抗黑素细胞抗体免疫荧光细胞化学检测条件探讨

目的建立一种简单、实用、准确的抗黑素细胞抗体免疫荧光细胞化学检测方法,用于白癜风患者血清抗黑素细胞抗体的检测及其相关抗原分析研究。方法青少年包皮组织经分离酶(Dispase)Ⅱ及胰酶消化后,获取细胞悬液,用M2黑素细胞培养基及Accutase细胞消化液选择及扩大培养,取第3代黑素细胞在培养皿中直接用冷甲醇固定(-20℃),白癜风患者及健康人血清用抗体稀释液按1:10比例稀释进行反应,洗涤后加入FITC标记的羊抗人抗体,封片后荧光显微镜下观察;取不同荧光强度的标本血清用Western-Blot法进一步验证检测。结果获得高纯度、高活性的黑素细胞,黑素细胞在培养皿中经冷甲醇直接固定后细胞形态保持完整,实验过程无脱落,与白癜风患者及健康人对照血清反应后在荧光显微镜下发出不同亮度荧光,强阳性血清荧光强度+++^++++,发光部位为黑素细胞胞质和胞膜;弱阳性血清发光较明亮,亮度+^++,发光部位主要集中在胞膜;阴性血清不发光,只见隐约细胞轮廓,相同血清经重复检测2次后结果相同;经Western-Blot检测后证实黑素细胞胞质和胞膜有多种蛋白与抗黑素细胞抗体阳性血清结合,蛋白染色带的部位及颜色深浅与免疫荧光法检测结果相一致。结论本文建立的抗黑素细胞抗体的免疫荧光细胞化学检测方法简单、准确、重复性好,可全面地反映体内抗黑素细胞抗体表达水平,适用于临床检测及相关抗原的基础研究。

免疫荧光细胞化学和免疫酶细胞化学染色方法检测IgA肾病患者尿足细胞的效果比较

目的：比较免疫荧光细胞化学和免疫酶细胞化学染色2种方法检测IgA肾病（IgAN）患者尿足细胞的效果，为尿足细胞检测方法的选择提供依据。方法：收集43例确诊为IgAN患者（实验组）和10例正常对照研究对象（对照组）活检前连续3d的晨尿各200mL，离心上清制成涂片。IgAN患者按Lee分级分成Lee I～LeeV组。采用抗人足细胞表面标记蛋白Podocalyxin（PCX）单克隆抗体对尿沉渣涂片分别行免疫荧光细胞化学和免疫酶细胞化学染色，荧光显微镜和普通光学显微镜下计数2组研究对象尿足细胞数；采用Spearman相关分析法分析2种方法检测IgAN患者尿足细胞数的相关性。结果：2种方法检测的对照组研究对象尿中未见足细胞，2种方法检测实验组研究对象尿中均可见足细胞；免疫荧光细胞化学法检测足细胞阳性率和检出中位数低于免疫酶细胞化学法，2种方法检测尿足细胞阳性率和中位数比较差异均有统计学意义（P〈0．05）；2种方法检查患者尿足细胞数呈明显的正相关关系（r=0．842，P〈0．01）。结论：采用免疫酶细胞化学法检测同一份尿标本的效果优于免疫荧光细胞化学法。

一种不溶血红细胞免疫荧光细胞化学检测方法的建立

目的以氯通道蛋白ClC-3为靶蛋白,建立一种不溶血的红细胞免疫荧光细胞化学检测方法。方法采集大鼠红细胞,涂片,0.5%丙烯醛/PBS固定,以不同浓度的Triton X-100/PBS(含0.1 mol/L甘氨酸)溶液透膜,用含0.05 mmol/L甘氨酸、2%BSA、0.05%NaN3的PBS溶液封闭抗原,随后孵育ClC-3的一抗和荧光标记的二抗,最后在共聚焦荧光显微镜下观察结果。结果 0.1%Triton X-100/PBS结合其他优化液处理的红细胞未出现溶血现象,共聚焦显微镜下清晰地观察到目的蛋白及其亚细胞分布情况。结论通过优化固定液、透膜液、封闭液和洗涤液,解决了常规免疫细胞化学法导致红细胞易溶血的缺点,在确保红细胞不溶血的同时成功检测到红细胞氯通道ClC-3蛋白,即成功建立了一种不溶血的红细胞免疫荧光细胞化学检测方法。

3',5'-cAMP对不同瘤龄的艾氏腹水癌细胞内cAMP免疫荧光细胞化学反应及其磷酸二酯酶的细胞化学反应与癌细胞膜表面某些形态学变化的关系

本工作用外源性cAMP加氨茶碱对小鼠艾氏腹水癌细胞进行了多方面的研究,观察到外源性3′,5′-cAMP不仅对小鼠艾氏腹水癌细胞增殖有显著的抑制作用。在接种后第9天,看到癌细胞增殖受到抑制的同时,大多数癌细胞胞质内的cAMP免疫荧光细胞化学反应增强,癌细胞内3′,5′-cAMP磷酸二酯酶(PDE)活性受到抑制,此外,还观察到某些癌细胞表面膜上微绒毛消失或变短以及对植物凝集素的凝集反应减弱等现象,这些癌细胞的逆转表现的变化均与不同瘤龄的癌细胞有关,如经外源性cAMP处理后,cAMP-PDE活性降低出现的最早,均在接种后5~7天时最为明显,cAMP免疫荧光细胞化学反应是在接种后第9天最为显著,癌细胞表面膜上的微绒毛消失和变短的细胞比数明显增多,对植物凝集素的凝集反应减轻都是在接种后7~9天时最为显著,而cAMP对小鼠艾氏腹水癌细胞的增殖抑制作用是在接种后第9~11天最为明显。根据上述实验结果,本文讨论了外源性cAMP加氨茶碱对腹水癌细胞的抑制作用和癌细胞内cAMP荧光反应,3′,5′-cAMP-PDE活性以及癌细胞表面膜上微绒毛形态学变化的因果关系。

免疫细胞化学双染技术探讨

在临床与实验病理研究中,常用到免疫细胞化学双染技术。它可在同一细胞内定性、定位、定量的显示出两种抗原成分,利于研究人员了解细胞间的形态和机能的关系,以及抗原成分间的相互关系。我们在小鼠脾脏调节性T细胞在过敏性鼻炎发病机制中的作用[1,2]和摸索体外培养胚胎大鼠背根神经节细胞作为感音神经性聋治疗的新途径[3]的实验中均使用了该技术,

免疫细胞化学法检测尿足细胞的临床应用

目的:免疫荧光细胞化学和免疫酶细胞化学两种方法检测尿足细胞的比较,以促其临床推广应用。方法:尿标本均为我科住院患者的肾活检日新鲜晨尿,采用抗人足细胞标记蛋白Podocalxin(PCX)单克隆抗体进行尿沉渣免疫荧光细胞化学和免疫酶细胞化学染色。14例患者均经肾活检,肾组织由光镜、免疫荧光和电镜检查做出病理诊断。结果:(1)14份尿标本应用免疫荧光细胞化学和免疫酶细胞化学方法均可检测到足细胞。(2)同一份尿沉渣采用免疫荧光细胞化学法检测足细胞均数为(16.7±15.1)/HP,而免疫酶细胞化学法检测足细胞均数为(26.1±24.3)/20HP,两组比较有统计学意义(P<0.05);但两种方法所测足细胞数之间有很好的相关性(r=0.969)。结论:免疫荧光细胞化学和免疫酶细胞化学两种方法检测尿足细胞,前者较简便、镜下易辨认,后者设备简单、标本可保存。

冰冻切片免疫荧光细胞技术的改良

由于免疫荧光细胞化学的特异性、快速性和在细胞水平定位的敏感性与准确性,已在病理学诊断方面得到广泛应用。本文就我科多年的荧光技术实际操作中的经验体会做个介绍。

影响共聚焦荧光法检测单细胞中蛋白表达的因素探讨

采用免疫荧光技术联合共聚焦技术研究不同培养细胞中蛋白的表达及定位.结果发现:①同样以丙酮固定293细胞,不用0.5%Triton X-100处理,着丝粒蛋白E亚型(CENP-E)在分裂期细胞核周浓聚,核内未见;而用0.5%TritonX-100处理后,CENP-E呈散点状分布于分裂期细胞的核内.②分别以甲醇、95%乙醇和4%多聚甲醛固定并以1%TritonX-100处理k562细胞,不同固定剂处理组间结果无明显差异,信号转导与转录激活因子(STAT3)均定位于胞浆.共聚焦系统PMT=511时,显示胞核染色适中,核仁染色明显,而PMT=593时,整个核呈饱和染色状,微细结构不清楚.③以2%甲醛联合0.5%TritonX-100处理平滑肌细胞,固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(SCAP)在整个细胞中呈弥散性分布,核内含量较高,高尔基体上SCAP无特异性高表达.结论:是否使用TritonX-100处理对293细胞中核蛋白CENP-E的定位具有较大影响;k562细胞对醛类固定剂及醇类固定剂无特殊选择性,图片采集时共聚焦参数PMT对蛋白定位结果也有影响;醛类固定剂和Triton联用可准确定位SCAP在平滑肌细胞中的表达.

人胎盘微血管内皮细胞的分离培养及鉴定

背景:建立高纯度的人胎盘微血管内皮细胞体外培养体系对研究胎盘功能是十分必要的。目前,国内外研究多采用三步酶消化法结合免疫磁珠法分离胎盘微血管内皮细胞,然而步骤过于繁琐且对细胞损伤较大。因而,如何简化人胎盘微血管内皮细胞分离步骤,同时又能提高目标细胞纯度的体外培养方法成为研究热点。目的:探索一种简便高效的从早期绒毛组织中分离人胎盘微血管内皮细胞的体外培养方法,观察细胞生长状态并进行鉴定。方法:利用健康孕6-8周孕妇行人工流产后的绒毛组织,经两步酶消化法和非连续Percoll密度梯度离心得到人胎盘微血管内皮细胞,传代时利用胰酶消化法和反复贴壁法对细胞进行纯化。结果与结论:实验成功获取人胎盘微血管内皮细胞,原代培养的人胎盘微血管内皮细胞在培养24 h后基本完全贴壁,第10天进入对数生长期,第12至13天细胞浓度达80%,传代细胞较原代细胞生长活跃,培养5-7 d可长满培养瓶底,呈"铺路石样"排布。免疫荧光化学结果显示,培养的细胞中FⅧ因子与CD31相关抗原双荧光染色呈阳性,细胞阳性率达100%。MTT法测得培养第5代人胎盘微血管内皮细胞的生长曲线呈倒"S"形。结果证实,应用两步酶消化法、非连续Percoll密度梯度离心法分离细胞,并利用胰酶消化法和反复贴壁法纯化细胞,可获得大量高纯度的人胎盘微血管内皮细胞。

锚定蛋白CD59与接头分子Cbp在T细胞上的定位及功能研究

目的研究CD59、Src羧基末端激酶结合蛋白(Cbp)在细胞膜的定位,及其在细胞活化及增殖中的相互作用。方法应用免疫荧光细胞化学技术,通过荧光显微镜分析系统对CD59、Cbp的定位进行了分析;Jurkat细胞转染pSUPER-siCD59重组质粒,并行RT-PCR和Western blot法检测转染细胞中CD59的表达及蛋白酪氨酸激酶癌基因家族(fyn)磷酸化水平。利用MTT比色法检测转染各组细胞的增殖效应。结果 CD59、Cbp主要分布在细胞膜上。转染pSUPER-siCD59重组质粒的Jurkat细胞中CD59表达量减少,磷酸化的fyn含量也随之减少,细胞增殖能力也低于其他各组。结论 CD59是一种膜蛋白,在细胞活化及增殖中与Cbp分子共同发挥作用。

α-synuclein-EGFP在体外培养SH-SY5Y细胞中过表达对包涵体形成及线粒体结构改变的影响

为了观察 α-synuclein-p EGFP真核载体在 SH-SY5 Y细胞内表达状况及其对细胞的影响 ,本研究用 L ipofect AMINE法转染 SH-SY5 Y细胞 ,用荧光显微镜检测报告基因表达产物 EGFP,用荧光免疫细胞化学法检测α-synuclein蛋白表达以及用 H-E染色、光学显微镜观察转基因表达产物在细胞内的积聚 ,电镜观察转基因细胞超微结构形态学变化 ,rhodamine12 3染色、荧光显微镜检测线粒体跨膜电位变化。结果证明 ,该载体转染 SH-SY5 Y细胞后 ,在细胞内同时表达报告基因和目的基因 ;外源基因的表达产物可在细胞内积聚形成包涵体并引起线粒体结构和功能改变。本研究结果提示 ,本实验获得的细胞模型可模拟 Parkinson病发生过程中一些基本的神经病理学特点 ,可为进一步探讨

大鼠腰多裂肌卫星细胞的分离培养与鉴定

目的建立一种有效的大鼠腰多裂肌卫星细胞(MSC)分离、纯化、培养及鉴定方法。方法取4周龄雌性SD大鼠腰4～5节段多裂肌,用Ⅰ型胶原酶消化,采用差速贴壁法纯化腰多裂MSC,采用免疫荧光细胞化学染色检测配对核转录因子7(Pax7)、成肌分化抗原(MyoD)、肌球蛋白重链(MyHC)的表达进行鉴定。结果通过分离、纯化得到的MSC形态为圆形,折光性强,培养一段时间后,细胞呈梭型。分离所得到的细胞具有一致的生长方式和形态特点。免疫荧光细胞化学染色结果显示,分离得到的大鼠腰多裂肌MSC在静止期表达Pax7、增殖期表达MyoD、分化早期表达MyHC。结论建立了一种简单、高效的分离培养及鉴定大鼠腰多裂肌MSC的方法。

α-synuclein-pEGFP真核表达载体的构建及其在SH-SY5Y细胞中的表达

为了构建 α-synuclein-p EGFP真核表达载体 ,检测其在 SH-SY5 Y细胞内的表达 ,本研究应用下述方法 :PCR扩增 α-synuclein基因并消除终止密码子 ;PCR产物连入 p GEM T-easy载体 ,经测序确认无误后 ,亚克隆入 p EGFP-N1,构建α-synucle-in-p EGF P真核表达载体 ;Lipofect AMINE法转染 SH-SY5 Y细胞 ;荧光显微镜检测报告基因表达产物 EGFP,原位杂交和免疫荧光细胞化学法检测α-synuclein m RNA及其蛋白表达。结果显示 ,该载体转染 SH-SY5 Y细胞后 ,可在细胞内观察到报告基因和目的基因的表达产物。结论 :α-synuclein-p EGFP真核表达载体构建成功 ,并可在细胞内表达。本工作为今后动态观察研究α-synu-clein致

缝隙连接蛋白43在经穴上皮细胞和成纤维细胞中表达的实验研究

目的研究大鼠上皮细胞和成纤维细胞中缝隙连接蛋白 43 (connexin43 ,Cx43 )的表达情况 ,以深入探索Cx43在细胞缝隙连接通讯 (GJIC)及经络循经感传中的作用。方法将大鼠上皮细胞和成纤维细胞联合培养 ,运用免疫组织化学法、间接免疫荧光细胞化学法和激光共聚焦扫描显微镜 (LCSM ,LeicaTCSSP1 )进行Cx43的定位测定 ,采用流式细胞仪检测细胞膜上Cx43的表达量。结果免疫组织化学法和间接免疫荧光细胞化学法显示Cx43在共培养细胞的细胞膜上和胞浆中表达。流式细胞仪检测结果显示在上皮细胞和成纤维细胞膜上Cx43的表达量分别为 1 3 .91 %和 2 9.5 3 %。

成年SD大鼠海马齿状回神经干细胞分离培养和鉴定的改良

目的改良成年SD大鼠神经干细胞分离、培养及鉴定方法,观察神经干细胞的生长、增殖及分化特点,为后续实验提供细胞。方法从成年SD大鼠分离出完整海马齿状回,采用机械吹打法获得原代细胞,用accutase消化传代,利用cck-8法检测神经干细胞的增殖情况,利用多重免疫荧光细胞化学方法鉴定神经干细胞及其分化细胞。结果机械吹打法可高效获得原代神经干细胞,accutase消化传代更有利于神经干细胞的传代培养,cck-8法简单高效的测定了神经干细胞的增殖,多重免疫荧光创新性的动态展示了神经干细胞经诱导分化后的分化过程。结论改良后的方法可更简单高效的获得和培养出大量细胞,经多重免疫荧光鉴定所分离和培养的细胞是神经干细胞。

慢病毒介导碱性成纤维细胞生长因子在大鼠羊膜上皮细胞中的表达和分泌

目的探讨以慢病毒作为载体,将带有分泌肽的人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因片段转入大鼠羊膜上皮细胞(AECs)中,构建能稳定表达并分泌bFGF多肽的细胞载体。方法取妊娠晚期SD大鼠的羊膜组织进行AECs原代培养,用免疫荧光细胞化学和RT-PCR法鉴定;构建包含人神经生长因子(NGF)分泌肽-bFGF编码基因的慢病毒载体,并行慢病毒包装,用病毒上清对传代大鼠AECs进行感染并筛选,经免疫荧光细胞化学、RT-PCR及酶联免疫吸附法(ELISA)检测基因转染效果,体外培养观察基因转染后的细胞生长活性;用基因转染细胞的培养上清对PC12细胞进行培养,检测所分泌bFGF多肽的生物学活性。结果所培养的大鼠AECs经鉴定能表达上皮特异性标志物CK-19、神经类细胞标志物巢蛋白(nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)以及细胞多能性标志分子SSEA-4、Oct-4、Nanog、Sox2、波形蛋白(vimentin)等;经感染并筛选后扩增培养的大鼠AECs在mRNA水平及多肽水平均能检测到目的基因bFGF的表达,筛选后的转染细胞生长活性较未转染细胞明显提高,其培养上清能明显促进PC12细胞的生长和分化。结论用慢病毒作为载体能成功将bFGF基因转染入大鼠AECs中,所建立的基因修饰AECs能表达并分泌bFGF多肽,具有较强的生长活性及神经营养活性。

缺血缺氧对体外培养星形胶质细胞细胞周期和增殖的影响

目的 观察缺血缺氧损伤对星形胶质细胞细胞周期和增殖的影响。方法 用流式细胞仪检测缺血缺氧后不同时间点星形胶质细胞细胞周期变化 ,并用荧光免疫细胞化学技术测定胶质细胞纤维酸性蛋白 (GFAP)和增殖细胞核抗原 (PCNA )的表达水平。结果 体外缺血缺氧损伤后星形胶质细胞 S期较正常组明显增高 ,6 h达高峰 ,而随后则呈下降趋势。PCNA阳性反应损伤后表达均增加 ,6 h表达最高 ;在缺血缺氧早期 ,GFAP阳性染色增强 ,6 h最高 ;缺血缺氧 12 h后 GFAP阳性染色变弱。结论 缺血缺氧损伤后星形胶质细胞活化进入增殖期 ;PCNA参与了损伤后星形胶质细胞的修复和增殖 ;

TRAIL抑制原代卵巢癌细胞增殖及诱导凋亡的实验研究

目的观察肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)对原代卵巢癌细胞的生长抑制和诱导凋亡情况。方法选择12例患者的原代卵巢癌细胞,每例癌细胞分为6组,分别给予TRAIL 0、5、10、20、50、100μg/L,分别作用24、48、72、96 h。(1)噻唑蓝(MTT)比色法检测TRAIL对原代卵巢癌细胞生长抑制情况。(2)免疫荧光细胞化学法检测原代卵巢癌细胞的凋亡。结果TRAIL对原代卵巢癌细胞的抑制呈剂量依赖性,浓度大于20μg/L后抑制下降;相同浓度TRAIL对原代卵巢癌细胞的抑制呈时间依赖性,72 h后抑制下降;TRAIL浓度相同时随作用时间延长凋亡细胞数增多,5μg/L 24、96 h凋亡细胞数分别为(28±1.18)和(55±4.12),凋亡也呈剂量、时间依赖性。结论TRAIL抑制了原代卵巢癌细胞的增殖、生长并诱导了癌细胞的凋亡。

喹乙醇对草鱼肝细胞和胰腺外分泌部细胞的毒理研究

喹乙醇具有一定的蓄积毒性、遗传毒性和诱变性等毒理作用.本研究以草鱼(Ctenopharyngodonidellus)肝胰脏(Hepato-pancreas)为试验材料,通过原代细胞培养,组织化学,免疫荧光细胞化学等实验方法,运用透射电子显微镜(TEM),激光共聚焦扫描显微镜(LSCM)等手段,观察三种不同浓度的喹乙醇(Olaquindox)对体外原代培养的草鱼肝细胞和胰腺外分泌部细胞的毒理影响.结果表明,高于0.3μg?mL-1浓度的喹乙醇可显著导致草鱼肝细胞和胰腺外分泌部细胞的脂肪积累,抑制草鱼胰腺外分泌部细胞胰蛋白酶原(Trypsinogen)的合成.当添加喹乙醇1.8μg?mL-1时,可导致部分草鱼胰腺外分泌部细胞形态发生病理变化.

循环肿瘤细胞检测在子宫平滑肌肉瘤诊断中的应用效果

目的探讨循环肿瘤细胞(CTC)在子宫平滑肌肉瘤中的阳性表达率及其对子宫平滑肌肉瘤诊断的价值。方法选取收治的初治子宫平滑肌肉瘤患者20例为恶性组,另选取同期入院的子宫平滑肌瘤患者20例为良性组,同期健康体检者20例为对照组,应用淋巴细胞分离和免疫磁珠富集技术检测3组受试者外周血阳性表达率,并分析CTC与子宫平滑肌肉瘤临床病理特征的关系。结果恶性组CTC阳性率显著高于良性组及对照组,且良性组CTC阳性率显著高于对照组(P<0.05);经CTC阳性率与子宫平滑肌肉瘤病理特征关系分析显示,淋巴结转移、临床分期为Ⅲ~Ⅳ期、组织学分级为Ⅲ级、核分裂数≥10/10HPF的患者CTC阳性率明显升高(P<0.05);恶性组间质型CTC所占比例显著高于良性组,上皮型CT所占比例低于对照组(P<0.05)。结论 CTC能评估与预测子宫平滑肌肉瘤患者病情严重程度,具有一定的诊断价值。