检测细胞内细胞因子的生物素-链霉亲和素免疫细胞化学法的建立及初步应用

目的 建立检测细胞内细胞因子的生物素-链霉亲和素免疫细胞化学法（BSA—ICC）并作临床初步应用。方法 从健康人外周血单个核细胞（PBMC）中富集CD4细胞，加入莫能霉素，用不同浓度的佛波醇酯（PMA）和钙离子载体（A23817）诱导CD4细胞不同时间，比较其胞内表达白细胞介素-2（IL-2）／白细胞介素-4（IL-4）的细胞百分率，确定最适诱生条件；用不同稀释度的IL-2McAb、IL-4McAb、不同浓度的生物素化羊抗鼠IgG（bio-SAMIgG）和辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（HRP-SA）作棋盘配比试验，确认McAb、bio-SAMIgG和HRP—SA的最适浓度，根据上述结果建立了检测细胞内细胞因子的BSA—ICC法。用所建方法检测20名健康献血员、16例妇科良性疾病和18例妇科恶性肿瘤患者CD4细胞中表达IL-2／IL-4细胞的百分率。结果 诱导CD4细胞胞内表达IL-2和IL-4的细胞最高百分率的PMA和A23817浓度分别为100μg/L和2．0μmol／L，诱导高峰时间分别为5和7h，BSA-ICC法中所用IL-2McAb、IL-4McAb最适稀释度分别为1：20和1：40，bio—SAMIgG和HRP-SA浓度分别为10～15μg/ml和15μg/ml。20名健康献血员、16例妇科良性疾病和18例妇科恶性肿瘤患者CD4细胞中分泌IL-2的细胞百分率分别为（45．90±4．39）％、（37．28±2．67）％和（25．19±3．49）％，分泌IL-4的细胞百分率分别为（10．5±1．50）％、（9．94±1．06）％和（16．13±2．50）％，IL-2^＋CD4^＋／IL-4^＋CD4^＋比值分别为3．65±0．94、3．55±0．76和1．27±0．26。结论 所建方法可用于T辅助（Th）细胞亚型的测定，从而判断Th细胞的极化状态。妇科恶性肿瘤患者Th细胞功能失衡极化，呈Th2反应，可能与恶性肿瘤的发生有关。

乌龟胃肠胰系统内分泌细胞的免疫组织化学研究

应用过氧化物酶标记的链霉卵白素(Streptavidin peroxidase,简称S-P法)免疫组织化学技术,使用六种特异性胃肠激素抗血清对乌龟胃肠胰系统内分泌细胞的种类、定位、分布密度及形态进行了研究。在乌龟胰腺中检测出5-羟色胺、生长抑素、胰高糖素和胰多肽等4种内分泌细胞,生长抑素、胰高糖素细胞多成簇大量分布于胰岛中;5-羟色胺、胰多肽细胞多散在少量分布于胰腺腺泡之间。在乌龟消化道中共检测出5-羟色胺、生长抑素、胃泌素、胰高糖素和P物质等5种内分泌细胞:5-羟色胺细胞在消化道各段均有分布,以十二指肠处分布密度最高(30.7±4.2),空肠其次,回肠、直肠处最低(12.0±1.0/11.2±3.0);生长抑素细胞仅分布于食道和胃中各段;胃泌素细胞分布于胃幽门部和十二指肠处;胰高糖素细胞分布于胃体至空肠段,以胃幽门部分布密度较高(11.3±1.1);P物质细胞仅布于胃幽门部;消化道各段均未检出胰多肽细胞。与其他爬行动物比较,乌龟胃肠胰系统内分泌细胞的分布既存在着一定共同点,又显示了较大的种间差异。

应用生物素-链霉亲和素的时间分辨荧光免疫分析检测玉米赤霉烯酮

采用基于生物素（Biotin）-链霉亲和素（Strepavidin）的时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）技术建立了快速灵敏的玉米赤霉烯酮（ZEN）检测方法。以strepavidin包被板条，加入生物素化的ZEN—BSA，结合在板条上的ZEN—BSA与标准／样本中的游离ZEN共同竞争限量的抗ZEN单克隆抗体，用稀土离子Eu“标记的羊抗鼠IgG进行示踪，建立了间接竞争的ZEN-TRFIA。该方法的检测灵敏度为0．2ng／ml，测量范围是0．2～200．0ng／ml，批内、批间变异系数分别为5．7％和8．3％，平均回收率为91．1％。与玉米赤霉醇的平均交叉反应是12．3％，与赭曲霉素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉素B1无交叉反应，说明该方法的特异性较好。相关试剂在4℃放6个月后各检测参数基本无变化，说明该方法稳定。样品同时用ZEN—TRFIA和商品ELISA试剂盒测定样品ZEN含量，两者的相关系数为0．9664，说明该方法测量准确。ZEN—TRFIA具有测量准确、检测灵敏度高、检测范围宽、操作简便、标记物稳定等优点，适合于ZEN大量筛查的应用。

斑点免疫金渗滤试验、生物素-链霉亲和素一步法与培养法检测淋球菌抗原的对比

目的 探讨斑点免疫金渗滤试验 (DIGFA)、生物素 链霉亲和素一步法及培养法检测淋球菌抗原的优缺点。方法 同时用DIGFA、生物素 链霉亲和素一步法及培养法检测临床疑诊淋病患者 110例泌尿生殖道标本中的淋球菌抗原 ,并相互比较。结果 DIGFA和生物素 链霉亲和素一步法的敏感性、特异性分别为 97.53 %、92 .85%和 96.2 9%、89.2 8%。配对计数资料 χ2 检验 ,两法分别与培养法比较差异均无显著性 (P >0 .0 5)。结论 检测淋球菌抗原的DIG FA、生物素 链霉亲和素一步法是一种简易、快速、敏感。

生物素-链霉亲和素免疫学法测定地高辛的研究

采用国产链霉亲和素直接包被塑料板孔 ,生物素标记抗体 ,建立的竞争酶联免疫吸附试验的方法测定血中地高辛浓度 .其测定灵敏度为 0 0 964μg/L ,最低检测限为 0 2 2 51 μg/L ,测定三份低、中、高浓度的血清标本 ,批内变异系数为 8 9% ,5 9% ,2 4 % ;批间变异系数为 1 5 8% ,1 0 1 % ,9 2 % ,测定回收率在 89 1 %～ 1 0 7 2 2 %之间 ,此法与FPIA方法相关良好 (r=0 94 88)

链霉亲和素-生物素放大免疫酶法在鼻咽癌诊断中的临床应用

目的分析链霉亲和素-生物素放大免疫酶法在鼻咽癌检测当中的临床价值。方法选取2009年3月至2013年1月在孝感市中心医院就诊具有高度鼻咽癌危险的患者326例,分别进行链霉亲和素-生物素放大免疫酶法和常规免疫酶法检验,对链霉亲和素-生物素放大免疫酶法与常规免疫酶法在鼻咽癌患者117例与鼻咽癌高危人群但是无鼻咽癌患者209例的IgA/VCA和IgA/EA的检出率进行观察。结果在鼻咽癌患者中,链霉亲和素-生物素放大免疫酶法的IgA/VCA检出阳性率为99.16%,高于常规免疫酶法的92.31%,IgA/EA检出阳性率为78.63%,高于常规免疫酶法的56.41%(P<0.05)。鼻咽癌高危人群但是无鼻咽癌患者,链霉亲和素-生物素放大免疫酶法的IgA/VCA检出阳性率为24.88%,与常规免疫酶法检出阳性率(23.92%)差别无统计学意义(P>0.05),IgA/EA检出阳性率为3.83%,而常规免疫酶法为0。结论链霉亲和素-生物素放大免疫酶法能够较常规免疫酶法更为灵敏地诊断鼻咽癌。

生物素—链霉亲和素免疫学测定地高辛的研究

方法为竞争酶联免疫吸附方法，待测物质为血清中地高辛，采用国产链霉素和素直接包被塑料板孔，生物素标记地高辛抗体。其测定灵敏度为0．0964μg/L,最低检测限为0．225μg/L,测定三份低、中、高浓度的血清标本，批内变异系数分别为8．9％、5．9％和2．4％；批间变异系数分别为15．8％，10．1％和9．2％，测定回收率在89．1％－107．22％之间，此法与FPIA方法相关良好（r=0.9488).

生物素-链霉亲和素酶免疫法PSA测定的评价

目的评价生物素-链霉亲和素酶免疫分析法(BSA-ELISA)测定前列腺特异性抗原(PSA)并与化学发光法(CLIA)进行比较。方法根据EP9-A文件要求采集数据,并以相应软件分析这两种方法的相关性;同时对BSA-ELISA的测定范围,变异系数(CV),最小检测限进行测定。结果两种方法测定的结果具有较好的相关性,回归方程У=0.985Х-0.131,相关系数(r)=0.997。PSA的批内平均CV为2.21%,批间平均CV为3.08%。测定范围为1.50～85.00μg/L。最小检测限为0.30μg/L。结论采用全自动酶免疫分析仪的BSA-ELISA与CLIA自动分析仪测定PSA的相关性好,结果稳定,偏差小,可以在临床上常规应用。

生物素链霉亲和素联合免疫层析用于快速检测NT-proBNP

为提高常规免疫层析技术的检测灵敏度,引入生物素-链霉亲和素系统,以荧光微球作为标记物,建立了一种新型快速定量检测NT-pro BNP的方法.试验结果表明:新型试剂盒在0.02~30μg·L^(-1)范围能对NT-proBNP实现快速检测.在全血检测中,新型试纸条所测NT-pro BNP浓度与雷度快速免疫分析仪定量检测结果具有很好的一致性.新型免疫层析试纸条大大提高了快速检测的准确性,可广泛用于床旁检验(POCTs)等临床诊断阶段.

半乳糖化链霉亲和素、亲和素和链霉亲和素的实验研究

将亲和素生物素预定位系统（ＡＢＳ）引入肿瘤放免显像，结果显示预定位法特别是三步法，优于传统一步法［１，２］。在三步法中，第２步所用的药物主要为亲和素（Ａｖ）和链霉亲和素（ＳＡ），但它们在药代动力学及生物分布上各有优缺点［３］。为了获得更合适的药物，...

抗癌胚抗原单链抗体与核心链霉亲和素融合蛋白在荷瘤裸鼠体内的预定位显像

目的 研究1 53Sm 生物素和抗癌胚抗原单链抗体与核心链霉亲和素融合蛋白 (CEAScFv core streptavidin)在荷人结直肠癌裸鼠体内的两步法预定位显像和体内分布。方法 对 2 3只荷人结直肠癌裸鼠腹腔注射CEAScFv core streptavidin进行预定位 ,2 4h后腹腔注射1 53Sm 生物素 ,其中2 0只于 1、4、8和 2 4h进行体内分布研究 ,余 3只于 8和 2 4h进行定位显像。结果 在荷人结直肠癌裸鼠腹腔注射CEAScFv core streptavidin预定位后 2 4h ,注射1 53Sm 生物素后 1h ,肿瘤 血比值为 0 .4 9,4和 8h达 1.2 1和 1.5 6 ,2 4h达最高 ,为 3.0 9。裸鼠定位显像示 ,8h肿瘤部位放射性明显浓聚 ,2 4h本底明显降低 ,肿瘤呈放射性“热”区。结论 1 53Sm 生物素和CEAScFv core streptavidin预定位显像能提高靶 非靶比值 ,缩短显像时间 ,改善图像质量。

新型磁共振靶向对比剂Gd-DTPA-链霉亲和素的制备及其反应条件的实验研究

目的探讨制备Gd3+标记的二乙三胺五乙酸-链霉亲和素(Gd-DTPA-SA)的最佳反应条件。方法选择不同pH值的反应体系(pH值分别为5、6、7、8)及不同DTPA-SA的摩尔比率(1000、500、200、100),测定不同反应条件下的每个SA分子所结合的Gd3+数目及Gd-DTPA-SA的结合活性。结果随着反应体系pH值的增高,每个SA分子所结合的Gd3+数目增高;当DTPA-SA摩尔比率低于500时,DTPA-SA联结Gd的数目随着DTPA-SA摩尔比的增高而增高;而当摩尔比率为1 000时,则出现下降。各实验组Gd-DTPA-SA复合物的生物素结合活性无明显差异。结论SA分子所结合的Gd3+数目依赖于反应体系的pH值及DTPA环酐-蛋白的摩尔比值,而Gd-DTPA-SA的生物素结合活性与反应条件无关。

人血清生长激素化学发光免疫分析方法的建立

建立链霉亲和素-生物素双抗体夹心化学发光免疫分析法(CLIA)测量人血清生长激素(GH),并进行临床应用检测。以链霉亲和素包被微孔板,生物素化一株GH单克隆抗体(McAb),辣根过氧化物酶标记另一株McAb,校准品与国家标准品进行溯源,建立GH CLIA法,进行性能参数测试,与国外试剂盒比对。结果表明本法线性范围为2.0～150.0μIU/mL,回收率为95.5%,灵敏度0.02μIU/mL,批内、批间CV分别为3.2%～7.2%和3.8%～8.2%,与hPRL、hLH和hTSH叉反应率分别为3.6%、0.05%和0.02%,与hFSH、hCG无交叉反应。本方法与国外同类试剂盒检测187份血清,相关系数为0.9837。37℃,7天热稳定性良好。本方法各项指标均满足临床检测要求,达到国外同类水平,便于临床检验应用。

链霉亲和素-自噬相关基因融合蛋白的原核表达及纯化

目的构建链霉亲和素(streptavidin,SA)和自噬相关基因(Beclin 1)重组质粒,并对融合蛋白SA-Beclin 1进行表达和纯化。方法利用基因重组技术将核心SA与Beclin 1序列连接,克隆入pQE80形成pQE80-SA-Beclin 1重组载体,IPTG诱导融合蛋白原核表达,镍亲和凝胶层析柱纯化融合蛋白,Western blot鉴定。结果 PCR成功扩增核心SA活性中心,酶切鉴定和测序均证实重组载体pQE80-SA-Beclin 1构建成功;IPTG诱导后SA-Beclin 1融合蛋白(含His标签)在大肠杆菌中高效表达,SDS-PAGE分析表达的融合蛋白以包涵体为主,经镍亲和凝胶层析柱纯化得到融合蛋白,Western blot鉴定其相对分子量约为72000kD,与预期相符。结论本文成功构建了重组质粒并表达纯化了SA-Beclin 1融合蛋白,为进一步研究SA-Beclin 1的功能及临床应用奠定了基础。

氯霉素的直接竞争时间分辨荧光免疫检测法

[目的]采用时间分辨荧光技术建立氯霉素(CAP)直接竞争免疫检测法(CAP TRFIA)。[方法]以羊抗鼠IgG二抗为固定相,游离CAP与生物素化的CAP人工抗原(CAP-BSA)共同竞争限量的CAP抗体;用铕标记的链霉亲和素示踪。[结果]该方法的灵敏度为0.016 ng/ml,用于牛奶样品检测的添加回收率为89.6%,批内和批间变异系数分别为5.5%和10.1%,与甲砜霉素的交叉反应率<0.01%。[结论]CAP TRFIA直接竞争法灵敏度高、特异性好、性能稳定,适于高通量筛查,有良好的应用前景。

乙肝表面抗原吖啶酯化学发光定量免疫分析方法的建立

目的建立一种定量检测乙肝表面抗原(HBsAg)的化学发光免疫分析方法并评估其性能。方法利用双抗体夹心法实验原理,用吖啶酯标记多抗,用生物素标记两株单抗,通过磁颗粒链霉亲和素-生物素系统分离固相和液相完成检测。结果本方法的检测限为0.05IU/mL,线性范围为0.05~150IU/mL,可溯源至国际标准品,批内变异小于5%,总变异小于8%,浓度高达106IU/mL的强阳样本未出现HOOK效应;5套阳转盘对雅培Architect、西门子centaur和强生VITROS发光试剂相对敏感系数分别是3、0、-3;国家参考盘检出达标;与雅培Architect比较,2000例临床样本检测灵敏度为99.77%,特异性为100%,一致性达99.95%。结论本研究建立的HBsAg定量检测试剂,各项指标均满足临床检测的要求,灵敏度高,特异性好,适合临床推广应用。

抗苗勒氏管激素的生物素-链霉亲和素-辣根过氧化物酶酶促化学发光免疫分析方法的建立

目的:抗苗勒氏管激素(AMH)在评价卵巢储备功能方面具有更高的准确性,将其用于青春期、生育期女性的生育指导时具有很好的临床价值。目前对于AMH的检测,临床上常采用的是酶联免疫分析法,但存在灵敏度低、检测范围窄等缺点,而影响AMH实际水平的测定,使得对病情的预估不准确对疾病的治疗产生影响。因此,建立一种低成本、高敏感度的检测AMH水平的方法尤为重要。方法:利用生物素-亲和素放大系统,将一组抗AMH的第一抗体包被微孔板,同时用生物素标记第二抗体,与第一抗体-抗原复合物结合之后,再与生物素-链霉亲和素-辣根过氧化物酶结合物结合,加入发光底物,建立AMH酶促化学发光免疫分析方法,同时对这一体系的线性、灵敏度、特异度、稳定性、回收率等参数进行检测,并与常规ELISA法进行相比检测AMH浓度。结果:线性检测范围为(0.42～50.00)U/ml,该体系稳定性好,灵敏度0.42U/ml,批内差异小于10.0%,批间差异小于10.0%,与常规ELISA对比差异有统计学意义。结论:AMH的生物素-链霉亲和素-辣根过氧化物酶酶促化学发光免疫分析易于操作、灵敏度高、价格低廉,适用于临床检测。

氯噻啉胶体金增强免疫层析分析方法的建立

利用生物素-链霉亲和素的高亲和作用,研制了一种简便、快速、高灵敏的氯噻啉胶体金增强免疫层析分析方法(Gold immunochromatographic assay,GICA)。将氯噻啉抗体和生物素化DNA与13 nm胶体金双标记,将链霉亲和素与41 nm胶体金标记,制备了氯噻啉胶体金增强免疫层析试纸条。系统优化了试纸条的工作条件,并通过交叉反应、添加回收和高效液相色谱(High performance liquid chromatography,HPLC)验证评价GICA的敏感性、特异性、精确性和准确性。在最优条件下,试纸条可在10 min内实现可视化判读,检出限(LOD)为25 ng/m L,除与吡虫啉有较大交叉反应外,与其它类似化合物无交叉反应。氯噻啉在河水、大米、黄瓜、番茄、梨、甘蓝和苹果样品中的添加浓度为0.05,0.5和5μg/g时,GICA的检测结果均符合添加水平。在未知浓度河水和梨样品的检测中,GICA的检测结果与HPLC方法相符。

应用生物素-链霉亲和素酶联免疫吸附法检测原发性肝癌特异性γ-谷氨酰转移酶

目的观察生物素-链霉亲和素酶联免疫吸附（ELISA）法检测原发性肝癌（PHC）特异性欧曼陀罗凝集素强结合的γ-谷氨酰转移酶（DSA-GGT）的临床应用价值。方法对45例正常对照者、58例PHC患者和203例非PHC患者（包括其他肿瘤患者36例，肝良性病变患者167例），应用生物素-链霉亲和素ELISA法检测受试者血清中DSA—GGT的水平，同时用ELISA法检测受试者血清中甲胎蛋白（AFP）的水平。结果58例PHC患者中，DSA—GGT阳性38例，检测DSA-GGT诊断PHC的灵敏度为65．5％；203例非PHC患者中，DSA—GGT阳性18例，检测DSA—GGT诊断PHC的特异度为91．1％。该方法的平均批内及批问变异分别为8．9％和11．5％。58例PHC患者中，AFP阳性40例，检测AFP诊断PHC的灵敏度为69．0％；203例非PHC患者中，AFP阳性19例，检测AFP诊断PHC的特异度为90．6％。DSA-GGT与AFP联合检测诊断PHC的灵敏度和特异度分别为93．1％和85．7％。结论生物素-链霉亲和素ELISA法检测DSA—GGT和ELISA法检测AFP对PHC诊断的灵敏度和特异度相近，且前者的重复性良好，可作为PHC诊断的较好检测方法；DSA—GGT与AFP联合检测可显著提高PHC诊断的灵敏度。

制备醛固酮多克隆抗体建立检测血浆醛固酮的化学发光免疫分析法

目的:制备可用于免疫分析的醛固酮(ALD)多克隆抗体,并建立基于生物素-链霉亲和素放大系统的ALD化学发光免疫分析方法,用于测定人血液中的ALD含量。方法:对ALD进行化学改造,制备醛固酮肟,再与BSA偶联制备免疫原,免疫兔,制备抗ALD多克隆抗体。以生物素-链霉亲和素放大系统采用竞争法建立ALD化学发光免疫分析方法。结果:经检测免疫的3号兔获得的抗ALD抗体灵敏度最高,50%抑制率(IC50)ALD浓度是268 pg/ml。用该抗体建立的化学发光免疫分析法的检测范围为62.5~2 000 pg/ml,灵敏度为23.7 pg/ml,批内变异系数为6.9%~9.5%,批间变异系数为8.5%~12.7%,回收率范围为93.1%~104.1%,稀释实验测定值与理论值呈线性相关,相关系数为r=0.996,与放射免疫分析试剂盒的相关性方程分别为y=0.932x+4.596,相关系数r=0.948(n=95)。结论:建立的检测ALD的化学发光免疫分析法符合临床应用的基本要求。