小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白(Imp)基因的克隆和分子特性分析

【目的】探讨小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白在介体-病原-寄主互作的分子机理。【方法】通过植原体免疫膜蛋白基因序列两侧的保守区设计引物对Imp1051/Imp2265,用PCR方法扩增小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白基因;对扩增片段的最大开放阅读框和基因的同源矩阵、系统发育树分析;对克隆基因所编码蛋白进行跨膜区、亲疏水区和前导信号序列分析。【结果】从小麦蓝矮病病株和接种长春花中均扩增到约1.0kb的特异片段,其中小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白基因长495bp,推导的编码蛋白含有164个氨基酸。与10种植原体的免疫膜蛋白基因进行序列同源性分析,小麦蓝矮与三叶草绿变植原体同源性最高,核苷酸和编码的氨基酸序列的同源率分别为98.4%和95.1%。蛋白质结构分析结果表明:小麦蓝矮免疫膜蛋白N端有一个跨膜的前导信号序列,C端为跨膜锚定区,中间为膜外亲水区。【结论】小麦蓝矮植原体与三叶草绿变、翠菊黄化、洋葱黄化和泡桐丛枝植原体的免疫膜蛋白为同型蛋白。

花生丛枝植原体免疫膜蛋白基因克隆及细菌双杂交诱饵质粒构建

初步分析植原体免疫膜蛋白的结构,以Imp构建诱饵质粒,为研究植原体与寄主互作的分子机理,探讨植原体传播、侵染及在寄主内的运输方式奠定基础。根据本实验室获得的花生丛枝植原体免疫膜蛋白基因序列设计特异性引物Imp-F/Imp-R,通过PCR扩增获得花生丛枝植原体免疫膜蛋白基因,大小519 bp,编码蛋白含有172个氨基酸残基,与SPWB膜蛋白的核苷酸差异一个碱基,氨基酸序列相同。另外与WBDL膜蛋白的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为79.8%和70.2%。对其进行系统发育树分析;初步分析imp基因编码蛋白的跨膜区和疏水区。分析结果表明:花生丛枝植原体免疫膜蛋白C端有一跨膜锚定区,N端主要为膜内亲水区,没有前导信号序列。预测花生丛枝植原体免疫膜蛋白是一类C端跨膜的植原体免疫膜蛋白。将imp基因克隆到带有λcI基因的pBT质粒上,构建诱饵载体pBT-Imp,并通过IPTG诱导表达,western blot检测和自激活检验对其进行检测。结果显示:所构建的诱饵载体pBT-Imp可用于细菌双杂交的进一步实验。

培养时间对小鼠树突状细胞及其外泌体免疫相关膜蛋白的影响

目的明确培养时间对树突状细胞及其外泌体免疫相关膜蛋白(CD80、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ)的影响,为今后相关研究提供实验依据。方法小鼠骨髓细胞经重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素4(IL-4)诱导分化成树突状细胞,再加入肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导为成熟树突状细胞;超速离心法提取外泌体;蛋白印迹法和Amnis量化成像流式细胞仪对外泌体进行鉴定;Amnis量化成像流式细胞仪检测小鼠树突状细胞以及树突状细胞外泌体膜上免疫相关蛋白CD80、CD11c、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ的表达情况。结果体外培养第5天后,约50%以上的树突状细胞表达CD80、CD11c、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ,第13天达最高水平,其中CD80阳性率为(97.29±0.63)%,CD11c阳性率为(92.31±1.18)%,MHC-Ⅰ阳性率为(97.91±0.49)%,MHC-Ⅱ阳性率为(97.91±0.49)%,差异具有统计学意义(P<0.001)。第13天后逐渐减少,至第30天,仍有约80%的树突状细胞表达MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ免疫分子。外泌体膜上CD80、CD11c、和MHC-Ⅱ表达水平以第5天最高,然后随培养时间延长,总体呈下降趋势,除外MHC-Ⅰ分子,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论体外培养的小鼠树突状细胞表达较高的免疫相关膜蛋白,在合适的培养条件下可长时间稳定维持。其分泌的外泌体表面也携带有丰富的免疫相关膜蛋白,但树突状细胞与外泌体膜表面的免疫相关蛋白未发现明显相关性。

小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白(Imp)的跨膜区影响其在大肠杆菌中的表达

根据跨膜区预测结果,设计ImpF1/ImpR1和ImpF2/ImpR2两对特异性引物。以ImpF1/ImpR1,ImpF1/ImpR2,Imp-F2/ImpR1和ImpF2/ImpR2共4个组合经PCR扩增得到4个目标片段,即:免疫膜蛋白Imp基因的全长(Imp-B);切除C-端跨膜区的Imp基因的基因序列(Imp-N);切除N-端跨膜区的Imp基因的基因序列(Imp-C);切除N-和C-端跨膜区的Imp基因的基因序列(Imp-S)。经酶切连接到原核表达载体Pmal-c2x,并转入E.coliBL21(DE3)PlysS菌株中。SDS-PAGE电泳验证,只有切除N-、C-端跨膜区的Imp基因的基因序列(Imp-S)得到大量表达,结果表明:小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白的跨膜区影响其在大肠杆菌中的表达。根据跨膜区预测结果,设计ImpF1/ImpR1和ImpF2/ImpR2两对特异性引物。以ImpF1/ImpR1,ImpF1/ImpR2,Imp-F2/ImpR1和ImpF2/ImpR2共4个组合经PCR扩增得到4个目标片段,即:免疫膜蛋白Imp基因的全长(Imp-B);切除C-端跨膜区的Imp基因的基因序列(Imp-N);切除N-端跨膜区的Imp基因的基因序列(Imp-C);切除N-和C-端跨膜区的Imp基因的基因序列(Imp-S)。经酶切连接到原核表达载体Pmal-c2x,并转入E.coliBL21(DE3)PlysS菌株中。SDS-PAGE电泳验证,只有切除N-、C-端跨膜区的Imp基因的基因序列(Imp-S)得到大量表达,结果表明:小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白的跨膜区影响其在大肠杆菌中的表达。

检测马传贫病毒跨膜蛋白主要免疫决定区抗体间接ELISA诊断方法的建立

本试验以纯化的重组马传贫病毒跨膜蛋白主要免疫决定区蛋白作为诊断抗原建立了间接ELISA诊断方法,确定其最佳工作条件为每孔包被重组抗原2μg,兔抗马IgG酶标抗体以1∶4000,血清以1∶40倍稀释,底物作用时间为10min;判定标准为P/N值大于2,且OD值大于0.2的血清为阳性,否则判为阴性。本试验所建立的诊断方法与琼扩试验以及以琼扩抗原作为包被抗原的ELISA试验进行了比较,表明该诊断方法敏感性更高。特异性和重复性试验表明该诊断方法具有良好的特异性和重复性。通过对4匹马传贫驴白细胞弱毒疫苗免疫马血清抗体的检测,发现均在接种2周后可产生抗马传贫病毒跨膜蛋白主要免疫决定区相应抗体。此抗体一直持续存在到本试验检测的免疫后17个月,且效价较高。用此方法检测203份马血清样品,其中161份呈抗体阳性,还检测了马传贫自然感染马血清93份,结果全部为阳性。

马传贫驴白细胞弱毒疫苗株跨膜蛋白主要免疫决定区基因的克隆与表达

从感染驴白细胞的马传贫驴白细胞弱毒疫苗株前病毒DNA中克隆了编码跨膜蛋白主要免疫决定区 (TMIR)的基因 ,并在大肠杆菌中进行了表达。所表达的融合蛋白有一部分是可溶的 ,其氨基端带有 6个组氨酸的标签 ,因此可以用固定化金属离子亲和层析法在非变性条件下进行纯化。在间接酶联免疫吸附试验 (ELISA)和免疫印迹试验中 ,重组的TMIR蛋白可与马传贫阳性血清样品发生反应 ,而与健康马血清无任何反应。这表明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性 ,可用于马传贫弱毒疫苗株在体内外复制、接种马体内免疫应答及马传贫诊断的研究。

植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体构建及表达

旨在构建植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体,并进行初步表达。以重组克隆质粒pMD18-T-Imp为模板,PCR扩增Imp基因片段。构建表达载体pET-28a(+)-Imp,转化宿主菌E.coliBL21(DE3)。筛选阳性克隆,提取重组质粒作PCR鉴定、酶切鉴定及IPTG诱导表达鉴定。PCR及双酶切结果显示,重组质粒pET-28a(+)-Imp构建成功。经IPTG诱导BL21(pET-28a(+)-Imp)表达约20 kD的蛋白,与预期的携带6×His-Tag的目的蛋白(19.5 kD)大小相符,主要以包涵体形式存在。结果显示,构建的表达载体pET-28a(+)-Imp在E.coliBL21(DE3)中能够达一定量表达,为进一步纯化Imp蛋白奠定基础。

植原体免疫主导膜蛋白A的原核表达载体构建、表达及其抗血清制备

目的构建植原体免疫主导膜蛋白A(IdpA)的原核表达载体,表达并纯化目的蛋白,制备抗血清。方法以重组克隆质粒pMD18-T-IdpA为模板PCR扩增IdpA基因片段,经酶切连接将IdpA基因克隆到原核表达载体pET-28a(+),重组质粒转化感受态E.coli BL21(DE3),PCR和双酶切进行鉴定。IPTG诱导重组菌表达IdpA蛋白,并进行纯化和鉴定,以纯化获得的IdpA蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠制备抗血清,并采用ELISA和Western blot法检测抗血清的效价和特异性。结果成功构建了原核表达载体pET-28a(+)-IdpA,并在大肠杆菌中能稳定表达IdpA蛋白,经纯化获得了纯度大于90%的高纯度目的蛋白,用纯化的IdpA蛋白免疫BALB/c小鼠,获得了效价高于1∶320 000的强特异性抗IdpA蛋白抗血清。结论成功进行了IdpA的原核表达并制备了抗血清。

枣疯植原体免疫优势膜蛋白基因imp-DZ的克隆与原核表达

【目的】为了解枣疯植原体免疫优势膜蛋白的特征,并进行初步表达。【方法】对北京农学院农业农村部华北都市农业重点实验室测得的枣疯植原体JWB-Dongzao免疫优势膜蛋白基因imp-DZ序列进行一致性、进化树和蛋白信号肽与跨膜区分析,分别设计引物扩增完整imp-DZ序列和去除跨膜区编码序列,克隆到蛋白表达载体pBM30上进行原核表达。【结果】imp-DZ基因序列大小为459 bp,编码152个氨基酸,除与枣疯植原体Jwb-nky中一个编码假定蛋白的基因一致性达到96%之外,与其他植原体imp基因核苷酸和氨基酸序列一致性均低60%。枣疯植原体JWB-Dongzao的imp-DZ与16SrV组其他成员imp基因聚在一个分支。携带Imp-DZ跨膜区的重组菌无法表达该蛋白,去掉跨膜区后蛋白得到大量表达。【结论】该研究成功表达了枣疯植原体的免疫优势膜蛋白Imp-DZ,证实了跨膜区影响其在大肠杆菌中的表达,为下一步制备该蛋白抗血清和探索植原体与寄主植物互作机制提供依据。

鼻咽癌组织潜伏膜蛋白1不同抗原修复方法的比较研究

目的 探讨鼻咽癌组织LMP1的最佳修复方法。方法切片常规脱蜡至水,每例切5张切片分为5组,用 微波加热、胰蛋白酶消化,高压锅加热、蒸馏水煮修复处理。结果 应用蒸馏水煮的效果最好。结论对于比较难 检测的鼻咽癌组织LMP1抗原,应用蒸馏水煮修复方法可以获得良好的染色结果。

TMIGD1通过促进细胞黏附抑制胃癌细胞侵袭、迁移能力的研究

目的探究免疫球蛋白结构域的跨膜蛋白1(TMIGD1)在胃癌组织中的表达情况及其与胃癌细胞侵袭、迁移、黏附的关系。方法收集60份胃癌患者病理组织标本,通过免疫组化染色检测TMIGD1的表达情况,并分析其与患者临床指标的关系。进一步挖掘TCGA数据库,通过Transwell、Western Blotting、细胞黏附率实验探究过表达TMIGD1对胃癌细胞侵袭、迁移、黏附的影响。结果TMIGD1在胃癌组织中呈低表达,TMIGD1阳性组黏液腺癌、发生淋巴脉管浸润的占比低于TMIGD1阴性组(P<0.05)。过表达TMIGD1可明显抑制胃癌细胞株AGS与BGC803的侵袭、迁移能力,提高细胞黏附能力(P<0.05)。结论TMIGD1在胃癌组织中呈低表达,过表达TMIGD1能够通过促进胃癌细胞黏附来抑制细胞侵袭、迁移。

植原体膜蛋白研究进展

植原体是一种无细胞壁的植物病原细菌,分布广泛,对世界上1 000多种植物都会造成影响。植原体主要是通过刺吸式口器昆虫如飞蝉等的唾液腺传播,而植原体膜蛋白是主要的致病因子,会直接作用于宿主。目前尚不清楚免疫膜蛋白与宿主的互作机制。本文综述了植原体形态特征、传播途径、基因组分类,尤其是植原体膜蛋白方面的近期研究进展,并对今后植原体膜蛋白的研究趋势进行了展望。