经纯化的PBMC细胞扩增后的CD3。CDl6＋CD56＋NK细胞纯度达22．1％，CD3＋CDl6＋CD56＋NK细胞阳性率为33．5％，NK细胞总纯度为55．6％。而单用不同细胞因子IL-7、IL-15、IL-21对NK细胞扩增数量和纯度均有所不同。结论采用X-VIVO培养基，在IL-2、CD3单抗的基础上加IL-7／IL-15／IL-21的优化组合刺激NK细胞增殖的数量和纯度达到最佳效果，所产生的NK细胞质量可满足临床细胞免疫治疗抗肿瘤应用的需要。