抗PCV4 Cap蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立可应用于猪圆环病毒4型(PCV4)候选疫苗特异性抗体检测与评价方法,本研究应用PCV4 Cap蛋白作为抗原,以PCV4多克隆兔源抗体作为一抗,优化各反应的最佳条件并建立了针对PCV4 Cap蛋白抗体的间接ELISA方法。最佳条件为2μg/m L PCV4 Cap纯化蛋白,4℃包被过夜,5%脱脂乳封闭60 min,待检血清稀释比例为1∶800,反应条件为37℃、45 min,酶标抗体稀释比例为1∶5000,反应条件为37℃、60 min,底物显色时间为10 min,Cut of f值为0.157,灵敏度可达102400倍。成功建立的抗PCV4Cap蛋白抗体间接ELISA检测方法具有良好的敏感性、重复性和特异性。可为检测PCV4候选疫苗的特异性抗体水平提供一种精准、高效的方法。

基于重组IBDV VP3蛋白的免疫磁珠间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用

本研究旨在毕赤酵母中表达鸡传染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)的VP3蛋白,以重组VP3蛋白作为包被抗原建立IBDV血清抗体免疫磁珠间接ELISA检测方法并进行初步应用。利用毕赤酵母表达系统获得约为39 ku的重组VP3蛋白,Western-blotting检测表明,重组VP3蛋白具有良好的特异性和反应原性。免疫磁珠间接ELISA的最佳反应条件:磁珠和抗原偶联的缓冲液是50 mmol/L MES(p H 8.0),偶联时间为3 h,抗原加入量为95μg,抗原与羧基磁珠最大偶联量为80μg。待检血清和酶标二抗的稀释度分别为1∶1 600和1∶4 000,血清孵育时间为30 min,酶标二抗孵育时间为20 min。在该优化条件下,阴性、阳性临界值判定标准为0.134。特异性试验显示,对抗AIV、IBV、MDV、NDV阳性血清检测结果均为阴性。敏感性试验显示,本试验所建立的检测方法敏感性高于商品化IBDV血清抗体检测试剂盒。重复性试验显示,批内和批间重复试验的最大变异系数分别为3.8%和5.9%。稳定性试验结果显示变异系数小于7%。用建立的检测方法和商品化IBDV血清抗体检测试剂盒同时检测50份血清,结果显示两种检测方法的相对敏感性为94.6%,相对特异性为92.3%,符合率为94.0%。本试验建立的检测方法具有敏感性高、特异性强、重复性好、稳定性高特点,为其应用于临床IBDV血清抗体的检测奠定了基础。

布鲁氏菌外膜蛋白OMP10间接ELISA检测方法的建立及免疫原性评估

目的建立布鲁氏菌外膜蛋白OMP10间接ELISA检测方法,评价OMP10在小鼠体内的免疫效果。方法本研究表达和纯化了布鲁氏菌外膜蛋白OMP10,通过Western Blot进行验证,建立了OMP10间接ELISA检测方法,然后将OMP10与弗氏佐剂和LDH佐剂配伍成2种亚单位疫苗,免疫小鼠后检测抗体水平、脾脏淋巴细胞的增殖水平、CD4^(+)和CD8^(+)T细胞比值以及细胞因子分泌,最后通过攻毒试验评估OMP10的免疫保护效果。结果OMP10作为诊断抗原的特异性和符合率均高于70%;免疫小鼠后2种亚单位疫苗均能产生高滴度的IgG抗体,CD4^(+)/CD8^(+)T的比值均高于PBS对照组,IFN-γ高于PBS对照组,差异具有统计学意义(P<0.01),但IL-4未发生明显变化,表明OMP10能够诱导很好的体液免疫及Th1型免疫应答。免疫保护结果显示,2种亚单位疫苗免疫组小鼠脾脏指数和脾脏载菌量低于布鲁氏菌M5感染组,差异具有统计学意义(P<0.01),表明OMP10蛋白配伍的亚单位疫苗对布鲁氏菌M5感染小鼠具有高度的保护作用。结论外膜蛋白OMP10在布鲁氏菌诊断和疫苗方面具有一定的应用价值。

基于免疫磁珠净化间接竞争酶联免疫吸附试验检测氟喹诺酮类药物

本研究旨在建立一种基于免疫磁珠进行分离、富集和净化前处理,检测鸡肉、鸡肝和鱼肉中氟喹诺酮类药物残留的间接竞争酶免疫吸附试验(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,icELISA)的研究方法。通过对合成免疫磁珠及免疫磁珠净化过程中单克隆抗体添加量、偶联时间、缓冲液pH、抗原添加量、抗原捕获时间、温度及包被条件等进行优化,初步建立了基于免疫磁珠净化的icELISA检测方法。结果显示:1)在1 mg的磁珠中,沙拉沙星(sarafloxacin,SAR)单克隆抗体最佳偶联量为15μg,偶联时间60 min,pH为4.4;2)最佳抗原添加量为1 ng·mL^(-1),捕获时间40 min,缓冲液为0.01 mol·L^(-1)PBS,IC50为0.73 ng·mL^(-1),线性范围为1.0~3.2 ng·mL^(-1);3)氟喹诺酮类药物在鸡肉、鸡肝、鱼肉的检测限均不超过1.33、2.17、2.31μg·kg^(-1),回收率为76.83%~98.70%,批内变异系数批间变异系数均不超过15%,经验证,鸡肉样本检测结果与高效液相色谱法(HPLC)结果一致。结果表明,与传统仪器检测方法相比,该方法提高了检测氟喹诺酮类药物的简便性、选择性以及检测效率,为氟喹诺酮类药物的残留检测提供了新思路。

间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清4型鸭疫里默氏杆菌抗体的研究

应用超声波裂解法制备的血清4型鸭疫里默氏杆菌(RA)裂解物作为抗原包被酶标板,成功建立了4型RA抗体检测的间接ELISA法。

改良凝集试验(MAT)与间接血凝试验(IHAT)和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测弓形虫抗体的比较分析

为了评价用于检测弓形虫抗体的改良凝集试验 (MAT)、用MAT、间接血凝试验 (IHAT)、酶联免疫吸附试验 (ELISA)对动物和人的血清进行检测 ,比较阳性检出率与符合率 ,并对检测的结果进行统计分析。结果显示 :MAT和IHAT、MAT与ELISA检测动物和人血清的阳性检出率都无显著差异 (P >0 0 5 )。MAT与IHAT检测动物血清的总符合率为 78 7% (5 9 75 ) ,检测人血清的总符合率为 81 6 % (71 87) ;MAT与ELISA检测动物血清的总符合率为 74 0 % (5 4 73) ,检测人血清的总符合率为 79 3 % (6 9 87)。应用配对资料卡方检验分析显示 :MAT与IHAT、MAT与ELISA检测的结果一致。因此 ,检测弓形虫抗体的MAT与IHAT和ELISA具有良好的符合性 ,这 3种方法都能用于弓形虫抗体的常规普筛和血清流行病学研究。

防龋DNA疫苗免疫效能评价中间接ELISA检测的建立和验证

目的:建立血清样本特异性抗体检测的间接ELISA方法,应用于龋齿DNA疫苗特异性抗体效力检测。方法:通过棋盘滴定确定样本检测条件建立血清特异性抗PAc抗体间接ELISA方法,并对所建立的方法进行特异性和精密度验证。结果:确定包被PAc蛋白浓度为10mg/L,酶标抗体工作浓度1∶5000,样本稀释倍数1∶200。方法的重复性检测表明,板间和板内误差小于15%;中间精密度高、中、低3个浓度的CV值小于15%。结论:该方法特异性强,具有良好的重复性和中间精密度,可用于防龋DNA疫苗免疫效能评价中血清样本特异性抗PAc抗体的检测。

副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体检测试剂盒的研制与应用

【背景】副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是猪的上呼吸道病原菌,引起格拉瑟氏病,主要引起断奶前后和保育阶段的猪发病,通常见于5—8周龄的青年猪,发病率一般为10%—15%。该菌有15种血清型,目前主要养猪国家流行的血清型为4型、5型、12型和13型,是严重危害养猪业发展的主要细菌性病原之一。目前国内还没有检测该菌抗体的商品化试剂盒。【目的】研制一种针对副猪嗜血杆菌的快速、敏感和特异性强的抗体检测试剂盒,为格拉瑟氏病的有效防控提供技术支持。【方法】表达并纯化OppA、DppA、HbpA 3种不同的副猪嗜血杆菌ABC转运体周质底物结合蛋白,使用副猪嗜血杆菌阴、阳性参考血清筛选以上3种蛋白中免疫反应性和反应特异性好的蛋白。以筛选的蛋白为包被抗原,建立检测HPS抗体的间接ELISA方法,优化间接ELISA反应条件,并组装试剂盒。在此基础上,确定该试剂盒的敏感性、特异性;通过对不同时间、不同猪场采集的2000份临床猪血清样本进行检测,评价该试剂盒的实用性;在以上临床血清样本中随机选取200份,分别以研制的试剂盒、间接血凝试验以及进口商品化试剂盒进行检测,比较检测结果,验证该试剂盒的符合率;最后,使用研制的试剂盒检测免疫和攻毒猪采集的血清,评价该菌免疫后的抗体消长规律。【结果】成功表达并纯化了OppA、DppA、HbpA 3种蛋白,发现OppA免疫反应性和反应特异性最好。经过反应条件优化,确定OppA包被浓度为1μg·mL-1,封闭液为0.5%的BSA-PBS溶液,样品稀释液为1%的BSA-PBST溶液,样品孵育时间为30min,样品稀释度为1﹕50,酶标二抗孵育时间为30min,底物作用时间为15 min,临界值为0.18;试剂盒的敏感性和特异性为96.67%,能与国内常见血清型HPS阳性血清反应而不与猪其他常见病原阳性血清发生交叉反应;2000份临床血清样本阳性检出率为34.65%;随机抽取200份血清样本,与间接血凝试验的符合率为92.50%,与进口商品化试剂盒符合率为87.00%,符合率较高;使用试剂盒检测免疫和攻毒后不同时间采集的猪血清,HPS抗体消长规律符合预期。【结论】研制的副猪嗜血杆菌ELISA抗体检测试剂盒特异性高、敏感性强,与商品化试剂盒和间接血凝试验的符合率高,可用于临床HPS抗体检测和疫苗免疫效果评价。

应用间接ELISA检测四川某猪场的猪瘟免疫抗体

猪瘟（CSF）是由猪瘟病毒（HCV）引起的一种急性、高度接触性传染病，是目前给养猪业造成损失最直接和危害最严重的疾病之一。据2005年余广海、何明清、董清华等人报道，四川省某猪场发生猪瘟，10日龄内和断奶前后仔猪（15-60日龄）发病率较高，育肥猪发病较少，怀孕母猪多表现为繁殖障碍。欧美的许多国家通过制定和执行猪瘟的防制和根除计划，已经成功消灭了猪瘟，

大熊猫源犬细小病毒VP2基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

【目的】建立一种检测大熊猫血清中犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)抗体的间接酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法。【方法】以大熊猫源CPV DNA为模板,利用PCR扩增VP2基因,再用原核表达系统对VP2基因进行表达,经纯化后的蛋白作为ELISA包被抗原;制备并纯化兔抗大熊猫IgG,采用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记作为间接ELISA酶标二抗,通过棋盘法确定抗原包被质量浓度及血清稀释度等条件,并评估建立方法与商业试剂盒检测样品结果的符合率。【结果】原核表达成功获得约70 ku的VP2蛋白,将其作为间接ELISA包被抗原,抗原最佳包被质量浓度为2.0μg/mL,血清最佳稀释度为1∶400,用该方法进行检测血清样品时OD450≥0.258为阳性,反之为阴性。采用建立的ELISA方法检测大熊猫血清样本阳性率为60.0%,高于商业化检测试剂盒检测的阳性率(52.5%),两者总符合率达到87.5%。【结论】本研究首次建立了基于大熊猫源CPV VP2蛋白为抗原、自制HRP标记兔抗大熊猫IgG为酶标二抗的间接ELISA方法,该方法特异性强、灵敏性较高、重复性好,为大熊猫血清中CPV抗体的检测提供了技术支持。

ELISA法和间接免疫荧光法诊断自身免疫疾病的临床对照

目的:对ELISA法和间接免疫荧法诊断自身免疫疾病的效果进行分析。方法:将2016年10月至2017年10月我院收治的40例患有自身免疫疾病患者作为此次研究对象,在入组后利用随机分组的方式将其分为A组与B组,A组患者采取ELISA法对抗核抗体进行检测,B组患者采取间接免疫荧光法对抗核抗体进行检测,并对检测结果进行分析。结果:A组患者检出抗核抗体为(2.58±0.57);B组患者检出抗核抗体为(0.65±0.65)。组间比较差异显著(P<0.05)。结论:ELISA法在诊断自身免疫病中有着重要的应用价值,有效的提高了对抗核抗体检测的林敏度及特异度,值得推广。

牛支原体灭活疫苗免疫程序及母源抗体消长规律研究

为评价不同剂量的自主研发牛支原体灭活氢氧化铝佐剂疫苗对怀孕母牛免疫后抗体消长规律和免疫效果,本试验选择产前30~15d围产母牛70头,随机分为7组,每组10头牛,间隔15d,采用不同剂量免疫,定期采集初乳和犊牛血清,采用已建立的牛支原体间接ELISA检测方法检测初乳乳清和犊牛血清中的抗体滴度,统计分析其抗体消长规律。结果表明,使用自主研发牛支原体灭活氢氧化铝佐剂疫苗免疫怀孕母牛无红肿、发热等症状,是安全可靠的;用不同剂量疫苗免疫怀孕母牛,初乳乳清抗体中牛支原体Ig G抗体水平在奶牛分娩后3h达到一个峰值,随着奶牛产后时间的延长抗体水平呈逐步下降,在奶牛产后96h,抗体值均在0.3以下;A组的抗体最低,B组、C组、D组抗体均低于E组和F组;E组和F组抗体滴度较高,两者无差异。不同剂量疫苗免疫母牛所产犊牛哺食初乳后,犊牛血清中牛支原体Ig G抗体在犊牛出生后24h达到最高,随着犊牛日龄的增加,抗体滴度呈现逐步下降趋势;在A组、B组和C组抗体呈现层次不齐的状况,D组抗体水平高于A组、B组、C组,低于E组和F组;E组和F组抗体水平较高,且维持时间较长。研究结果为牛支原体疫苗的免疫程序制定提供了科学依据。

间接ELISA法研究高效猪瘟细胞苗免疫效果

猪瘟作为中国最主要的猪病之一，在中国导致的经济损失难以统计，专家估计猪瘟导致中国猪的平均发病死亡率在2％～5％，据此推算的直接经济损失每年就超过20亿元人民币。高效猪瘟疫苗免疫措施成为当前有效防控猪瘟的重要手段。

间接ELISA法检测猪瘟疫苗免疫效果

猪瘟作为我国重要的传染病之一，严重危害着养猪业的健康发展和猪场的效益空间。科学的选择和使用疫苗成为目前防控猪瘟的重要手段，而定期监测和科学评估对猪瘟疫苗的选择和使用有着重要的指导意义。本文采用间接ELISA法对安徽百绘牧业猪瘟防控效果进行评估，旨在帮助猪场合理的选择疫苗，科学的制定免疫程序，不断提升猪场猪瘟免疫效果。

间接免疫荧光法和ELISA法在检测地方性落叶型天疱疮(巴西天疱疮)细胞间抗体时的敏感性

Background: Since 1967 dermatology has used the classic technique of indirect immunofluorescence (IIF) for the detection of autoantibodies against antigens of the skin in diseased people with endemic pemphigus foliaceus. Thirty years later enzyme-linked immunosorbent assays -ELISA (rDsg1 and rDsg3) appeared as a viable option. A group of highly recognized researchers have concluded that ELISA is a simple, sensitive and highly specific method, allowing for diagnostic differentiation between pemphigus vulgaris (PV) and endemic pemphigus foliaceus (EPF). Scientific literature certifies that both ELISA and IIF bear high sensitivity in spite of the fact that a direct comparison between the ELISA and IIF tests has never been performed. Objectives: This study was conducted to compare the sensitivity of these tests in detecting antibodies in the EPF. Material and methods: Thirty-two serum samples were collected from patients with EPF. The control serum of 15 healthy individuals was tested to detect the presence of antibodies of EPF by indirect immunofluorescence and ELISA (rDsg1 and rDsg3). The IIF was performed, taking human skin as a substrate. Results: Antibodies in patients with EPF were detected more commonly by the ELISA (rDsg1) (91%) compared with IIF (81%). Conclusions: The ELISA (rDsg1) is slightly more sensitive than IIF in detecting antibodies related to EPV. However, according to our results, we do not currently possess a test with 100%accuracy in differentiating EPF from PV. Although previous studies have associated Dsg3 with PV, the tests performed during this study showed that 12%(4/32) of patients with EPF (cutaneous diseases only) also had Dsg3 antibodies.

以原核表达的非洲猪瘟病毒pK205R蛋白为包被抗原的间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立快速检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的血清学方法,本研究原核表达ASFV pK205R重组蛋白,并以其为包被抗原,通过反应条件优化,建立了一种快速的ASFV间接ELISA检测方法。结果显示,原核表达的ASFV pK205R蛋白约为44 ku,western blot证实表达蛋白具有良好的反应原性;以其作为包被抗原建立的ASFV抗体间接ELISA方法仅对ASFV血清检测为阳性,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、副猪嗜血杆菌及猪大肠杆菌阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性;该方法检测灵敏度为1∶2 560;批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%;利用该方法对临床样品检测的结果与国外商品化试剂盒检测结果符合率为100%。本研究建立的ASFV抗体间接ELISA方法为防止该病传入我国以及ASFV的实时监测提供技术储备。

禽波氏杆菌免疫荧光检测和抗体检测ELISA方法的建立与应用

采用改良的Wooldridge法提取了禽波氏杆菌外膜蛋白(OMP),通过Bradford方法测定禽波氏杆菌OMP含量为320μg/mL,SDS-PAGE电泳检测发现禽波氏杆菌P5株OMP含有5种成分,相对分子质量分别为58、47、41、36、24 ku;P8株OMP含有6种成分,相对分子质量分别为58、47、41、38、211、6 ku。将提取的禽波氏杆菌OMP免疫健康青紫兰兔,每周免疫1次,共免疫4次,获得了兔抗禽波氏杆菌OMP高免血清,以此高免血清建立了检测禽波氏杆菌的间接ELISA和间接免疫荧光(IFA)方法,并对其工作条件进行了优化和筛选,试验结果表明间接ELISA抗原、抗血清最佳工作浓度分别为10μg/mL、1∶12 800,酶标二抗工作浓度为1∶5 000,最佳包被条件为4℃2、4 h,最佳封闭条件为37℃1、h;间接免疫荧光(IFA)兔高免血清释释度为1∶20,FITC标记羊抗兔IgG稀释度为1∶10,感作时间为45 min时,禽波氏杆菌特异性黄绿色荧光最清晰,非特异性荧光最弱。经临床检测证明该两种方法均具有简便、快速、特异性强的特点,为禽波氏杆菌病的流行病学、血清学调查和临床快速诊断奠定了基础。

三种重组蛋白混合抗原的间接ELISA法检测人血清弓形虫IgM和IgG抗体

目的比较弓形虫rSAG1、rHXGPRT和rAK三种重组蛋白作为混合抗原在弓形虫病血清免疫诊断中检测结果与进口试剂盒检测结果的差异,评价三种重组蛋白混合抗原检测在弓形虫病免疫诊断中的应用价值。方法收集经美国产Zeus Toxo-ELISA试剂盒筛选的阳性血清136例,阴性血清30例。复苏、诱导、表达含有弓形虫pET-28a/SAG1,pET-28a/HXGPRT和pET-28a/AK表达载体的3个菌株,纯化3种重组蛋白。以3种混合蛋白作为诊断抗原,采用间接ELISA法,以正交叉方法优化检测条件,检测66例弓形虫IgM阳性、70例IgG例阳性血清和30阴性血清,比较混合抗原检测和Zeus Toxo-ELISA试剂盒检测结果的差异;以Zeus Toxo-ELISA弓形虫试剂盒检测结果为标准,评价重组蛋白混合抗原检测的敏感性、特异性、总符合率以及约登指数。结果 IgM:混合抗原与Zeus Toxo-ELISA试剂检测结果经χ2检验,χ2值为3.12,P>0.05,差异无显著性。混合重组抗原的敏感性为89.4%,特异性为96.7%,总符合率为91.7%,约登指数为0.861。IgG:混合抗原与Zeus Toxo-ELISA试剂检测结果经χ2检验,χ2值为0.25,差异无显著意义(P>0.05)。采用混合重组抗原的敏感性为97.1%,特异性为93.3%,总符合率为96.0%,约登指数为0.904。结论本研究3种重组抗原(rSAG1+rHXGPRT+rAK)混合的间接ELISA法检测弓形虫IgM和IgG,与进口ELISA试剂检测的总符合率高,具有较高的敏感性、特异性;更经济。

应用重组信号蛋白14-3-3间接ELISA诊断日本血吸虫病

目的探讨重组日本血吸虫信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3)间接ELISA用于血吸虫病免疫诊断的价值。方法表达并利用纯化的rSj14-3-3与成虫抗原(SjAWA)间接ELISA法分别检测51份急性和49份慢性日本血吸虫病患者和50份正常人血清,以上血清标本同时用SEA致敏的间接血凝试验(SEA-IHA)检测。再以3种方法检测30份华支睾吸虫感染者、24份卫氏并殖吸虫感染者和31份钩虫感染者血清,分析其交叉反应性。结果51份急性和49份慢性血吸虫病患者血清的rSj14-3-3抗体阳性率分别为98.0%和91.8%;SjAWA的检出率分别为96.1%和90.0%;IHA的阳性率分别为98.0%和93.9%。经统计学分析,以上结果无显著性差异(P>0.05)。Sj14-3-3间接ELISA、SjAWA间接ELISA和SEA-IHA对于30份华支睾吸虫感染者的交叉反应性分别为13.3%、20.0%和16.7%,24份卫氏并殖吸虫感染者分别为8.3%、12.5%和12.5%,31份钩虫感染者分别为12.9%、16.1%和12.9%。经统计学分析结果也无显著性差异(P>0.05)。结论rSj14-3-3抗原间接ELISA法诊断日本血吸虫病,具有高度的敏感性和特异性,可用于血吸虫病的免疫诊断。