人肝细胞癌中N－ras、c－myc癌基因的表达──原位分子杂交和免疫组织化学研究

为了明确Ｎ－ｒａｓ、ｃ－ｍｙｃ癌基因在人肝细胞癌（ＨＣＣ）中的表达及其形态学分布，我们对３８例石蜡包埋的ＨＣＣ（其中３３例带有癌周肝组织）标本进行了原位核酸杂交和免疫组化研究。结果表明，ＨＣＣ及癌周肝组织中Ｎ－ｒａｓ表达阳性率分别为４２％和３９％；ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ阳性表达率分别为４７％和３６％；ｃ－ｍｙｃ蛋白阳性率分别为５３％和３９％。ＨＣＣ与癌周肝之间Ｎ－ｒａｓ、ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ及ｃ－ｍｙｃ蛋白表达水平无显著差别；ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ及蛋白阳性强度也无显著差别，其形态学分布基本一致，主要集中于癌细胞和癌周肝中的部分高度增生结节；Ｎ－ｒａｓ表达增强主要见于癌细胞、癌周肝中的高度增生结节、小细胞性不典型增生及少部分肝小多角细胞。它们与ＨＢｘＡｇ表达之间无明确的对应关系。上述结果显示，ＨＣＣ中Ｎ－ｒａｓ、ｃ－ｍｙｃ表达都显著增强，它们可能是人ＨＣＣ发生中较晚期的事件，而Ｎ－ｒａｓ表达增强早于ｃ－ｍｙｃ癌基因活化。

牙胚组织中成釉蛋白表达免疫组织化学和原位杂交的特点

目的:观察人牙胚组织中成釉蛋白的表达特点。方法:实验于2002-02/04在解放军第四军医大学口腔内科实验室完成。取孕5个月流产男性胎儿(产妇知情同意),截取上、下颌骨,常规方法制备人牙胚组织石蜡切片。用兔抗人AMBN多克隆抗体,对人牙胚组织石蜡切片和正常狗牙周组织石蜡切片进行免疫组织化学染色。标记人成釉蛋白cDNA探针,对人牙胚组织石蜡切片进行原位杂交。结果:①免疫组织化学染色发现成釉蛋白由内釉上皮细胞在分化为成熟成釉细胞前开始表达,分泌期成釉细胞高度表达并持续整个釉质形成期,新形成的牙釉质染色阳性;成牙本质细胞在分泌牙本质基质之前开始表达成釉蛋白,在牙本质形成过程中成牙本质细胞持续表达成釉蛋白,呈弱阳性,前期牙本质中呈弱阳性染色;上皮根鞘细胞染色阳性。狗牙周组织染色发现牙骨质表层细胞呈强阳性染色,新形成的牙骨质中可见阳性染色颗粒,呈网状分布。②对人牙胚组织石蜡切片的原位杂交显示,成釉蛋白在成釉细胞、成牙本质细胞、上皮根鞘细胞中有表达,表达部位与免疫组织化学结果一致。结论:内釉上皮首先表达成釉蛋白,之后前成牙本质细胞达成釉蛋白。成釉细胞、成牙本质细胞、上皮根鞘细胞表达成釉蛋白。

稀土离子荧光及其在免疫分析和核酸探针中的应用

稀土离子特别是钐(Sm^(3+))铕(Eu^(3+))铽(Tb^(3+))镝(Dy^(3+))能发出强的荧光。由于激光技术的发展,自六十年代起,人们对稀土离子的荧光进行了深入的研究,弄清了稀土离子荧光机理、荧光特点和影响因素。近年来,国内外学者把稀土离子的荧光应用到生物学和医学的研究上,为稀土的应用提供了广阔的前景。 一、稀土离子的荧光特点 游离的稀土离子的荧光是相当微弱的。当稀土离子与有机配位体(如β-二酮类。

应用核酸酶免疫试验中探针的熔解温度差异检测已知突变位点

目的:探索建立一种利用核酸酶免疫试验中探针的熔解温度差异检测已知突变位点的方法。方法:目的靶基因经扩增后,5’末端标记洋地黄毒苷(digoxigenin,Dig)的等位基因探针与已结合在酶标板上的扩增产物杂交,其杂交的探针鄄DNA二聚体的碱基错配与未错配之间存在变性温度差异。选择适宜的熔解温度进行已知突变位点的检测,并利用酶联免疫吸附试验对标记探针进行识别、放大和结果判断。结果:实验结果表明,当熔解温度为37℃时,扩增产物的加样量为5μl/孔和检测探针加入量为10pmol/孔时所测得A450值为0.800～0.923。等位基因检测探针的熔解温度为53℃,P1、P2与靶DNA结合率分别为86%和16%。当P1、P2按不同比例杂合时,其与结合率存在着明显的线性关系(r=0.9985)。从8例人类乙型肝炎病毒(HBV)DNA阳性的血清标本检测中证实1例酪氨酸鄄缬氨酸鄄天冬氨酸鄄天冬氨酸(YVDD)突变、3例野生型,其余4例可能是杂合型突变。结论:本法具较高的检测灵敏度,且其突出的特点是能检测出标本中杂合突变所占的比例,间接反映出患者体内突变的类型和比例。这对于疾病的诊断、治疗、预后评价等都具有较高的价值。

应用免疫学方法的核酸探针——抗杂交体和半抗原核酸探针

核酸探针检测技术现正在许多领域广泛应用。目前,它不但在基础研究中是分析基因、获取目的基因的有力工具,而且已经在临床医学、法医学、农业等多种领域中发挥重要作用。核酸探针中,同位素32P 是最常用的标记物。尽管它具有检测敏感性高的优点,但它又有半衰期短、操作不安全、废物难以处理等严重弊端。

雌激素受体核酸适配体在乳腺癌免疫组织化学检测中的应用

目的筛选出能应用于乳腺癌免疫组织化学检测的雌激素受体(ER)核酸。方法制备ER蛋白,用指数富集的配体系统进化(SELEX)技术筛选出对ER具有高亲和力和特异性的核酸适配体。采用配体-受体相互反应实验来测定合成的ER适配体复合物的亲和力,用生物素化ER适配体和ER单克隆抗体分别作为一抗对105例乳腺癌组织进行免疫组化染色,以检测合成的ER适配体在癌组织中的特异性表达。用Kappa检验进行一致性检验。结果线性回归法计算获得生物素化适配体与ER复合物的解离常数Kd值为(0.34±0.05) nmol/L (n=3,r=0.989),最大结合力(B_(max))为769.23 fmol/(mg prot·nmol^(-1)·L^(-1))。实验结果表明,分别用生物素化ER适配体和ER单克隆抗体分别作为一抗进行免疫组化染色的结果具有高度一致性。其中ER阳性和阴性样本n=105,kappa值=0.943,95%可信区间=0.879～1.006,P<0.05;而ER弱阳性和中度/强表达样本n=75,kappa值=0.805,95%可信区间=0.642～0.967,P<0.05。进一步观察发现,ER适配体和ER抗体能使乳腺癌组织同一部位出现阳性表达,而阴性对照组均无表达。2例子宫内膜癌用生物素化ER适配体检测,癌细胞ER表达均为阳性。结论我们合成的ER适配体在体外能高度结合ER,ER适配体和ER抗体都能检测乳腺癌组织中ER的特异性表达。

牛磺酸对砷暴露小鼠肾组织核酸损伤的保护作用

目的 观察牛磺酸对砷暴露小鼠肾组织核酸损伤的保护作用。方法 昆明种小鼠40只，随机分为3组：4mg/L三氧化二砷染毒组、150m异／kg牛磺酸拈抗组以及生理盐水对照组。连续染毒60d，取小鼠肾组织固定，用免疫组织化学方法观察肾组织细胞8-硝基鸟嘌呤（8-NO2-G）的表达。结果 染砷组小鼠肾细胞出现肿胀，胞浆内有空泡变性，部分胞质溶解，核肿胀、溶解等明显的病理学变化。牛磺酸拮抗组小鼠肾组织的病理变化相对较轻。小鼠肾皮质细胞的胞浆中8-NO2-G吸光度值，染砷组（0．043±0．014）明显高于对照组（0．004±0．002），差异有统计学意义（P〈0．01）；牛磺酸拮抗组（0．016±0．013），低于染砷组（P〈0．05），但仍明显高于对照组（P〈0．05）。结论 牛磺酸对砷暴露小鼠肾组织核酸损伤具有保护作用。

基于一维DNA组装磁性纳米探针的夹心型安培免疫传感器研究

采用Fe3O4／ZrO2（壳）纳米磁珠（zMPs）标记待测物识别抗体，并用HRP酶封闭和DNA链接，建立了一类新型的“珠链状”一维磁性纳米探针制备方法。将甲胎蛋白（AFP）一抗固定于纳米金修饰的玻碳电极表面，构建了免疫电极（GCElAFPAb。）。基于该电极和上述合成探针，通过双抗体夹心法测定免疫产物上HRP酶对过氧化脲（CP）氧化对苯二酚反应的催化电流，研制了一类基于一维纳米结构组装的夹心型安培免疫传感器。研究表明：此一维纳米结构探针不仅大大增加了酶在电极表面的富集量，成倍扩增了催化电流，显著提高了传感器的灵敏度，而且易于通过外磁场与背景液可控分离，简化了分析步骤，并提高了结果的重复性。此传感器对AFP检测的线性范围为0．01～25μg／L；检出限达4ng／L（3σ），并被用于人血清中痕量AFP的测定，结果满意。

HPV免疫组化和原位核酸杂交技术在女阴尖锐湿疣和假性湿疣诊断中的价值

目的探讨HPV免疫组化和原位核酸杂交技术在女阴尖锐湿疣和假性湿疣诊断中的价值。方法通过免疫组化和原位核酸杂交技术 ,回顾性分析 2 33例女阴尖锐湿疣、假性湿疣以及湿疣样病变中HPV Ag和HPV6/ 1 1 的检出率并与病理组织学诊断作对比分析。结果 193例尖锐湿疣HPV Ag阳性 10 2例 (占 5 2 85 % ) ,HPV6/ 1 1 阳性 187例 (占 96 89% ) ,两种检测法阳性率的差异具有极显著意义 (P <0 0 1)。 2 0例湿疣样病变HPV Ag阳性 3例 (占 15 % ) ,HPV6/ 1 1 阳性 7例 (占 35 % )。 2 0例假性湿疣HPV Ag和HPV6/ 1 1 均阴性。病理上尖锐湿疣可见于诊断性挖空细胞、角化不全、棘层肥厚、基底细胞增生和上皮脚延长融合 ;而假性湿疣无诊断性挖空细胞 ,无明显棘层肥厚和基底细胞增生。结论HPV原位核酸杂交技术优于免疫组化技术 ,HPV6/ 1 1 的检测有助于鉴别尖锐湿疣和假性湿疣以及湿疣样病变。

改进的免疫胶体铁细胞化学染色

本文以改进的方法制备了胶体铁。该胶体制备简单,稳定性高,易于抗体标记,在PH7.4时,胶体与抗体IgG稳定结合形成胶体抗体复合物的经以CM-Sephadex C-50代替AmberlightCG50进行标记物的纯化,方法可靠,所制备的胶体铁标记抗体用于免疫细胞化学染色,普鲁士蓝反应清晰地显示出标记抗体与相应抗原的特异性结合部位,与传统的免疫酶及免疫金银方法比较,具有敏感性高,背景干净,呈色鲜明等优点,结合免疫酶及免疫金银染色可用于抗原的双标及多标记。

原因不明性肝炎患者肝组织中病毒抗原及核酸的检测

目的：探讨血清非甲－非庚肝病患者的病因学。方法：采用免疫组织化学和原位杂交技术对104例不明原因各型肝炎患者的肝组织进行料病毒抗原和核酸的检测。结果：病毒抗原和核酸的总检出率为85．6％，其中单纯HBV感染率为6．73％，HCV为0．96％，单纯HGV感染率为14．42％，单纯TTV感染患者占10．58％，各种重叠感染者占52．88％（55／104），仍有14．42％（15／104）病因不明。结论：血清非甲－非庚肝病患者肝组织中以HBV、HCV或和HGV、TTV重叠感染多，仍有部分病因不明。

用核酸杂交技术检测抗病毒i-RNA制剂中病毒核酸的残留及其在免疫小鼠体内的动态变化

以生物素化dUTP标记CI(?)、株基因组Hind Ⅲ酶切Y片段为探针,用核酸杂交技术检测抗HCMV-iRNA制剂中巨细胞病毒核酸的残留,同时用HCMV免疫小鼠观察病毒核酸在小鼠体内的存留时间。结果,HCMV DNA在小鼠体内的存留时间有明显的个体差异,而与HCMV DNA有同源序列的RNA在免疫后7天被清除。在4批来自羊肝、脾组织的抗HCMV-iRNA 制剂中,有3批查出HCMV核酸。

免疫组化和核酸斑点杂交技术检测女性下生殖道人乳头状瘤病毒

我院１９９２年７月～１９９３年３月共４９５份病理诊断为湿疣（５２份）、鳞状乳头状瘤病（２０２份）和非特异性炎或增生性病变（２４１份）的外阴、阴道及宫颈赘生物的活检标本，分别采用免疫组化ＡＢＣ法和核酸斑点杂交技术检测人乳头状瘤病毒的衣壳抗原和ＤＮＡ。在湿疣、鳞状乳头状瘤病和非特异性炎或增生性病变中，ＨＰＶ－Ａｇ阳性检出率分别为６９．２３％（３６／５２）、０．００％和０．００％；ＨＰＶ－ＤＮＡ阳性检出率分别为８４．６２％（４４／５２）、１１．３８％（２３／２０２）和３．３１％（８１／２４１）。免疫组化法和核酸斑点杂交检测湿疣和鳞状乳头状瘤病中ＨＰＶ的阳性率均有极显著性差异（Ｐ＜０．０５）。因此，认为湿疣与鳞状乳头状瘤病是二种不同的疾病。ＨＰＶ在鳞状乳头状瘤病和非特异性炎或增生性病变中的阳性率也有极显著性差异，推测鳞状乳头状瘤病者易受ＨＰＶ感染，对其可予对症处理并随访。免疫组化ＡＢＣ法检测ＨＰＶ的阳性结果可靠，定位清晰，有助于组织学表现不典型湿疣的诊断。核酸斑点杂交技术敏感，可为感染病毒分型提供依据。

无嘌呤嘧啶核酸内切酶在胰腺癌组织的表达及其临床意义

目的研究胰腺癌组织APE的表达及其与临床肿瘤指标的关系。方法(1)通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测4株胰腺癌细胞株APEmRNA的表达;(2)收集37例手术切除的胰腺癌及12例相应癌旁胰腺组织石蜡标本,应用EnVision免疫组化法分别检测癌组织和癌旁胰腺组织APE的表达情况。结果4株胰腺癌细胞株均有APEmRNA表达;37例胰腺癌中APE阳性表达33例(89.2%),其中APE胞核阳性表达7例(21.2%),胞质阳性表达5例(15.2%),胞质及胞核均表达21例(63.6%)。12例癌旁胰腺组织导管及腺泡呈阴性表达,胰岛胞质呈阳性表达,胰腺上皮内瘤变呈胞核阳性表达。APE阳性率与肿瘤分化程度,肿瘤大小、淋巴及远处转移无关(P>0.1)。结论APE在胰腺癌组织中有较高的阳性表达率,检测其定位的特异性表达可能有助于胰腺癌的早期诊断。

免疫捕获-核酸扩增-微孔杂交检测贝类中甲型肝炎病毒的方法研究

目的 :建立贝类中甲型肝炎病毒新的检测方法。方法 :先用IgG抗体吸附标本中的HAV ,然后将HAV中的RNA逆转录成cDNA ,用PCR方法扩增。PCR产物与标记特异基因探针孔中分子杂交 ,最后加入与标记物对应的酶配体 ,酶联免疫检测。结果 :采用的两对引物和探针均可用于检测。仅加入HAV的可测出阳性 ,其余病毒测不出。寡核苷酸探针 3 75nmol/L、7 5nmol/L、15nmol/L比较理想 ,杂交时间为 12 0min ,显色 3 0min最佳。免疫捕获 -核酸扩增 -微孔杂交方法比原方法提高 2 5倍以上。推测方法的检测限达到 8pfu/g贝组织。 结论 :免疫捕获 -核酸扩增 -微孔杂交方法灵敏度高、特异性强 ,且可以定量。

大鼠泪腺睾酮受体真空负压ABC法光镜观察与免疫金探针超微结构定位

动物实验发现睾酮能改善干眼病动物模型干眼症状 ,促进泪腺分泌。但作用机理不明 ,本研究探讨泪腺细胞中是否存在睾酮受体。雌雄各 8只大鼠的泪腺分别制成石蜡切片和超薄切片 ,睾酮分别采用 ABC法及免疫金标记 ,通过真空负压 ABC法光镜观察及免疫金探针超微结构定位进行细胞睾酮受体检查。结果 :光镜下泪腺导管上皮细胞的胞浆及胞核中出现免疫染色阳性 ,泪腺上皮细胞则很少见到 ;电镜下泪腺细胞胞浆及核中可见金颗粒。对照组则染色阴性。结论泪腺细胞存在着睾酮受体 。

基于核酸适配体的比率荧光探针定量检测血浆外泌体

目的:建立一种新型比率荧光探针法用于定量检测血浆中外泌体。方法:将Cy5荧光探针标记的CD63核酸适配体固定到链霉亲和素磁珠(MNPs)上,得到MNPs-Apt,加入SYBR GreenⅠ(SGⅠ)核酸染料构建比率荧光免疫磁珠(MNPs-Apt-SGⅠ)。当外泌体存在时,CD63核酸适配体捕获外泌体而发生结构改变,SGⅠ探针从双链中释放,免疫磁珠上的SGⅠ荧光强度大幅减弱,而Cy5荧光探针的荧光恒定,根据两种荧光探针被激发的荧光信号比值变化[Δ(F_(C)/F_(S))]对外泌体进行定量检测。结果:外泌体浓度在8.0×10^(4)~1.0×10^(7)个/μL范围内,Δ(F_(C)/F_(S))与外泌体浓度呈良好的线性关系。该方法灵敏度高,选择性好,检出限为4.0×10^(4)个/μL。此外,所建立的方法成功地应用于血浆外泌体的检测。结论:构建的比率荧光探针法具有快速、灵敏、准确度高、特异性强等优点,可用于血浆样品外泌体的定量检测。

基于串联杂合泛素结合结构域探针的多聚泛素化信号免疫组织化学检测技术研究

目的提高串联杂合泛素结合结构域(ThUBD)探针检测甲醛固定石蜡包埋(FFPE)切片中多聚泛素化信号的灵敏度。方法利用微波炉加热方法,采用不同盐离子种类和pH缓冲液进行抗原修复,在有无高浓度还原剂条件下,用ThUBD探针检测FFPE切片中的多聚泛素化信号。结果在pH 9.5 EDTA缓冲液条件下,加入50 mmol/L DTT可检测到FFPE切片中明显的多聚泛素化信号。结论pH 9.5 EDTA缓冲液中加50 mmol/L DTT有利于多聚泛素链的暴露与复原,显著提升ThUBD探针用于免疫组织化学检测的灵敏度。

早期胃癌组织形态、细胞核DNA含量及免疫组织化学研究

目的:对早期胃癌病理形态、细胞核DNA含量、免疫组化及治疗等进行讨论。方法:32例早期胃癌,采用S-P法免疫组化,观察p53、p21、CEA、PCNA的表达;细胞核DNA含量以及组织病理学特征。结果:早期胃癌癌周围粘膜常伴有绒毛状异型增生、腺瘤状异型增生、囊腺样异型增生、球样异型增生、灶性异型增生的形态,并与相应腺癌一致。细胞核DNA含量,异倍体细胞在6.8％～79.5 ％之间;PCNA阳性细胞数在24.7～93.2个之间;p53、p21基因蛋白和CEA阳性表达分别为37.5％、78.1％和93.8％。早期胃癌经微波治疗后,近期经手术切除的标本中75％(6/8)仍有癌细胞存在。结论:早期胃癌与癌前期异型增生的组织学形态密切相关;异倍体值、细胞增殖指数、p53、p21和CEA表达,有助于癌前病变和早期胃癌的诊断;早期胃癌以手术切除为宜。