磁珠富集法提高外周血HIV DNA检测灵敏度的研究

目的建立外周血人免疫缺陷病毒脱氧核糖核酸(HIV DNA)磁珠富集检测方法,并评估该方法在提高HIV感染患者早期抗病毒治疗(early antiretrovital treatment,ART)后外周血中HIV DNA检测灵敏度中的应用价值。方法采集1位HIV感染窗口期(window period,WP)即开展ART患者4个不同时间点的外周全血,Ficoll法分离外周全血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC),阴性分选富集PBMC中CD4^(+)T淋巴细胞,应用HIV DNA检测试剂盒检测磁珠富集组和全血组HIV DNA浓度。结果采用免疫磁珠富集法从PBMC中分离纯化CD4^(+)T细胞,经流式细胞仪测定纯度达到(96.4±2.6)%,0.4%台盼兰染色细胞活力为(95.9±2.9)%。治疗后,在追踪的不同时间点,发现患者血浆中HIV RNA载量逐渐下降,至第4个追踪时间点,血浆中不再检出HIV RNA。全血组4个时间点,HIV DNA定量结果均未检出;磁珠富集组CD4^(+)T淋巴细胞HIV DNA定量结果分别为:73.4、429.3、137.1、449.9 copies/106个CD4^(+)T细胞。结论磁珠富集法更加灵敏高效检出血液标本中极限低拷贝HIV DNA,为HIV WP感染、ART治疗后突破感染提供早期确证依据。

免疫磁珠富集结合酶联免疫吸附法检测酱油中黄曲霉毒素B_1

将活泼酯法活化后的羧基化超顺磁珠与辛酸一硫酸铵法纯化的抗黄曲霉毒素B，单克隆抗体偶联，获得黄曲霉毒素B，（AFB。）免疫磁珠。比较不同粒径大小的免疫磁珠的富集效率，优化磁珠偶联抗体的条件以及富集AFB。的反应条件，初步建立了以免疫磁珠富集结合酶联免疫吸附法检测酱油基质中的AFB，的方法。结果表明：酶联免疫吸附法在0．05～0．3gg／kg范围内具有良好的线性关系，相关系数为0．9842。在酱油中添加加1-7μg／kgAFB，的平均加标回收率为83．6％～104％，相对标准偏差为7．2％～13．7％。该方法具有快速简便、设备简单、灵敏度高、准确性好等优点，可很好地应用于酱油中的AFB，的快速检测。

应用免疫磁珠富集法江西省首次检出肠出血性大肠杆菌O_(157):H_7

肠出血性大肠杆菌O157:H7是一种新型的致病性大肠杆菌,能引起人类出血性腹泻和溶血性尿毒综合征,也是一种人畜共患病,国际上比较一致的观点是认为牛、猪等动物是出血性大肠杆菌O157:H7的主要传染源,为了解江西省肠出血性大肠杆菌O157:H7的分布及流行情况,我们进行了初步调查,现将结果报告如下.

免疫磁珠阴性富集法在恶性胸腔积液细胞块制作中的应用

目的:探讨应用免疫磁珠阴性富集法制作恶性胸腔积液细胞块的可行性及其应用价值。方法:收集确诊为肺腺癌的胸腔积液57例,每例标本平均分成两份,分别用传统直接离心沉淀法(A法)和免疫磁珠阴性富集法(B法)制作细胞块,对两种方法获得的细胞块的HE染色、免疫组化效果及提取DNA的合格率、EGFR基因突变检测结果进行比较。结果:免疫磁珠阴性富集法的HE、免疫组化效果均优于传统的直接离心沉淀法;直接离心沉淀法提取的DNA浓度普遍高于免疫磁珠阴性富集法;直接离心沉淀法和免疫磁珠阴性富集法提取DNA的合格率分别为96.61%(57/59)和98.31%(58/59),两者差异无统计学意义(P>0.05);免疫磁珠阴性富集法EGFR基因突变阳性率为59.32%(35/59),高于直接离心沉淀法的54.24%(32/59),两者差异无统计学意义(P>0.05)。结论:应用免疫磁珠阴性富集法制作恶性胸腔积液细胞块的方法可行,在HE染色、免疫组化以及后续的分子病理检测与传统的直接离心沉淀法相比较均显示出较大的优势。

免疫磁珠法分离乳腺癌患者外周血CD4^+CD25^+CD127^(dim/-)调节性T细胞的研究

本研究采用免疫磁珠法（MACS）分选乳腺癌患者外周血CD4＋CD25＋ CD127dim／－ T regs细胞，流式细胞术检测分选纯度以找到稳定的分选方法。

密度梯度离心联合上皮细胞黏附分子免疫磁珠富集法检测卵巢癌循环肿瘤细胞及其与肿瘤复发转移的相关性

目的检测卵巢癌患者外周血中循环肿瘤细胞(CTCs)与肿瘤复发转移的相关性。方法采集50例卵巢癌患者的外周血,应用密度梯度离心联合上皮细胞黏附分子免疫磁珠富集法检测外周血中的CTCs的数目,并比较其与患者临床特征之间的关系。结果 50例卵巢癌患者中32例为CTCs阳性,CTCs阳性与远处转移(P<0.05)和复发密切相关(P<0.05),而与性别、年龄、肿瘤部位、TNM分期、肿瘤分化程度及淋巴转移无关(P>0.05)。结论 CTCs可以预测卵巢癌远处转移和复发。

免疫磁珠法富集循环肿瘤细胞研究进展

循环肿瘤细胞富集为肿瘤的分期诊断、判断复发、分析预后和制定个体化治疗的有力向导。本文综述了免疫磁珠法富集肿瘤细胞的原理,肿瘤细胞检测的方法比较及常用的细胞表面标志物和目前临床上的实际应用方面的进展。

优化CD45免疫磁珠阴性筛选法提高循环肿瘤细胞富集效率的实验研究

目的探讨优化CD45免疫磁珠阴性筛选法对循环肿瘤细胞(CTC)的富集效率。方法利用SW620细胞和健康供体血液样本模拟CTC,加入SW620细胞数分别为50、75、100个,基于细胞角蛋白和上皮细胞黏附分子双抗体染色的CD45阴性筛选法进行CTC富集。比较常规方案正常剂量与高剂量CD45混合物+免疫磁珠富集SW620细胞的效率,以验证CD45混合物和免疫磁珠是否可以通过结合更多的白细胞和包绕更多的CD45^(-)肿瘤细胞来降低肿瘤细胞富集效率;进一步比较优化方案(对含有贴壁CD45^(+)白细胞的试管再次洗脱和磁场分选)与常规方案富集SW620细胞的效率。结果在常规方案中,正常剂量CD45混合物+免疫磁珠富集SW620细胞的平均效率为65.5%,高于高剂量CD45混合物+免疫磁珠的58.3%。采用优化方案富集SW620细胞的平均效率为82.8%,高于常规方案的61.9%。结论优化CD45免疫磁珠阴性筛选法能提高CTC富集效率。

免疫磁珠法分选胚胎大鼠脑神经干细胞的初步研究

目的 :探索应用免疫磁珠间接阳性法分选神经上皮干细胞蛋白 (nestin)阳性的神经干细胞群的实验条件 ,为研究神经干细胞的特性与神经干细胞的培养和移植研究创造有利条件。 方法 :制取胎鼠大脑组织细胞悬液 ,免疫磁珠法分选胎鼠脑神经干细胞 ,以流式细胞术检测阳性细胞纯度 ,以锥虫蓝染色法检测细胞活性。 结果 :该法分选的 nestin阳性细胞纯度为93.0 %～ 99.7% ,其中活性细胞为 92 %～ 97%。结论 :免疫磁珠法分离胎鼠脑神经干细胞群落简便、有效 ,可以为神经干细胞细胞培养和移植提供细胞来源 ,也为研究高纯度神经干细胞的特性提供了实验基础。

磁珠富集法开发毛竹SSR标记引物

用磁珠富集法筛选毛竹基因组DNA的SSR分子标记,利用磁珠法对毛竹基因组DNA的AFLP片段进行了富集,分别构建了富含GT、AG、CCA重复基元的富集文库,利用克隆PCR法对文库进行筛选,检测菌落数分别为1080、620、630个,阳性菌落中含目的重复的序列分别为137、73、41个,富集效率分别为12.7%、11.8%、6.5%。双碱基重复的富集效率高于三碱基富集效率。根据获得的序列结果,设计了53对SSR引物,其中31对引物在毛竹中成功扩增出目的大小的条带,扩增成功率为58.9%。

磁珠富集法筛选西施舌微卫星序列

采用生物素-磁珠吸附微卫星富集法(FIASCO)筛选西施舌(Coelomactra antiquata)微卫星分子标记。结果获得含有重复次数不少于5次的微卫星序列38个,其中完美型占68.4%,非完美型26.3%,混合型5.3%。除探针中使用的CA和GA 2种重复外,还得到ATTG、CGTG和TGTTG的重复序列。微卫星重复次数主要集中在5～46次,最高为70次。利用这些微卫星序列设计了14对引物。该研究筛选出的微卫星标记为进一步研究西施舌的遗传多样性提供帮助。

磁珠富集法制备莲藕基因组的微卫星分子标记

采用磁珠富集法FIASCO，设计生物素标记的寡核苷酸Biotin-（AG）13作探针，分离莲藕（Nelumbo nucifera Gaertn．）的微卫星分子标记，从所获得的阳性克隆中选取42个测序，结果36个克隆（85．0％）含有微卫星序列，其中23个（63．9％）重复数在10以上，19个（52．8％）为完美型。设计并且合成24对微卫星引物，经筛选其中16对为有效引物（66．7％），能扩增出多态性条带。

应用免疫磁珠法分离大肠杆菌O_(157)H_7

目的 :进一步探讨免疫磁珠法 (IMS)分离大肠杆菌 O1 5 7H7(E.O1 5 7H7)的敏感性。方法 :应用 IMS检测该菌的主要贮存宿主动物 (家禽、家畜 ) E.O1 5 7H7感染情况 ,同时用传统分离法作对照。结果 :家禽 (畜 )粪便中 E.O1 5 7H7分离率分别为鸡 2 .38% (2 / 84)、牛 9.5 2 % (4 / 42 )、猪 2 .41% (2 / 83) ,鸭、鹅、狗、驴和羊的粪便中未分离到 E.O1 5 7H7;传统法均未从上述家禽 (畜 )粪便中分离到 E.O1 5 7H7。结论 :据本次检测结果 ,表明 IMS分离 O1 5 7能提高检测的灵敏度 (检测水平为 2 cfu/ g,传统法为 2 0 0 cfu/ g) ,并缩短检测时间 1天 ,是开展 E.O1 5 7H7病原学分离 (包括人间和宿主动物的流行病学监测 )

磁珠富集法筛选方正银鲫的三、四核苷酸重复微卫星DNA

通过生物素磁珠富集法开发方正银鲫(Carassius auratus gibelio(Bloch))三、四核苷酸重复的微卫星,并与传统的放射性同位素杂交法相结合,进行二次筛选微卫星分子标记。结果显示:对652个阳性克隆进行测序分析,获得微卫星序列800个,其中完美型542个(67.75%),非完美型140个(17.50%),混合型118个(14.75%)。用引物设计软件primer3plus在线设计引物163对,选择合成76对,引物多态性通过二倍体野生鲫群体进行检测。检测结果显示,30对引物表现出不同程度多态性,等位基因数在3～8之间,多态信息含量(PIC)在0.4066～0.8023之间,其中80%为高度的多态性位点(PIC>0.5),表明方正银鲫微卫星文库是个高质量的文库。

磁珠富集法分离小黄李基因组微卫星DNA片段

将微卫星探针5′端生物素化后与链亲和素磁珠特异结合,用磁珠和探针的结合物与两端连接已知序列人工接头的中国李品种小黄李(Prunus salicinacv.Xiaohuangli)基因组DNA酶切片段杂交,以此杂交片段为模板用人工接头序列为引物进行PCR扩增,根据PCR产物测序结果设计引物作为微卫星DNA的标记引物.结果在随机挑选的36个克隆进行菌落PCR检测时,从31个阳性克隆中挑选18个克隆进行测序后获得了12条特异序列,设计的8对SSR引物均在5个中国李受试品种上获得了预期的扩增产物,其中4对引物在受试品种上表现出多态性.

采用Percoll密度梯度及免疫磁珠法分离人骨髓巨核细胞

目的 探讨一简单、快速的获得高纯度骨髓巨核细胞的方法。方法 采用Percoll密度梯度法获取富集巨核细胞 ,采用抗血小板球蛋白Ⅱb Ⅲa单克隆抗体和免疫磁珠法获得进一步纯化的巨核细胞 ;用台盼蓝活性测定及Wright Giema染色及抗GpⅡb/Ⅲa组织化学染色确定。 结果 此法可获得的巨核细胞纯度达 90 %以上 ,结构完整 ,大约 5 0 %巨核细胞具有生物活性 ,可作短期培养。

基于磁珠富集法开发并筛选西川红景天的微卫星标记

利用FIASCO磁珠富集法,开发和筛选青藏高原特有珍贵植物西川红景天(Rhodiola alsia)多态性微卫星标记。结果表明:用(AG)15和(AC)15两种微卫星标记探针构建富集文库,共获得阳性克隆约2500个;从中随机挑取1200检测,发现具有多态性的阳性克隆达400个;随机挑取200多态性的阳性克隆进行测序,从中获得105个SSR位点,用在线软件primer3-2.3.4成功设计得SSR引物105对;其中45对可以成功扩增,而13对所扩增的片段在相距较远的4个自然居群的24个个体中显示较高的遗传多态性。用4个居群的80个个体检测这13对引物发现,平均等位基因数(A)约为9.192,观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)均值分别约为0.712和0.734,如此高的多态性已经满足后期研究的需要;数个位点在某些居群中显著偏离哈迪温伯格平衡(P<0.01),这可能是实际研究的居群并不能达到哈迪—温伯格定律所假设的无限大等理想状态所致。结合此前基于表达序列标签(Expressed Sequence Tag,EST)序列开发的SSR多态性位点,该研究结果为今后利用SSR位点开展西川红景天的居群遗传结构分析和其他研究提供了一组有效工具。

应用免疫磁珠法分离脐血CD_(34)^+造血细胞

目的：分离脐血CD细胞，以了解其造血增殖活性。方法：应用免疫磁珠法（Isolex50系统）分离脐血CD细胞，并对其实验方法进行了改进。结果：常规方法CD纯度较低，经过改进，脐血CD细胞由分离前的（1．39±0．76）％增加至（59．46±17．35）％，CD细胞富集倍数为（62．31±55．19）倍。分离后组分CFU－GM、BFU－E、CFU－Mix较分离前分别增加了（41．05±15．77）、（13．14±8.66）及（34．80±19．58）倍，而阴性组分所形成的集落显著减少。结论：免疫磁珠法可以有效地分离CD细胞，造血祖细胞集落大多来源于CD细胞。

磁珠富集法筛选实验豚鼠微卫星分子标记

目的直接从实验豚鼠基因组DNA中筛选获得微卫星分子标记。方法应用磁珠和生物素标记的微卫星探针与豚鼠基因组酶切片段杂交,捕获200～1000 bp含有微卫星序列的DNA片段,连接到pMD-18V载体中,转化到感受态细胞E.coli DH5α中构建富集微卫星序列的小片段插入文库。然后用PCR法进行筛选。结果从约2000个转化子中获得240个阳性克隆。对其中98个进行了测序,并成功设计豚鼠微卫星引物17对。结论经过优化的磁珠富集法能够稳定、高效地获得豚鼠微卫星标记。本研究获得的微卫星位点将成为豚鼠遗传学研究的有力工具。

PCR-SBT 与 IMS-ELISA 法在强直性脊柱炎患者 HLA-B27检测中的比较

目的：比较聚合酶链反应-直接测序法（polymerase chain reaction sequence-based typing，PCR-SBT）和磁珠酶联免疫法（immunomagnetic separation and enzyme-linked immunosorbent assay，IMS-ELISA）检测人类白细胞抗原 B27（human leukocyte antigen B27，HLA-B27）在强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）临床诊断中的价值。方法应用 PCR-SBT法和 IMS-ELISA 法对120例疑似 AS 患者外周血进行 HLA-B27检测。以 SPSS17.0软件的配对χ^2检验和受试者工作特征曲线下面积对两种方法检测 HLA-B27在 AS 诊断中的价值进行评价。结果120例疑似 AS 患者中，PCR-SBT 和 IMS-ELISA 法 HLA-B27检测阳性率分别为45.83％（55／120）和37.50％（45／120）。两种方法检测 HLA-B27差异有统计学意义（χ2＝59.455，P ＝0.000）。PCR-SBT 法敏感度和特异度分别为96.36％和96.92％；IMS-ELISA 法的敏感度和特异度分别为69.09％和89.23％。两者的 AUC 分别为0.966和0.792。结论与 IMS-ELISA 法相比，在 AS 的临床诊断中PCR-SBT 法检测 HLA-B27的敏感度和特异度更高，方法更优。