化脓隐秘杆菌间接免疫荧光方法的建立及应用

通过制备兔抗化脓隐秘杆菌(Trueperella pyogenes)高免血清,筛选固定方法、封闭液、洗涤液、抗体稀释度、抗体孵育时间等应用条件,建立一种检测化脓隐秘杆菌的间接免疫荧光方法。结果表明:用冷丙酮作固定剂,10%山羊血清作封闭液,0.05%Tween–20的0.01 mol/L pH 7.4 PBS(磷酸缓冲盐溶液)作洗涤液,兔抗化脓隐秘杆菌高免血清(一抗)1∶50稀释,37℃作用2 h,羊抗兔FITC(二抗)1∶100稀释,37℃作用2 h,草酸铵结晶紫衬染菌体3 min,对纯培养物化脓隐秘杆菌检测,可见清晰的特异性荧光,能区分溶血隐秘杆菌、伪结核棒状杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门氏菌、猪链球菌;在人工感染化脓隐秘杆菌死亡小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及发病山羊临床病料中均能检出化脓隐秘杆菌。

探讨改进的免疫荧光方法检测尿液足细胞的实用性

目的介绍一种改进的尿液足细胞检测方法并探讨其临床实用性。方法采用免疫荧光法,在验证足细胞抗体特异性的基础上,从制片和荧光染色两方面对我实验室原检测尿足细胞方法加以改进,并对改进前后尿足细胞检出率和平均检出足细胞数量进行比较。结果①小鼠抗人Podocalyxin(PCX)单克隆抗体仅与肾组织的肾小球足细胞及肾脏病患者尿中足细胞特异结合;②尿沉渣涂片改为甩片,沉渣中有形成分调至适度可以减少脱片;③荧光染色同时用PI复染细胞核,可显著提高足细胞的分辨率,在狼疮肾炎Ⅳ型患者中,方法改进后平均足细胞数(16.85±12.56)个/20HP,明显高于方法改进前的(3.16±3.06)个/20HP,两组比较有显著性差异(P<0.05)。结论小鼠抗人PCX抗体可用于鉴别尿足细胞,经改进的方法能明显提高足细胞检出率。

用免疫荧光方法检测PVR增生膜中的EGFR

目的 观察表皮生长因子受体(EGFR)在增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的增生膜(PRM)中的表达,并判断EGFR阳性细胞可能的来源。方法 PVR增生膜43例,按病程分为3期,采用免疫荧光法检测其EGFR表达并做定量分析;采用免疫荧光双重标记技术判定EGFR阳性细胞来源。结果 早期膜中阳性荧光总量约为中期膜的2.06倍,12例晚期膜均表达阴性;EGFR表达阳性的细胞,细胞角蛋白(cytokeratinpan)和巨噬细胞标记抗体(HAM-56)呈阳性表达。结论 视网膜色素上皮细胞及巨噬细胞具有EGFR,在PVR早期的发生发展起重要作用。

鸡传染性法氏囊病活疫苗(B87株)病毒含量细胞间接免疫荧光方法的建立

为测定鸡传染性法氏囊病活疫苗(B87株)的病毒含量,采用Vero细胞建立鸡传染性法氏囊病活疫苗(B87株)病毒含量细胞间接免疫荧光方法,测定细胞半数感染量(TCID50)。通过与传统鸡胚半数致死量(ELD50)方法进行敏感性和相关性比较,间接免疫荧光方法具有更高的敏感性,两种方法的相关系数r为0.823。间接免疫荧光方法的建立为该疫苗的检验提供了一种新途径。

两种免疫荧光方法检测肺炎衣原体抗体的比较

目的 比较研究两种免疫荧光技术检测抗肺炎衣原体 (Cpn)特异性抗体的方法学 ,以选择一种适合国内医院开展的技术。方法 应用间接免疫荧光滴定平板技术和微量免疫荧光 (MIF)试验对 171例患者进行了Cpn特异性IgG、IgA、IgM抗体的检测。 结果 两种方法无论是方法学还是特异性、敏感性均无明显的差异 ,但间接免疫荧光滴定平板检测结果的荧光模型清晰、易辨认。

微波微量免疫荧光检测斑点热立克次体方法的建立

目的 建立微波免疫荧光检测斑点热立克次体的方法。方法 通过微波促免疫荧光染色最佳时间、最佳火力的选择及微波免疫荧光方法与常规免疫荧光方法敏感性的比较。结果表明 :微波法反应速度快 ,只需 15min就可以观察结果 ,大大缩短了检测时间 ,提高了工作效率 ,并且两种方法在特异性上没有显著性差别。结论 我们认为微波免疫荧光方法是一种简便的、实用的快速检测立克次体的方法。

狂犬病病毒HepFlury株P蛋白单克隆抗体的制备及间接免疫荧光检测方法的建立

本研究以原核表达的融合型的重组蛋白pET32a（＋）-P（狂犬病病毒HepFlury株P蛋白）免疫6-8周龄的BALB/c小鼠,取脾细胞和SP2/0按常规杂交瘤技术进行细胞融合,经间接免疫荧光方法（IFA）筛选及对mAb进行初步鉴定。经3次亚克隆后获得1株稳定分泌表达的杂交瘤细胞株5G8。

牦牛肠道病毒间接免疫荧光检测方法的建立与初步应用

为了建立准确、快速的牦牛肠道病毒(yak enterovirus)检测方法,利用本实验室已获得的一株牦牛肠道病毒SWUN-AB001,免疫健康兔获得抗SWUN-AB001高免血清,建立了一种检测牦牛肠道病毒的间接免疫荧光试验(IFA)方法,并对其工作条件和时间进行筛选,优化出最佳条件。采用该方法对40份临床腹泻样本进行了牦牛肠道病毒的检测,并与RT-PCR的检测结果进行比较。结果表明:获得的高免血清在该IFA方法中的最佳稀释度为1∶100,工作时间为30min;FITC标记的羊抗兔IgG(二抗)的稀释度为1∶800,工作时间为45min,牦牛肠道病毒特异性亮绿色荧光颗粒清晰可见;同时与牛病毒性腹泻病毒、轮状病毒、大肠杆菌、沙门菌、葡萄球菌和空肠弯曲杆菌反应均未见明显的荧光颗粒;该方法能够检测SWUN-AB001病毒的最低浓度约为20TCID50·mL-1;该方法的临床检测结果与RT-PCR的检测结果之间无差异(P=0.329)。结果表明该方法特异性强、重复性好、灵敏度高,为该病毒在牦牛养殖地区的流行病学调查、临床诊断和快速诊断试剂的开发奠定了基础。

猪伪狂犬病病毒直接免疫荧光检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速、敏感、准确的猪伪狂犬病病毒(PRV)直接免疫荧光检测方法(DFM),本研究通过制备并纯化PRV gE蛋白单克隆抗体(MAb),将其标记异硫氰酸荧光素(FITC)后对荧光抗体的最佳工作条件进行摸索;并对荧光抗体的特异性、敏感性、重复性和稳定性进行测定;应用DFM对从临床收集的83份疑似病料进行检测,同时用PCR检测作为对照,计算符合率。结果显示,本研究制备FITC标记抗体的F/P比值为2.578±0.012,符合标准;荧光抗体的最佳工作条件为:使用固定剂(60%丙酮+40%乙醇)于-20℃固定20 min,抗体工作浓度为15μg/mL,抗体孵育时间为1 h;荧光抗体能在10~7病毒稀释度(1×TCID50)检出阳性信号,与PCV2、PPV、PRRSV、CSFV、PRV Bartha-K61均无交叉反应;批内和批间重复性良好,-20℃保存5个月染色后荧光强度仍稳定;83份临床样品检测结果显示,DFM与PCR的符合率为74.7%,其中淋巴结和扁桃体的符合率较高,分别为85.7%和93.3%。本研究建立的PRV直接免疫荧光检测方法为临床PRV检测和复合诊断奠定基础,适用于临床推广。

间接免疫荧光法与外斐氏反应诊断恙虫病的比较

采用外斐氏反应(WF-OX_K)和间接免疫荧光法(IFA),对选取的87例恙虫病患者、53名其它立克次氏体抗体(R-Ab)携带者和60名健康人检测了恙虫病抗体,并用6项指标评价所获结果。结果IFA法明显优于WF-OX_K法,对发病1周以上的患者其敏感度为96.1％,特异度为97.3％。其它几项指标也优于WF-OX_K法。作者认为:长期以来用于恙虫病血清学诊断的WF-OX_K法不应作为诊断的唯一依据,应结合临床和流行病学综合分析。而IFA法的真实性和可靠程度已基本达到辅助临床诊断的要求,也能满足流行病学调查的需要,应予以推广。

一种不溶血红细胞免疫荧光细胞化学检测方法的建立

目的以氯通道蛋白ClC-3为靶蛋白,建立一种不溶血的红细胞免疫荧光细胞化学检测方法。方法采集大鼠红细胞,涂片,0.5%丙烯醛/PBS固定,以不同浓度的Triton X-100/PBS(含0.1 mol/L甘氨酸)溶液透膜,用含0.05 mmol/L甘氨酸、2%BSA、0.05%NaN3的PBS溶液封闭抗原,随后孵育ClC-3的一抗和荧光标记的二抗,最后在共聚焦荧光显微镜下观察结果。结果 0.1%Triton X-100/PBS结合其他优化液处理的红细胞未出现溶血现象,共聚焦显微镜下清晰地观察到目的蛋白及其亚细胞分布情况。结论通过优化固定液、透膜液、封闭液和洗涤液,解决了常规免疫细胞化学法导致红细胞易溶血的缺点,在确保红细胞不溶血的同时成功检测到红细胞氯通道ClC-3蛋白,即成功建立了一种不溶血的红细胞免疫荧光细胞化学检测方法。

应用免疫荧光技术检测乙脑疫苗免疫前后抗体水平

1988年4～6月,我们在历年乙脑发病水平较低的朝阳市建平县,选2所小学校,7～10岁的183名小学生,随机分成实验组(121人)和对照组(62人),应用免疫荧光方法进行乙脑疫苗接种前后抗体水平的观察比较。实验用乙脑疫苗,系长春生物制品研究所生产,批号8744～12,失效期1989年11月5日。接种途径、

抗结核分支杆菌相关抗原单克隆抗体的制备及荧光抗体染色方法的建立

目的:制备抗结核分支杆菌的特异单克隆抗体,经纯化标记荧光后,建立直接荧光抗体染色方法用于痰标本的检测.方法:采用常规方法制备单克隆抗体.分泌单克隆抗体阳性杂交瘤细胞株的筛选采用ELISA法,确认采用免疫印迹法.单克隆抗体的纯化采用饱和硫酸铵粗提,Sephadex G-50层析纯化.单抗纯化后采用透析法标记异硫氰酸荧光素,初步应用于临床痰涂片的检测. 结果:经筛选获得4株单克隆抗体杂交瘤细胞株.ELISA检测小鼠腹水单克隆抗体效价达到1:6 400～1:12 800.免疫印迹实验表明4株单抗均为抗结核杆菌 38 KD 蛋白单抗,其中两株产生较强的免疫反应条带.单抗纯化后标记异硫氰酸荧光素,建立直接荧光抗体染色方法,对41份结核病患者的痰标本进行检测,阳性率为 90.24%,与抗酸染色法比较,直接荧光抗体染色方法敏感性明显高于抗酸染色法(P<0.05).结论:制备抗结核杆菌 38 KD 蛋白的单克隆抗体,并建立直接荧光抗体染色方法,初步应用于临床痰涂片检测中,对于辅助诊断结核病具有一定价值.

乙型肝炎病毒标志物检测方法的选择与应用

目的探讨乙型肝炎病毒定性与定量方法在临床诊治中的应用价值和合理选择。方法收集920例健康体检者血清,分别用胶体金方法、酶联免疫吸附剂测定方法和时间分辨免疫荧光方法检测乙型肝炎病毒表面抗原,对阳性标本再用中和确认试验进行验证和PCR方法检测HBV-DNA。结果 920例标本中胶体金法检出阳性96例,酶联免疫吸附测定方法检出阳性104例,时间分辨免疫荧光法检出阳性112例,时间分辨免疫荧光方法与胶体金方法、酶联免疫吸附测定方法比较有统计学意义(P<0.001、P=0.008);中和确认试验确认112例标本均阳性;实时荧光定量PCR检测112例标本HBV-DNA阳性78例。结论乙型肝炎病毒标志物的日常检测方法应由准确性高的定量方法替代目前常用的定性方法。

重组杆状病毒滴度免疫荧光法的建立及验证

目的建立重组杆状病毒滴度间接免疫荧光法的检测方法,并对其进行验证。方法构建含有重组质粒pGEX-6p-1-GST-GP64大肠埃希菌BL21(DE3),进行IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导,表达并纯化杆状病毒截短GP64糖蛋白。配伍佐剂后采用背部多点注射的方式免疫日本大耳白兔,制备兔抗杆状病毒GP64多抗作为免疫荧光结合抗体,在96孔板里贴壁培养Sf9细胞,接种10倍系列稀释的重组杆状病毒共孵育一定时间,80%冷丙酮固定、透化,一抗稀释比例为1∶200、荧光二抗稀释比例为1∶500,荧光显微镜下显色,计数荧光灶数目计算病毒滴度。并对建立的方法进行验证。结果成功制备了GP64兔多抗;检测时Sf9细胞与重组杆状病毒共孵育时间4 d;重组杆状病毒感染细胞可与GP64抗体发生特异的荧光灶反应,未感染细胞对照组未出现特异性荧光灶;组内和组间测定结果的RSD均<5%;同一样品不同人员检测差异无统计学意义(F=1.86,F<F_(表));同一样品梯度稀释后,稀释倍数的对数与病毒滴度呈线性相关(R^(2)=0.997);病毒滴度的回收率在90%~110%之间。结论建立了间接免疫荧光法测定重组杆状病毒滴度的方法,该方法具有良好的专属性、精密度、线性和准确度。

两种方法检测抗dsDNA抗体结果比较

抗dsDNA抗体对诊断风湿免疫病（SLE）有较高的特异性，已成为SLE的重要诊断标准之一。其检测常用间接免疫荧光方法，需要荧光显微镜特殊仪器。欧蒙试剂公司推出印迹条带技术检测抗dsDNA抗体，操作简便，无需特殊仪器。我实验室分别用上述两种方法对我科就治的SLE患者及其它风湿性疾病患者共466例，进行抗dsDNA抗体的检测，并对结果进行比较。

猪传染性胃肠炎病毒间接免疫荧光检测方法的建立

为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)直观、特异和快速的检测方法,将TGEV接种PK-15细胞后,以抗TGEV N蛋白的单克隆抗体为一抗,荧光素FITC标记的山羊抗小鼠Ig G为二抗,建立了TGEV的间接免疫荧光(IFA)检测方法。结果显示,TGEV的最佳接种效价为1×102TCID50,培养时间为24 h,细胞最佳固定液为40 m L/L多聚甲醛,最佳封闭条件为10 g/L BSA 37℃封闭30 min,一抗的最佳使用浓度为1 ng/L,二抗的最佳稀释度为1∶100。对常见的猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒和猪圆环病毒2型等猪病病原检测均为阴性。结果表明,建立的检测方法对TGEV具有良好的特异性。本研究建立的方法为TGEV的实验室诊断及TGEV在感染细胞中的定位和动态分布提供了有效的检测手段。

kinectin抗体免疫荧光检测方法的建立与应用

目的 探讨kinectin蛋白在真核细胞的定位 ,并建立kinectin抗体免疫荧光检测方法(IFA)。方法 从人喉癌上皮细胞 (HepG2 )抽提RNA ,用逆转录聚合酶链反应扩增kinectin编码区序列 ,并连接到真核表达载体pEGFP C2中 ;将构建的 pEGFP kinectin载体导入HepG2细胞中 ,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白 (GFP)的荧光及其细胞定位。然后 ,用此转染细胞制成的底片 ,建立检测kinectin抗体的IFA。同时用IFA对 5 1名正常人及 4 6例白塞病 (BD)患者血清进行初步检测。结果经EcoRI单酶切和测序证实 ,成功地构建了表达kinectin的真核表达载体 ;pEGFP kinectin载体转染的细胞经 3次克隆筛选后 ,10 0 %的细胞胞浆内发出特征性荧光。用kinectin抗体阳性血清染色 ,也得到类似特征的荧光。IFA检测显示 ,BD患者kinectin抗体的阳性率为 32 7% ( 15 /4 6 ) ,正常人均为阴性。结论 构建kinectin表达的载体可在HepG2细胞中进行表达 ,并成功地用 pEGFP kinectin转染的HepG2细胞建立了检测kinectin抗体的IFA。

新布尼亚病毒IgG抗体间接免疫荧光检测方法的建立与应用

新布尼亚病毒是一种全新的病毒，基因组由L、M、S3个单负链RNA片段组成，现归属于布尼亚病毒科白蛉病毒属第三组病毒，与白蛉病毒属的乌库尼米病毒有最高的同源性（核酸的同源性38．83％，氨基酸的同源性28．57％）。新布尼亚病毒被证实是发热伴血小板减少综合征（fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS）的重要病原，该病毒感染所致疾病有较高的病死率。在我国湖北、安徽、河南、山东、

免疫荧光法检测杆状病毒滴度的建立及验证

目的 建立并优化生产用重组杆状病毒滴度间接免疫荧光检测方法,并进行初步验证.方法 将96孔板贴壁培养的SF9细胞,接种杆状病毒溶液共孵育一定时间后间接免疫荧光法显色.通过对细胞使用浓度、孵育时间及优化显色处理条件（固定液、封闭液、抗体种类及使用条件）,建立杆状病毒滴度间接免疫荧光检测方法,进行特异性、准确性、重复性和中间精密度验证,并与杆状病毒滴度酶联检测试剂盒检测结果进行比较.结果 细胞使用浓度为0.6×10^6个/ml、共孵育时间为3d;显色条件优化后确定了冰冻甲醛-丙酮溶液为最适固定溶液和5％的山羊血清封闭液,一抗和二抗稀释比例均为1：200、37℃温育1 h时显色效果最佳.用该方法检测不同样品,仅杆状病毒组出现特异性荧光斑点.本方法与试剂盒酶联法检测结果趋势相同,其线性相关系数R^2=0.996,表明两种方法具有良好的正相关性;重复性及中间精密度验证结果的变异系数CV均〈10％.结论 建立了重组杆状病毒滴度的间接免疫荧光检测方法,该方法具有良好的特异性、准确性、重复性和中间精密度,可用于生产中病毒滴度的检测.