应用改进的免疫荧光组织化学染色法对水稻根尖细胞微管结构的观察

植物细胞微管在细胞形态建成中具有重要作用。它体积小,且结构始终处于动态变化之中,因此观察到清晰的微管形态有一定的困难。本实验以水稻根尖为材料,介绍了一种改进的植物细胞微管免疫荧光组织化学染色方法,用此方法可以观察到清晰、完整的植物微管形态,此法对观察其它植物细胞微管结构也具有指导作用。

抗黑素细胞抗体免疫荧光细胞化学检测条件探讨

目的建立一种简单、实用、准确的抗黑素细胞抗体免疫荧光细胞化学检测方法,用于白癜风患者血清抗黑素细胞抗体的检测及其相关抗原分析研究。方法青少年包皮组织经分离酶(Dispase)Ⅱ及胰酶消化后,获取细胞悬液,用M2黑素细胞培养基及Accutase细胞消化液选择及扩大培养,取第3代黑素细胞在培养皿中直接用冷甲醇固定(-20℃),白癜风患者及健康人血清用抗体稀释液按1:10比例稀释进行反应,洗涤后加入FITC标记的羊抗人抗体,封片后荧光显微镜下观察;取不同荧光强度的标本血清用Western-Blot法进一步验证检测。结果获得高纯度、高活性的黑素细胞,黑素细胞在培养皿中经冷甲醇直接固定后细胞形态保持完整,实验过程无脱落,与白癜风患者及健康人对照血清反应后在荧光显微镜下发出不同亮度荧光,强阳性血清荧光强度+++^++++,发光部位为黑素细胞胞质和胞膜;弱阳性血清发光较明亮,亮度+^++,发光部位主要集中在胞膜;阴性血清不发光,只见隐约细胞轮廓,相同血清经重复检测2次后结果相同;经Western-Blot检测后证实黑素细胞胞质和胞膜有多种蛋白与抗黑素细胞抗体阳性血清结合,蛋白染色带的部位及颜色深浅与免疫荧光法检测结果相一致。结论本文建立的抗黑素细胞抗体的免疫荧光细胞化学检测方法简单、准确、重复性好,可全面地反映体内抗黑素细胞抗体表达水平,适用于临床检测及相关抗原的基础研究。

免疫荧光细胞化学和免疫酶细胞化学染色方法检测IgA肾病患者尿足细胞的效果比较

目的：比较免疫荧光细胞化学和免疫酶细胞化学染色2种方法检测IgA肾病（IgAN）患者尿足细胞的效果，为尿足细胞检测方法的选择提供依据。方法：收集43例确诊为IgAN患者（实验组）和10例正常对照研究对象（对照组）活检前连续3d的晨尿各200mL，离心上清制成涂片。IgAN患者按Lee分级分成Lee I～LeeV组。采用抗人足细胞表面标记蛋白Podocalyxin（PCX）单克隆抗体对尿沉渣涂片分别行免疫荧光细胞化学和免疫酶细胞化学染色，荧光显微镜和普通光学显微镜下计数2组研究对象尿足细胞数；采用Spearman相关分析法分析2种方法检测IgAN患者尿足细胞数的相关性。结果：2种方法检测的对照组研究对象尿中未见足细胞，2种方法检测实验组研究对象尿中均可见足细胞；免疫荧光细胞化学法检测足细胞阳性率和检出中位数低于免疫酶细胞化学法，2种方法检测尿足细胞阳性率和中位数比较差异均有统计学意义（P〈0．05）；2种方法检查患者尿足细胞数呈明显的正相关关系（r=0．842，P〈0．01）。结论：采用免疫酶细胞化学法检测同一份尿标本的效果优于免疫荧光细胞化学法。

胚胎脑片免疫荧光组织化学双重漂染技术在神经元发生研究中的应用

目的为更客观地观察胚胎脑神经祖细胞的增殖、分化和迁移,建立胚胎脑片免疫荧光组织化学双重漂染技术。方法灌流固定,取胚胎14天(E14)大鼠脑,低熔点琼脂糖包埋,振动切片机连续冠状切片,免疫荧光组织化学双重漂染,激光扫描共聚焦显微镜下观察。结果波形蛋白(Vimentin)和乙酰胆碱转移酶(ChAT)双阳性细胞呈黄色荧光,胞体位于脑室区,长突起呈放射状。ChAT阳性细胞呈红色荧光,除胞体位于脑室区,长突起呈放射状伸展外,可见皮层板区也有阳性细胞集聚。结论此项技术可直接观察到胚胎脑神经祖细胞和成神经细胞的完整形态,并通过免疫荧光组织化学方法鉴定其表型,从而阐明相互之间的关系。

一种不溶血红细胞免疫荧光细胞化学检测方法的建立

目的以氯通道蛋白ClC-3为靶蛋白,建立一种不溶血的红细胞免疫荧光细胞化学检测方法。方法采集大鼠红细胞,涂片,0.5%丙烯醛/PBS固定,以不同浓度的Triton X-100/PBS(含0.1 mol/L甘氨酸)溶液透膜,用含0.05 mmol/L甘氨酸、2%BSA、0.05%NaN3的PBS溶液封闭抗原,随后孵育ClC-3的一抗和荧光标记的二抗,最后在共聚焦荧光显微镜下观察结果。结果 0.1%Triton X-100/PBS结合其他优化液处理的红细胞未出现溶血现象,共聚焦显微镜下清晰地观察到目的蛋白及其亚细胞分布情况。结论通过优化固定液、透膜液、封闭液和洗涤液,解决了常规免疫细胞化学法导致红细胞易溶血的缺点,在确保红细胞不溶血的同时成功检测到红细胞氯通道ClC-3蛋白,即成功建立了一种不溶血的红细胞免疫荧光细胞化学检测方法。

3',5'-cAMP对不同瘤龄的艾氏腹水癌细胞内cAMP免疫荧光细胞化学反应及其磷酸二酯酶的细胞化学反应与癌细胞膜表面某些形态学变化的关系

本工作用外源性cAMP加氨茶碱对小鼠艾氏腹水癌细胞进行了多方面的研究,观察到外源性3′,5′-cAMP不仅对小鼠艾氏腹水癌细胞增殖有显著的抑制作用。在接种后第9天,看到癌细胞增殖受到抑制的同时,大多数癌细胞胞质内的cAMP免疫荧光细胞化学反应增强,癌细胞内3′,5′-cAMP磷酸二酯酶(PDE)活性受到抑制,此外,还观察到某些癌细胞表面膜上微绒毛消失或变短以及对植物凝集素的凝集反应减弱等现象,这些癌细胞的逆转表现的变化均与不同瘤龄的癌细胞有关,如经外源性cAMP处理后,cAMP-PDE活性降低出现的最早,均在接种后5~7天时最为明显,cAMP免疫荧光细胞化学反应是在接种后第9天最为显著,癌细胞表面膜上的微绒毛消失和变短的细胞比数明显增多,对植物凝集素的凝集反应减轻都是在接种后7~9天时最为显著,而cAMP对小鼠艾氏腹水癌细胞的增殖抑制作用是在接种后第9~11天最为明显。根据上述实验结果,本文讨论了外源性cAMP加氨茶碱对腹水癌细胞的抑制作用和癌细胞内cAMP荧光反应,3′,5′-cAMP-PDE活性以及癌细胞表面膜上微绒毛形态学变化的因果关系。

大白鼠心脏心房肽免疫荧光组织化学研究

心房肽是从心房组织中提取、分离、纯化的一类活性肽,它具有利尿、利钠等作用。我们利用免疫荧光组织化学方法,观察了大白鼠心脏壁内心房肽免疫荧光物质的定位和分布。注意到心房肽免疫荧光物质,广泛存在于心房肌细胞内,以核周肌浆部为丰富,亦可见于肌原纤维之间或肌膜下.

雅培i2000全自动免疫发光仪与艾克美免疫荧光分析仪检测总前列腺特异性抗原的比对研究

目的探讨雅培i2000全自动免疫发光仪用化学发光免疫分析法,与杭州中翰盛泰科技有限公司艾克美免疫荧光分析仪用免疫荧光干化学层析法检测总前列腺特异性抗原(TPSA)的可比对性。方法对免疫荧光干化学层析法定量检测TPSA进行了性能评价,内容包括批内重复性、线性、准确度。结果该法重复测定高、低值样本,CV<10%;线性回归方程Y=0.9748X+0.048;与化学发光免疫法的相关性分析,r=0.984。结论免疫荧光干化学层析法定量检测系统与雅培i2000全自动大型化学发光仪具有良好的重复性、线性和方法学的相关性,非常适合临床实验室门诊急诊及小批量样本时使用。

冰冻切片免疫荧光细胞技术的改良

由于免疫荧光细胞化学的特异性、快速性和在细胞水平定位的敏感性与准确性,已在病理学诊断方面得到广泛应用。本文就我科多年的荧光技术实际操作中的经验体会做个介绍。

NF1基因表达产物在大鼠脑的分布-免疫荧光组化法

用免疫荧光组织化学方法观察了 NF1基因表达产物神经纤维素在正常成年大鼠脑中的分布 ,结果如下 :(1)大脑皮质中神经纤维素阳性细胞最为密集 ;其次 ,在海马结构、丘脑前核群、丘脑内侧核群、丘脑板内核群、丘脑中线核群及下丘脑室周核、室旁核中神经纤维素阳性细胞也较密集 ;在杏仁核、下丘脑前区、下丘脑外侧区、下丘脑后区以及隔外侧核、隔内侧核、尾壳核、屏状核、苍白球、三叉神经脊束核等部位 ,也可见到数量不等的神经纤维素阳性细胞稀疏分布。 (2 )神经纤维素免疫阳性反应产物除了分布于神经细胞胞质外 ,在细胞核也有分布。 (3 )结合抗星形胶质细胞特异性酶 (胶质纤维酸性蛋白 )免疫组化反应 。

卵泡刺激素及其受体在大鼠肝的免疫荧光定位

目的：观察卵泡刺激素（FSH）及其受体（FSHR）在大鼠肝中免疫组织化学定位,为FSH能否参与肝代谢功能的调节提供形态学依据.方法：应用免疫荧光组织化学显色,在激光扫描共焦显微镜下观察FSH在大鼠肝脏中的分布结果.结果：FSH和FSHR免疫反应阳性物质分布在大鼠肝细胞的细胞质,不同部位的肝细胞FSH及其受体免疫反应强度存在差别.结论：FSH及其受体存在于大鼠肝部分细胞中,不同部位的肝细胞对FSH受体表达水平存在差异.肝中的部分细胞共同存在FSH及其受体,FSH可能通过旁分泌或自分泌的途径对肝功能起调节作用.

FSHR、ER-α在胃癌组织中的免疫荧光分布及其与GnRHR的共定位观察

目的:研究卵泡刺激素受体(FSHR)和雌激素受体α (ERα)在胃癌组织中的定位、分布及与促性腺激素释放激素受体(GnRHR)共存性。方法:采用免疫荧光化学定位方法。结果:胃癌组织上皮细胞呈FSHR和ERα免疫反应阳性;在胃癌组织中GnRHR免疫反应阳性细胞中观察到了FSHR免疫反应阳性的结果,其中大部分亦呈ERα免疫反应阳性,且分布模式相同;三种免疫反应阳性物质均分布在细胞质内,细胞核呈阴性。结论:GnRHR与FSHR或ERα在胃癌组织分布及其共存性上提示上述相关激素对胃癌的病理发生机制具有重要的影响.

免疫荧光双标对肝细胞癌及癌旁异型增生肝细胞Ki-67与AMACR和RAS表达的定位分析

目的对肝细胞癌(hepato celluar carcinoma,HCC)及其癌旁异型增生肝细胞Ki-67与α-甲酰基-辅酶A消旋酶(alpha-methylacyl-coenzyme A racemase,AMACR)和RAS表达进行定位分析,探讨AMACR的表达在HCC发生中的意义。方法 90例人HCC、90例癌旁肝组织制作组织芯片,以20例正常肝组织对照。用免疫荧光双标法,通过激光共聚焦显微镜,分析AMACR在肝细胞癌和癌旁异型增生肝细胞的表达与Ki-67、癌基因蛋白RAS表达的原位定位关系。结果 HCC组织中AMACR的表达显著高于癌旁肝组织,而且在HCC组织中AMACR的表达多呈弥漫性分布;HCC组织中显示Ki-67标记指数比癌旁组织高。结论 AMACR可能参与RAS信号在肝细胞异型增生和HCC早期发生的信号机制。

大鼠限制性体位窒息模型中膈肌Fn和HSP70的免疫荧光组化观察

目的观察Fn和HSP70在限制性体位窒息死亡的大鼠膈肌中的表达情况,进一步探讨限制性体位窒息死亡的机理。方法分组建立限制性体位窒息死亡大鼠模型,采用免疫荧光组织化学方法研究大鼠膈肌的Fn和HSP70的表达情况,并将荧光照片进行灰度值分析,比较抗原在不同组别间的表达差异。结果在Fn检测中,限制性体位窒息死亡组大鼠的膈肌肌内膜上有明亮荧光,肌纤维间隙的荧光强度明显大于对照组。在HSP70检测中,肌纤维内的荧光强度随着体位性限制程度的加重而明显增加。结论采用免疫荧光组织化学检测膈肌Fn和HSP70抗原的表达,对判断限制性体位窒息死亡者膈肌的损伤是一种有意义的手段。

免疫细胞化学双染技术探讨

在临床与实验病理研究中,常用到免疫细胞化学双染技术。它可在同一细胞内定性、定位、定量的显示出两种抗原成分,利于研究人员了解细胞间的形态和机能的关系,以及抗原成分间的相互关系。我们在小鼠脾脏调节性T细胞在过敏性鼻炎发病机制中的作用[1,2]和摸索体外培养胚胎大鼠背根神经节细胞作为感音神经性聋治疗的新途径[3]的实验中均使用了该技术,

免疫细胞化学法检测尿足细胞的临床应用

目的:免疫荧光细胞化学和免疫酶细胞化学两种方法检测尿足细胞的比较,以促其临床推广应用。方法:尿标本均为我科住院患者的肾活检日新鲜晨尿,采用抗人足细胞标记蛋白Podocalxin(PCX)单克隆抗体进行尿沉渣免疫荧光细胞化学和免疫酶细胞化学染色。14例患者均经肾活检,肾组织由光镜、免疫荧光和电镜检查做出病理诊断。结果:(1)14份尿标本应用免疫荧光细胞化学和免疫酶细胞化学方法均可检测到足细胞。(2)同一份尿沉渣采用免疫荧光细胞化学法检测足细胞均数为(16.7±15.1)/HP,而免疫酶细胞化学法检测足细胞均数为(26.1±24.3)/20HP,两组比较有统计学意义(P<0.05);但两种方法所测足细胞数之间有很好的相关性(r=0.969)。结论:免疫荧光细胞化学和免疫酶细胞化学两种方法检测尿足细胞,前者较简便、镜下易辨认,后者设备简单、标本可保存。

成人鼻腔嗅区黏膜细胞的分离培养与免疫学特点

目的探讨成人鼻腔嗅区黏膜细胞的分离培养方法及嗅鞘细胞(OECs)的免疫学特点。方法通过手术取成人嗅区黏膜7例,将其消化为单个细胞后采用差速贴壁法除去成纤维细胞。倒置显微镜下行形态学观察,并利用p75、S100、GFAP抗体对嗅鞘细胞进行免疫荧光化学染色,共焦显微镜下进行各种抗体阳性率的统计。结果共焦显微镜下可见嗅黏膜细胞中S100和p75阳性细胞多见,GFAP阳性细胞在嗅黏膜细胞中较少见。一般在同一细胞上可见S100和p75共同表达,而GFAP与S100、p75未见有共同表达现象;p75阳性细胞胞体大小和形态也大不相同。经统计S100和p75阳性细胞的平均百分率为(35.0±8.3)%。结论成功进行了成人鼻腔嗅区黏膜细胞的分离培养。

EgM9蛋白免疫犬肠系膜淋巴结中抗体的免疫荧光组织化学定位

以EgM蛋白免疫犬、EgM蛋白免疫后感染原头蚴犬及感染原头蚴犬3个组的肠系膜淋巴结为材料,用FITC标记羊抗犬IgG和羊抗兔IgG,分别采用一步法和三步法免疫荧光技术检测EgM蛋白免疫犬肠系膜淋巴结上的IgG和特异性IgG。结果显示,EgM蛋白免疫犬、EgM蛋白免疫后感染原头蚴犬的肠系膜淋巴结组织有清楚可见的荧光点,而感染原头蚴犬的肠系膜淋巴结荧光较弱。两种方法均证明,EgM蛋白免疫犬后在其肠系膜淋巴结中可以产生特异性抗体。

谷氨酸脱羧酶67-绿色荧光蛋白基因敲入小鼠三叉神经尾侧亚核内GFP阳性神经元的分布及与小白蛋白的共存

目的观察谷氨酸脱羧酶67-绿色荧光蛋白（GAD67-GFP）基因敲入小鼠三叉神经尾侧亚核（Vc）浅层内，表达GFP的GABA能神经元的分布及其与小白蛋白（PV）的共存。方法分别运用原位分子杂交与免疫组织化学相结合；GFP与神经元标记物——神经元核蛋白（NeuN）或PV免疫荧光染色相结合的双重标记方法，在光学显微镜和激光共聚焦显微镜下进行观察。结果1．Vc浅层内90％以上的GFP阳性神经元同时表达GAD67 mRNA，而几乎所有表达GAD67 mRNA的阳性神经元都呈GFP阳性；2．GFP阳性神经元主要分布于Ｖc的Ⅰ－Ⅱ层内，细胞较小，尤其在Ⅱ层内可见大量密集分布的GFP阳性细胞和突起。GFP阳性神经元分别占Ⅰ、Ⅱ层内NeuN阳性神经元总数的19．4％和24．3％；3．GFP／PV双标神经元主要分布于Ｖc的Ⅰ－Ⅱ层，这些双标神经元大约占PV阳性神经元的62．4％，占GFP阳性神经元的12．8％。结论在Ｖc表达GFP的GABA能神经元主要密集分布于与外周伤害性信息传递关系密切的板层内，且大部分PV样阳性神经元属于GABA能神经元。

影响共聚焦荧光法检测单细胞中蛋白表达的因素探讨

采用免疫荧光技术联合共聚焦技术研究不同培养细胞中蛋白的表达及定位.结果发现:①同样以丙酮固定293细胞,不用0.5%Triton X-100处理,着丝粒蛋白E亚型(CENP-E)在分裂期细胞核周浓聚,核内未见;而用0.5%TritonX-100处理后,CENP-E呈散点状分布于分裂期细胞的核内.②分别以甲醇、95%乙醇和4%多聚甲醛固定并以1%TritonX-100处理k562细胞,不同固定剂处理组间结果无明显差异,信号转导与转录激活因子(STAT3)均定位于胞浆.共聚焦系统PMT=511时,显示胞核染色适中,核仁染色明显,而PMT=593时,整个核呈饱和染色状,微细结构不清楚.③以2%甲醛联合0.5%TritonX-100处理平滑肌细胞,固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(SCAP)在整个细胞中呈弥散性分布,核内含量较高,高尔基体上SCAP无特异性高表达.结论:是否使用TritonX-100处理对293细胞中核蛋白CENP-E的定位具有较大影响;k562细胞对醛类固定剂及醇类固定剂无特殊选择性,图片采集时共聚焦参数PMT对蛋白定位结果也有影响;醛类固定剂和Triton联用可准确定位SCAP在平滑肌细胞中的表达.