荧光淬灭剂TrueBlack Lipofuscin对珊瑚自体荧光的消除及其在免疫荧光标记中的应用

自体荧光是生物体内部组织成分在吸收光时自然发出的荧光,会影响人工标记荧光的有效识别,严重干扰对抗体标记的目的蛋白荧光的观察及数据分析,在珊瑚冰冻切片免疫荧光标记研究中尤为突显。为更有效地去除珊瑚组织切片中的自体荧光,本研究以共生模式种花伞软珊瑚(Xenia sp.)为研究对象,首次尝试在花伞软珊瑚冰冻切片免疫荧光染色中,使用一种在小鼠和人体组织切片中常用的TrueBlack Lipofuscin自体荧光淬灭剂,并与已有研究中的酒精梯度脱水法进行比较。结果表明,使用荧光淬灭剂TrueBlack Lipofuscin后,花伞软珊瑚组织切片中的自体荧光强度是传统的酒精梯度脱水法的52.4%,且在Cy5通道下效果最佳。同时,通过珊瑚免疫荧光标记实验表明使用TrueBlack Lipofuscin的实验组特异性荧光信号强度为对照组的205.3%,背景荧光和自体荧光基本去除。

小麦叶片原生质体微管骨架的免疫荧光标记及其影响因素

以小麦叶肉细胞原生质体为材料 ,利用免疫荧光标记并辅以共聚焦激光扫描显微镜检术 (Confocalla serscanningmicroscopy ,CLSM)观察 ,对含有叶绿体较多的小麦叶肉细胞微管骨架的标记方法及其影响因素进行了探索。结果表明 ,来自未完全展开叶片的原生质体中 ,微管的数量多且骨架的排列方式较复杂 ,而从完全展开的叶片获得的原生质体中 ,微管数量很少。实验中发现 ,外加Ca2 + 离子浓度的增加 ,使微管的稳定性降低 ,并确定了导致微管解聚的Ca2 + 浓度。

CD45新型免疫荧光标记与检测方法研究

使用经生物修饰后的荧光纳米颗粒,探索了白细胞共同抗原CD45的新型荧光标记与检测方法。将联吡啶钌配合物[三(2,2-联吡啶)氯化钌,六水]为核,二氧化硅为外壳的荧光纳米颗粒用鼠抗人CD45Pur进行生物修饰后,对人体白细胞进行荧光标记,通过荧光显微镜和流式细胞仪检测标记样品的细胞数目和荧光强度,结果表明,该新型荧光标记方法的灵敏度高,光学稳定性好,可准确有效地识别人体白细胞。

水溶性CdTe量子点-广谱抗细胞角蛋白单克隆抗体荧光探针的制备及其对肝癌细胞HepG2的免疫荧光标记

目的制备水溶性CdTe量子点-广谱抗细胞角蛋白单克隆抗体(QDs-MAb)荧光探针,并对其特异免疫性识别能力和荧光稳定性进行检测。方法在EDC偶联剂的作用下,将水溶性CdTe量子点与广谱细胞角蛋白单克隆抗体(PanCK)进行了连接;对肝癌细胞HepG2采用免疫细胞化学法和QDs-MAb单抗荧光探针直接免疫荧光标记法观察比较PanCK蛋白在细胞内的分布;将量子点与传统的荧光染料FITC的荧光强度和荧光稳定性进行了比较。结果QDs-MAb单抗荧光探针对HepG2细胞内的PanCK分子具有特异性的识别能力;与FITC相比,QDs-MAb荧光探针荧光度更强,光化学稳定性更好,激发光连续照射30min及室温放置3d后均未见明显淬灭。结论本实验成功制备了QDs-MAb荧光探针,为半导体量子点用于上皮来源的肿瘤细胞内PanCK分子的相关检测提供了科学依据。

免疫荧光标记在原生动物纤毛虫观察中的应用

提出了一种显示原生动物纤毛和细胞骨架结构的免疫荧光标记方法,并总结了实验操作过程中的注意点。

双重免疫荧光标记及激光共聚焦显微镜技术对不稳定膀胱逼尿肌间隙连接蛋白43的定量和定位实验

目的:建立一种应用荧光免疫组织化学双重标记技术和激光扫描共聚焦显微镜观察不稳定膀胱逼尿肌连接蛋白43表达和分布模式的方法。方法:实验于2003-09/2004-06在汕头大学医学院病理实验室完成。选择健康清洁级wistar大鼠50只,随机分成两组,对照组10只,不稳定膀胱组40只。建立膀胱出口梗阻模型之后行充盈性膀胱测压,确定不稳定膀胱组13只。对照组只行尿道分离术而不作结扎术。麻醉未醒即处死大鼠,取下膀胱分离出逼尿肌组织。①荧光免疫组织化学双重标记:应用罗丹明麦芽凝集素标记逼尿肌肌细胞膜,异硫氰酸荧光素素标记间隙连接蛋白43。②激光共聚焦显微镜技术:使用ACAS/Ultima312型激光共聚焦显微镜的检测器1和检测器2同时分别检测连接蛋白43和细胞膜(当只开通检测通道1时,仅显示代表连接蛋白43的绿色小短杆状或小点状荧光斑;当仅开通检测通道2时,仅显示被染成红色的细胞膜,清楚地显示了细胞的外形轮廓,胞浆及胞核则不显示;当两个通道同时开通时,绿色的连接蛋白43与红色细胞膜重叠后变成黄色)。主要参数如下:小孔孔径225μm,X轴扫描点数390,Y轴扫描点数390,扫描步径0.6μm,镜扫描速度10mm/s,扫描强度85%,激光强度360mW,每点采样次数30,物镜40倍,检测器1(最适波长488nm)灵敏度62%,检测器2(最适波长514nm),灵敏度58%。③激光共聚焦显微镜图像分析法:应用ImageAnalysis程序进行图像分析。以连接蛋白43的像素值占总像素值的百分比值作为连接蛋白43的像素密度,其大小代表连接蛋白43量的大小;以连接蛋白43荧光斑面积的大小反映连接蛋白43量的大小。结果:不稳定膀胱组中出现不稳定膀胱的13只和对照组10只进入结果分析。①两组大鼠逼尿肌连接蛋白43的像素密度和荧光斑面积比较:不稳定膀胱组连接蛋白43象素密度值较对照组象素密度值明显增多(3.45±1.58,0.85±0.44,t=5.037,P<0.01);不稳定膀胱组荧光斑面积较对照组显著增大犤(19.92±8.61)μm2,(11.46±2.55)μm2,t=2.995,P<0.01犦。②激光共聚焦显微镜下双重标记的大鼠逼尿肌连接蛋白43荧光图像:对照组逼尿肌肌束细胞平行排列,分布均匀,连接蛋白43表达量极少。不稳定膀胱组细胞大小不一,形状多样,排列紊乱,连接蛋白43数量较对照组明显增多,表现在密度增大,荧光斑面积增大,连接蛋白43的表达主要出现在细胞与细胞连接处。结论:采用双重标记的荧光免疫组织化学和激光共聚焦显微镜技术,抗连接蛋白43单克隆抗体特异地与间隙连接蛋白43结合,在组织原位上准确地标记间隙连接,同时显示细胞膜,既能对其进行定量分析,又能同时对其进行定位。

流式细胞术双色免疫荧光标记观察寻常性银屑病患者外周血淋巴细胞亚群

目的了解寻常性银屑病患者外周血淋巴细胞亚群的变化。方法应用流式细胞仪双色免疫荧光标记,检测98例寻常性银屑病患者外周血淋巴细胞亚群并与102名正常人进行比较。结果银屑病患者外周血CD4+细胞百分数显著高于正常人对照组(P<0.05);NK细胞百分数显著低于正常人对照组(P<0.01),寻常性进行期银屑病患者T细胞和CD4+细胞显著高于静止期银屑病患者(P<0.05),进行期银屑病患者T细胞、B细胞、CD4+细胞百分数均显著高于正常人对照组(P<0.001),NK细胞显著低于正常人对照组(P<0.001)。静止期银屑病患者与正常人对照组相比淋巴细胞亚群各项指标无明显差异。结论寻常性银屑病患者外周血淋巴细胞亚群的变化主要表现在T、B淋巴细胞特别是CD4+细胞的升高和NK细胞的降低。

利用免疫荧光标记研究磷酸化组蛋白H3在乳腺癌细胞中的分布

在时间上与细胞周期相关并且在功能上又与染色质凝集偶联的一类组蛋白翻译后修饰就是组蛋白H3磷酸化。运用一个针对H3 Ser10磷酸化的特异性抗体 ,通过SDS PAGE、免疫印迹和免疫荧光标记检测了磷酸化H3在MCF 7细胞周期中的分布。共聚焦显微结果显示 :H3磷酸化在早前期细胞核膜附近以斑点状起始 ,之后扩展到整个凝集的染色质上 ,然后在早中期达到最高水平。H3去磷酸化开始于有丝分裂后期 ,很快在末期完成 ,而此时末期细胞凝集的染色质并未完全解凝集。H3磷酸化与染色质初期凝集之间存在着精确的时间和空间上的相关性。另外 ,对H3磷酸化可能的作用进行了讨论。

对虾白斑综合症病毒P9蛋白转录水平的微阵列分析及其免疫荧光标记

从构建的对虾白斑综合症病毒cDNA文库中,我们筛选到一个拷贝数最高,编码82个氨基酸的基因(命名为p9,wsv230).该基因被克隆到pGEX-2T载体中进行GST融合蛋白的原核表达,纯化的融合蛋白GST-P9用于制备特异的多克隆抗体.利用微阵列技术和免疫荧光标记技术,对该蛋白的转录水平及其在感染细胞内的分布进行了初步研究,表明该基因为高丰度表达,推测是对虾白斑综合症病毒的一个重要基因.

脑组织双重免疫荧光标记方法介绍

应用光学技术对荧光标记的组织切片样品进行成像观察是生物学研究的常规手段。本文主要介绍如何制备用于荧光显微镜和激光共聚焦显微镜成像的脑组织石蜡切片免疫荧光双重标记技术。

BNP和IL-6双标记时间分辨免疫荧光检测方法的建立及初步应用

目的研制一种脑钠肽(BNP)、白细胞介素-6(IL-6)的双标记时间分辨免疫荧光分析方法(TRFIA)并对其性能进行初步评价。方法将抗BNP和IL-6单克隆抗体(MAb)作为包被抗体包被在96孔板,用Eu3+和Sm3+分别标记另一配对抗体作为检测抗体,建立双抗体夹心TRFIA分析法并制备成试剂盒。进行灵敏度、准确度、重复性、特异性、稳定性和临床样本比对等实验评价其检测性能。结果制备的双标记时间分辨免疫荧光试剂盒对BNP检测的线性范围为10 pg/mL~5000 pg/mL,灵敏度为8.65 pg/mL,对IL-6检测的线性范围为1 pg/mL~1000 pg/mL,灵敏度为5.36 pg/mL。BNP的回收率在91.49%~99.16%,批内CV在5.73%~8.96%,批间CV在8.42%~11.73%;IL-6的回收率在93.95%~111.50%,批内CV在7.32%~10.07%,批间CV在9.40%~11.30%。与血清中常见的脓毒血症检测指标均无明显的交叉反应。试剂盒能够在4℃稳定保存半年,37℃稳定保存7 d。对临床样本的检测发现,该方法参考区间Cut-off值BNP:46.01 pg/mL,IL-6:13.62 pg/mL;检测结果与临床诊断结果一致,准确性较好。结论建立的BNP和IL-6双标记TRFIA方法具有高灵敏度、高特异性、高准确率、方便快捷等优点,可作为预警脓毒症发生、预测脓毒症病情程度及临床预后的一种新的实验室检测方法。

量子点-CK19抗体荧光探针对乳腺癌细胞免疫荧光标记及毒性研究

目的:制备量子点-细胞角蛋白19抗体(cytokeratin,CK19)荧光探针,利用其光学性质和特异性识别能力对乳腺癌细胞株MDA-MB-231进行荧光标记,并探讨其细胞毒性。方法:用水热法合成CdTeS量子点,并将其与CK19抗体连接。通过直接免疫荧光法,利用合成的量子点-CK19抗体探针对乳腺癌细胞株MDA-MB-231进行荧光标记,并观察探针在细胞内的分布。分别采用流式细胞术和MTT法,检测探针作用后细胞凋亡情况和增殖变化。结果:量子点-CK19抗体探针能与抗原特异性结合,荧光显微镜和激光共聚焦显微镜示,该探针能有效对乳腺癌细胞株MDA-MB-231进行特异性荧光标记,荧光主要位于细胞质和细胞膜,荧光清晰明亮,持续时间长。与对照组相比,量子点-CK19抗体探针浓度≤2nmol/L时,对照组乳腺癌细胞株MDA-MB-231的凋亡率为(3.763±0.130)%,0.25nmol/L组为(3.760±0.161)%,0.5nmol/L组为(3.827±0.107)%,1nmol/L组为(3.947±0.081)%,2nmol/L组为(4.013±0.055)%。单因素方差分析结果显示,各剂量组与对照组比较,差异无统计学意义,F=3.023,P=0.071。量子点-CK19抗体探针可抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖,F=133.407,P<0.001;且存在时间-效应(F=299.142,P<0.001)和剂量-效应(F=9.105,P<0.001)关系,随着探针浓度的增加和作用时间的延长,A值逐渐减小,但除了浓度2nmol/L作用48h外,其余各组的抑制率均<7%。结论:成功制备了量子点-CK19抗体荧光探针,该探针能有效对乳腺癌细胞株MDA-MB-231进行荧光标记,且具有良好的光学性质和较低的细胞毒性。

免疫荧光双标记技术检测胎盘HBsAg-抗-HBs复合物

目的 探讨乙肝病毒 (HBV)以何种形式感染胎盘滋养层细胞 .方法 通过免疫荧光双标记技术检测 12例血清HBs Ag阳性母亲的胎盘滋养层细胞 HBs Ag-抗 - HBs复合物 .结果 血清学 HBs Ag阳性母亲胎盘滋养层细胞中存在 HB-s Ag-抗 - HBs复合物 .结论 提示 HBV可能通过 HBs Ag与抗 - HBs结合成复合物的方式进入胞内 ,导致胎盘屏障的第一层细胞受到

微波石蜡切片免疫荧光多重标记技术在肾活检病理诊断中的应用

目的:肾活检组织免疫荧光检查常规是在冰冻切片上进行。本研究探讨了甲醛固定的肾活检组织进行石蜡切片免疫荧光多重染色在病理诊断中应用的可行性。方法:采用微波修复抗原法,对5例膜性肾病、5例狼疮性肾炎、5例IgA肾病和5例乙型肝炎病毒相关性肾炎患者肾组织石蜡切片分别进行IgG/Fn/Hoechst、C3/Fn/Hoechst、IgA/Fn/Hoechst、HBsAg/Fn/Hoechst免疫荧光多重染色。利用免疫荧光显微镜观察并照相。结果:微波修复抗原的石蜡切片进行免疫荧光多重染色,显示IgG、C3、IgA与HBsAg染为绿色,FN为红色,两者共表达的部位为橙黄色,细胞核为蓝色。石蜡切片的免疫荧光染色与用于病理诊断的冰冻切片免疫荧光染色结果一致。且石蜡切片较冰冻切片薄,结构清楚,免疫沉积物定位更准确,易判断结果。结论:微波石蜡切片免疫荧光多重染色,能在一张切片上同时显示两种以上抗原的共表达,为病理诊断提供更加直观详实的依据,可用于肾组织分子免疫病理检查,为使用石蜡切片进行回顾性免疫荧光诊断和研究提供了技术保障。

同种属来源一抗在免疫荧光双标记染色中的可行性

目的探讨同种属来源一抗在免疫荧光双标记染色中的可行性。方法本研究采用顺序法对小鼠结肠组织IL-17和肠神经胶质细胞源性神经营养因子GDNF的特异性受体亚基GFR-α1进行同种属来源一抗的免疫荧光双标记染色。结果炎症状态下小鼠结肠组织黏膜及黏膜下层可见被绿色荧光和红色荧光双重标记的阳性细胞,提示IL-17+的Th17细胞表面有GDNF特异性受体亚基GFR-α1表达。结论采用顺序法进行免疫荧光双标记染色,尤其是当已知两种目标抗原表达位置不同时,同一种属来源的一抗仍可得出可信的实验结果。

免疫荧光双标记法在子宫平滑肌肿瘤中的应用

随着激光共聚焦显微镜及其技术的推广，石蜡组织免疫荧光标记的方法也日益广泛运用，尤其是荧光双标或多标的方法，因其具有敏感性高、信号分明的特点，成为广大科研工作者喜欢使用的技术方法。荧光双标实验过程较为复杂，它的成功与否会受到很多因素的影响，如果某些环节处理不恰当，会直接导致实验失败。本研究以子宫平滑肌肿瘤为研究对象，分为子宫平滑肌肉瘤组（LMS）、普通型子宫平滑肌瘤组（OUL）、正常子宫平滑肌组（NUSM）3组，选择Survivin和Ki-67两种与细胞增殖和凋亡相关的蛋白，采用免疫荧光双标记法检测各组中2种蛋白的表达情况，取得了较为满意的效果，现以异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）与四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethyl rhodamine isothio-cyanate，TRITC）的荧光双标为例，介绍免疫双荧光切片制备及运用激光共聚焦显微镜采集信号数据的方法。

激光共聚焦显微镜观察免疫荧光双重标记的前列腺癌内基质金属蛋白酶及其作用底物的表达

目的:探讨应用激光共聚焦显微镜观察免疫荧光双重标记的前列腺癌标本的可行性及优点。方法:应用激光扫描共聚焦显微镜同时检测前列腺癌中基质金属蛋白酶(MMPs)和其作用底物的表达情况。结果:在激光扫描共聚焦显微镜下,可以清晰地观察MMP-7和层粘连蛋白(LN)可共同表达于前列腺癌细胞及基质中的基底膜、血管平滑肌和神经纤维;MMP-9和Ⅳ型胶原的主要表达于细胞外基质中的基底膜。结论:结合应用激光扫描共聚焦显微镜和免疫荧光双重标记技术能对蛋白进行精确的定位研究。

检测β-CTX和N-MID水平的双标记时间分辨免疫荧光分析方法的建立和评价

目的:研制一种检测β胶联降解产物(β-CTX)和骨钙素N端中分子片段(N-MID)水平的双标记时间分辨免疫荧光分析方法(TRFIA)并评价其检测性能。方法:将抗β-CTX和N-MID的4E5和2B7单克隆抗体(MAb)作为包被抗体包被在96孔培养板,采用铕离子(Eu^(3+))和钐离子(Sm^(3+))分别标记2G6和5A3 MAb作为检测抗体,建立双抗体夹心TRFIA分析法并制备成试剂盒。通过试剂盒的灵敏度、准确度(稀释回收率)、特异性、精密度、稳定性和临床样本比对等实验评价其检测性能。结果:制备的双标记TRFIA试剂盒对β-CTX的检测灵敏度为0.025μg·L^(-1),线性范围为0.025~5.000μg·L^(-1),对N-MID的检测灵敏度为0.5μg·L^(-1),线性范围为0.5~200.0μg·L^(-1)。β-CTX平均稀释回收率为102.13%,N-MID平均稀释回收率为103.02%,与其他常见骨检测指标无明显交叉反应,特异性较强。β-CTX批内变异系数(CV)为5.81%~7.82%,批间CV为5.97%~8.02%;N-MID批内CV为6.05%~8.32%,批间CV为6.14%~8.56%;TRFIA试剂盒可在4℃稳定保存6个月,37℃稳定保存7 d。结论:建立的双标记TRFIA方法具有高灵敏度、高特异度、高准确率和方便快捷等优点,适用于大批量临床样品的检测。

用于糖链抗原CA19-9实时动态活检的免疫双光子荧光标记试剂盒

采用双光子荧光标记探针LP制备了免疫双光子荧光抗体LP-Ab,以特异性识别肿瘤标志物CA19-9(Ag)形成抗原-抗体复合物(LP-Ab·Ag),基于双光子诱导荧光机制用近红外激光(740 nm)激发LP-Ab·Ag,利用LP-Ab·Ag的双光子荧光实现了CA19-9的高清晰度、高灵敏度及高分辨率的量化检测和实时动态成像,并制成用于糖链抗原CA19-9检测的简单便捷的双光子荧光标记试剂盒.