应用改进的免疫荧光组织化学染色法对水稻根尖细胞微管结构的观察

植物细胞微管在细胞形态建成中具有重要作用。它体积小,且结构始终处于动态变化之中,因此观察到清晰的微管形态有一定的困难。本实验以水稻根尖为材料,介绍了一种改进的植物细胞微管免疫荧光组织化学染色方法,用此方法可以观察到清晰、完整的植物微管形态,此法对观察其它植物细胞微管结构也具有指导作用。

免疫组织荧光与流式细胞术检测脊髓损伤局部巨噬细胞亚群的比较

目的比较免疫组织荧光(IHF)与流式细胞术(FCM)检测脊髓损伤(SCI)局部M1和M2型巨噬细胞亚群的优缺点。方法采用纽约大学脊髓损伤仪制做大鼠重物坠落SCI模型。术后7天,分别采用IHF和FCM检测损伤脊髓中M1和M2型巨噬细胞,并进行比较。结果两种方法均可有效地检测脊髓损伤局部浸润的巨噬细胞及其M1、M2亚群。IHF检测到的M1(CD68^+CCR7^+)和M2(CD68^+Arg1^+)细胞亚群的比率为2.79±0.21,FCM检测到的M1(CD68^+CD86^+)和M2(CD68^+CD163^+)细胞亚群的比率为2.46±0.20,两种方法检测到的结果没有统计学差异(P>0.05)。IHF可对待测的细胞进行定位,但在细胞计数和比例分析方面需要人工完成;而FCM则可以直接自动分析细胞数量和比例,但无法对其进行定位。结论 IHF和FCM在分析脊髓浸润的细胞表型方面各有优缺点,两者结合可有效地分析SCI局部M1和M2巨噬细胞亚群的数量和比例。

神经系统免疫病自身抗体检测方法学进展及在诊断中的应用

自身抗体在神经系统自身免疫病中的作用越来越受重视,可以用来辅助诊断,评价治疗效果和预后评估。近些年来神经系统自身抗体研究进展快速,新报道的抗体种类繁多,但受限于神经系统自身免疫病的罕见及复杂性,众多研究只能以个案报道方式对抗体检测方法和临床意义进行阐述,缺少大规模的队列研究给予明确答案。在抗体致病机制尚不十分明确,检测方法也未完全统一的现状下,患者样品检测结果可靠与否以及有无临床意义是现阶段临床诊断时最感困扰的问题。本文对自身抗体产生及致病机制进行简单概括,着重介绍检测方法进展,并对其在诊断中的应用做了较为详细的总结及解释,以期有助于理清临床诊断所困扰的部分问题。

Cre重组酶敲除小鼠大脑脚背盖背侧核lacZ基因研究

目的观察Cre重组酶能否敲除双报告Z/EG转基因成熟小鼠大脑脚背盖背侧核局部lacZ基因。方法用PCR技术对双报告Z/EG转基因鼠系进行基因鉴定,利用立体定位微量注射技术将含有Cre重组酶的病毒载体注射到双报告Z/EG转基因成熟小鼠左侧大脑脚背盖背侧核,将鼠脑冷冻切片行抗绿色荧光蛋白免疫组织荧光染色及PicoGreen对照染色,于Confocal显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。结果双报告Z/EG转基因鼠所获PCR产物为631bp;未作任何染色切片在Confocal显微镜下可观察到注射Cre重组酶病毒载体左侧大脑脚背盖背侧核区域有弱绿色荧光,经抗绿色荧光蛋白免疫组织荧光染色后发现此区域有红色荧光。结论Cre重组酶成功地敲除了双报告Z/EG转基因成熟小鼠大脑脚背盖背侧核局部lacZ基因。

神经肽Y影响人血管平滑肌细胞低密度脂蛋白受体表达

通过观察神经肽Y对人血管平滑肌细胞低密度脂蛋白受体表达的影响 ,以探讨神经体液因素在动脉粥样硬化发生中的重要作用。将体外培养的人血管平滑肌细胞分成对照组和不同浓度神经肽Y组 (浓度分别为 1 0 8mol L、1 0 7mol L、1 0 6 mol L和 1 0 5mol L) ,各组分别培养 6h、1 2h、2 4h和 4 8h ,然后经免疫荧光组织化学染色 ,在激光扫描共聚焦显微镜下定量检测神经肽Y对人血管平滑肌细胞的低密度脂蛋白受体表达的影响。结果发现 ,对照组低密度脂蛋白受体表达的平均荧光值在 2 4 2 8～ 2 5 2 7之间 ,且不同培养时间无显著性差异 (P >0 .0 5 )。而各神经肽Y组低密度脂蛋白受体表达的平均荧光值与对照组之间有显著性差异 (P <0 .0 5或P <0 .0 1 ) ,在不同的培养时间中 ,1 0 8mol L神经肽Y组平均荧光值在 1 798～ 2 4 0 8之间 ;1 0 7mol L神经肽Y组在 1 783～ 2 332之间 ;1 0 6 mol L神经肽Y组在 1 72 2～ 2 2 81之间 ;1 0 5mol L神经肽Y组在 1 5 90～ 2 0 1 0之间。与对照组相比 ,分别平均下降 1 5 .5 9%、1 9.78%、2 1 .91 %和 2 6 .83% ,且不同浓度神经肽Y组之间多有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ,神经肽Y对成人血管平滑肌细胞的低密度脂蛋白受体表达的下调作用呈现一定的剂量和时间依赖效应。结果提示 ,

小鼠早期脓毒性脑病中小胶质细胞活化的探索研究

脓毒性脑病是决定脓毒症死亡率的关键因素。虽然脑中炎症反应与脓毒性脑病的发生相关,但其分子机制尚不清楚。本文针对早期脓毒性脑病中小胶质细胞是否活化进行探索性研究。采用盲肠结扎穿孔术(CLP)制备脓毒症小鼠模型,将小鼠大脑皮层样本经组织免疫荧光化学染色后,在激光共聚焦显微镜下观察小胶质细胞免疫荧光强度变化情况,并与假手术组对比,通过形态上的变化来确认小胶质细胞的活化情况。结果发现在模型组小鼠中小胶质细胞的数量较对照组增多,荧光强度增大且出现小胶质细胞胞体变大,揭示了小胶质细胞被激活。

不同刮痧力度对大鼠皮肤形态及5-羟色胺、肥大细胞表达变化的比较研究

目的:通过刮痧后实验大鼠皮肤形态及化学物质表达的变化,探究力度对刮痧产生的影响。方法:将健康SD大鼠随机分为空白组、轻刮痧组、中刮痧组、重刮痧组每组各6只,空白组常规饲养,轻刮痧组使用0.4kgf力,中刮痧组使用0.8kgf力,重刮痧组使用1.2kgf力,对其右侧阳陵泉穴进行刮痧干预均刮拭20次。干预1次后即刻取各组大鼠右侧穴区皮肤组织(10mm×15mm),之后运用荧光免疫组化技术进行肥大细胞(Mast Cell,MC)和5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)的检测。结果:与空白组比较,轻刮痧后皮肤组织形态无明显变化,5-HT在真皮层和皮下组织中沿毛囊与血管形成连续的增强带,MC表达增加;中刮痧后表皮层结构排列紊乱,MC、5-HT表达稍减少;重刮痧后皮肤组织形态明显紊乱,5-HT、MC明显较少。通过对阳性细胞进行计数,观察到轻刮痧组5-HT和MC的阳性标记数明显高于空白组,中刮痧组呈下降趋势,而重刮痧组则明显少于空白组。结论:一定的刮痧力度对于皮肤是安全的,适度刮痧会引起局部皮肤化学物质的表达响应变化,但是不会因为刮痧力度的增加而增强。

体内和体外条件下Nogo-A在大鼠小脑颗粒神经元上表达差异的研究

Nogo-A是网膜家族蛋白的成员之一,在抑制成年哺乳动物中枢神经系统损伤后轴突再生的过程中发挥着重要作用。Nogo-A表达于寡突胶质细胞和多种神经元,但在成年动物的小脑颗粒神经元中却未检测到。为探讨Nogo-A在小脑颗粒神经元上的表达情况及其影响因素,本实验应用免疫荧光组织化学染色法研究了Nogo-A蛋白在新生大鼠脑切片上和不同体外培养条件下小脑颗粒神经元中的表达。结果显示:在体条件下Nogo-A蛋白在新生大鼠的小脑颗粒神经元上的表达逐渐减少,至新生14d时检测不到;而在体外培养的来源于新生7d大鼠的小脑颗粒神经元中Nogo-A蛋白持续表达,可维持到14d;与胶质细胞共培养,或加入胶质细胞培养上清的小脑颗粒神经元仍然表达Nogo-A蛋白。本研究结果表明,体内和体外两种条件下Nogo-A蛋白在小脑颗粒神经元上的表达存在差异,新生期Nogo-A在小脑颗粒神经元上的表达下调可能与Purkinje细胞有关,提示Nogo-A在生后发育过程中可能与神经元的迁移或突触的形成密切相关。

斑马鱼胚胎及成年斑马鱼端脑中神经胶质成熟因子β的表达观察

目的观察斑马鱼胚胎及成年斑马鱼端脑中神经胶质成熟因子β(GMFβ)的表达变化。方法采用整胚原位杂交技术检测斑马鱼胚胎中的GMFβ mRNA;采用Western blotting法检测斑马鱼胚胎中的GMFβ蛋白;采用免疫荧光组织染色法检测成年斑马鱼端脑中的GMFβ蛋白。结果斑马鱼胚胎中GMFβ mRNA在受精3~12 h呈广泛性表达;受精24 h主要表达于眼原基、端脑、间脑、中脑、后脑和脊髓;受精48 h以后主要表达于脑部和视网膜;受精72 h表达强度最高,之后逐渐减弱,受精7 d呈微弱表达。斑马鱼胚胎中GMFβ蛋白在受精3 h开始表达,之后逐渐升高,受精72 h表达强度最高。成年斑马鱼端脑中GMFβ主要表达于背侧端脑和腹侧端脑的背侧核,而腹侧端脑的腹侧核和皮质下区域均未见GMFβ表达。结论斑马鱼胚胎发育时期GMFβ逐渐集中于脑部,成年后GMFβ阳性细胞主要在端脑的增殖活跃区(中缝和背侧端脑)。

刮痧对皮肤组织形态和GCS、SP、SOD表达的影响

目的:探讨刮痧对人体皮肤组织形态及皮肤中相关化学成分表达变化的影响。方法:募集健康受试者12名,男女各半。用刮痧板沿左侧膀胱经自心俞穴至肾俞穴由上向下刮拭出痧,刮痧后在背部刮痧区和对侧非刮痧区分别采取3mm×3mm×3mm的圆柱型皮肤,分别进行肥大细胞(MC)、降钙素基因相关肽(CGRP)和鬼笔环肽(PHA)等荧光免疫组织化学染色,并以ELISA法测定皮肤中糖皮质激素(GCS)、P物质(SP)及超氧化物歧化酶(SOD)的含量。结果:刮痧后皮肤外观、表皮层厚度和血管组织形态均有明显差异,主要表现为皮肤肿胀、表皮层增厚、血管变形等;MC标记到的阳性细胞减少,并伴随脱颗粒现象;CGRP阳性神经纤维表达无显著差异。同时,与非刮痧区相比,刮痧区皮肤组织中GCS、SP、SOD含量显著上升(P<0.05)。结论:刮痧疗法对皮肤安全,刮痧局部皮肤组中MC颗粒及GCS、SOD等多种化学物质表达可能形成效应联系,发挥治疗作用。

血清素阳性细胞在大鼠“内庭”“足三里”“伏兔”穴区皮肤组织中的分布

目的:观察血清素在大鼠后肢不同穴区局部组织中特定细胞上的表达,探讨腧穴之间组织学上的差异。方法:以6只正常SD大鼠为实验对象,选取其后肢"内庭""足三里"和"伏兔"为代表穴区。用荧光免疫组织化学法对每个穴区局部组织进行染色,所选用的抗体和生物学标记物包括血清素、鬼笔环肽、核酸特异性荧光染料DAPI和降钙素基因相关肽(CGRP)。采用共聚焦显微镜对标记的穴区组织进行观察,并分析血清素阳性细胞的分布特点。结果:血清素阳性细胞主要位于穴区的真皮和皮下组织,在真皮浅层接近表皮的部位呈扁平或不规则形,在真皮深层和皮下组织主要呈圆形和椭圆形而且集中分布在鬼笔环肽标记的血管样结构周围,在CGRP阳性神经纤维周围亦有大量分布。血清素阳性细胞以"内庭"穴区居多,"足三里"和"伏兔"穴区依次减少(P<0.01)。结论:皮肤血清素阳性细胞是不同穴区局部组织中的重要细胞成分,而且依穴区所在部位的不同存在数量上的差异。提示针刺对血清素发挥调节作用的强弱可能与选取腧穴所在部位血清素阳性细胞的数量有关。

人骨肉瘤组织钙网织蛋白表达及其意义探讨

目的:探讨钙网织蛋白(calreticulin,CRT)在骨肉瘤组织中的表达与骨肉瘤生长、转移的关系,以及化疗对其表达的影响。方法:取2005-10-01-2010-09-31在山东中医药大学附属医院(15例)、山东大学齐鲁医院(11例)及新汶矿务局集团中心医院(4例)骨科行骨肉瘤切除术、病历资料完整并排除合并其他运动系统肿瘤的骨肉瘤标本30例,其中转移20例,术前化疗者20例。每例标本同时取距离瘤组织>30mm的正常组织作对照。免疫组织化学染色法检测CRT在瘤体组织和正常组织中的表达;RT-PCR法检测CRT在mRNA水平的表达;蛋白质印迹法检测CRT蛋白的表达。结果:CRT主要存在于细胞质内,在所有标本中都有表达。其表达强度为瘤体组织(1.07±0.32)<瘤体周围正常组织(2.68±0.09),P<0.01;肿瘤转移组(0.93±0.21)<未转移组(1.36±0.42),P=0.020;术前未化疗组(0.75±0.21)<术前化疗组(1.24±0.30),P=0.001。CRT mRNA的表达强度为瘤体组织(0.58±0.30)<瘤体周围正常组织(1.48±0.14),P<0.01;肿瘤转移组(0.50±0.22)<未转移组(0.73±0.23),P=0.033;术前未化疗组(0.27±0.13)<术前化疗组(0.74±0.23),P<0.01。CRT蛋白的表达水平为瘤体组织(369.35±14.27)<瘤体周围正常组织(599.23±6.78),P<0.01;肿瘤转移组(361.95±17.37)<未转移组(394.15±17.97),P=0.031;术前未化疗组(288.96±12.86)<术前化疗组(409.54±18.22),P<0.01。结论:CRT的表达在人骨肉瘤组织中降低,其mRNA和蛋白质表达水平下降程度与瘤体是否转移有关,化疗可增加其表达水平。

外伤性癫痫病灶中caspase-10的表达

目的观察凋亡基因caspase-10在外伤性癫痫病灶中的表达变化,探讨其作用机制。方法收集外伤性、非外性癫痫患者手术切除的脑皮质及交通事故死亡者脑皮质各15例,运用RT-PCR技术观察比较各实验组凋亡基因caspase-10表达水平,采用荧光免疫组织化学染色技术观察各实验组凋亡基因对应蛋白的表达情况。结果外伤性癫痫组caspase-10基因和蛋白表达水平比非外伤性癫痫组和交通事故死亡组高,差异有统计学意义(P<0.05);非外伤性癫痫组caspase-10基因和蛋白表达水平亦显著高于交通事故死亡组(P<0.05)。结论凋亡基因caspase-10能促进神经元凋亡,对外伤性癫痫的发病过程有促进作用。

Bcl-2蛋白在外伤性癫痫病灶中的表达

目的观察Bcl-2蛋白在外伤性癫痫病灶中的表达变化,探讨其作用机制。方法收集外伤性癫痫、非外性癫痫患者及交通事故死亡者脑皮质各15例,采用免疫组织化学和荧光免疫组织化学技术,观察各实验组Bcl-2蛋白表达水平,测定阳性表达的灰度值,数据采用SPSS 12.0软件进行统计分析。结果外伤性及非外伤性癫痫组Bcl-2蛋白表达水平均高于交通事故死亡组(P<0.05);而非外伤性癫痫组表达明显高于外伤性癫痫组,差异亦具有显著统计学意义(P<0.05)。结论 Bcl-2蛋白能抑制神经元凋亡,对外伤性癫痫的发病过程具有抑制作用。