基于荧光检测的高通量筛选技术和装备助力细胞工厂构建

微生物工业制造是以微生物细胞工厂为核心,利用低成本、可再生资源为原料,实现高附加值化合物的绿色生产。依赖于“设计-构建-测试-学习”(DBTL)循环的微生物细胞工厂开发过程中“测试”阶段已成为制约合成生物学和代谢工程发展的瓶颈之一。基于微量滴定板(MTP)高通量自动化筛选平台极大降低了高通量筛选过程的劳动强度,流式细胞术和液滴微流控技术的发展大幅度提高了筛选通量。尤其是荧光激活液滴分选(FADS)高通量筛选技术的开发为自动化、高通量和低消耗筛选工作提供了新的解决方案。本文综述了不同高通量筛选技术在合成生物学和代谢工程领域应用的主要进展,重点介绍了近几年荧光激活细胞分选技术(FACS)和FADS在微生物细胞工厂和酶定向进化方面的应用实例,关注了待测分子与荧光信号偶联的常用策略,并简单介绍目前国内外基于液滴微流控技术高通量筛选装备的研发情况。

小鼠精原干细胞分选

目的：寻求富集小鼠精原干细胞的有效方法。方法：取6周龄雄性昆明白小鼠20只，手术制作成双侧隐睾模型，继续饲养2～3个月后，切取睾丸，用酶两步消化法制成单细胞悬液，加入FITC标记的抗α6-integrin抗体和PE标记的抗c—kit抗体冰浴20min后，利用流式细胞仅筛选出具有sidescatter^1o、α6-integrin^＋、c-kit^-特征的细胞，苔盼兰染色监测细胞活性。另取20只小鼠作为对照组，相同条件下饲养相同时间。结果：隐睾小鼠筛选出的精原干细胞占睾丸细胞总数的2．8％，95％以上的细胞具有活性。结论：利用免疫荧光激活细胞分选术能分离出大量有活性的精原干细胞。

流式细胞术的最新进展

流式细胞术是一项集多种技术于一体的新型高科技细胞分析技术 ,是一种自动而迅速地进行细胞及免疫分析的标准方法。近年来在其基础上建立起来很多新型的流式细胞仪系统 ,具有体积小、功能全、价格低、使用方便、应用广泛等特点。

人肺上皮细胞表达蛋白酶激活受体

目的: 蛋白酶激活受体(protease-activated receptors, PARs) 广泛分布在多种组织细胞上,但4种PARs在肺上皮细胞的表达情况尚不清楚. 我们用A549细胞研究PARs在肺上皮细胞的表达. 方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、流式细胞仪和免疫荧光细胞染色分析技术分析肺上皮细胞系A549细胞PARs的表达情况. 结果:4种PARs在肺上皮细胞上均有不同程度的表达. 结论:肺上皮细胞同时表达PAR 1～4 4种受体,这为进一步研究PARs在肺上皮细胞的功能奠定了基础.

蛋白酶激活受体在鼠肥大细胞的表达

目的检测蛋白酶激活受体(PARs)在鼠肥大细胞的表达。方法用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)、流式细胞术及免疫荧光细胞染色分析方法,在mRNA水平和蛋白质水平检测PAR-1、PAR-2、PAR-3和PAR-4在鼠肥大细胞P815和MC/9的表达。结果肥大细胞P815和MC/9在mRNA水平和蛋白质水平均表达PAR-1、PAR-2、PAR-3和PAR-4。结论肥大细胞表达PAR-1、PAR-2、PAR-3和PAR-4,为进一步研究肥大细胞PARs的功能奠定了基础。

头颈部肿瘤干细胞的表面标志物及其分选

越来越多的研究显示,头颈部肿瘤干细胞很可能是头颈部肿瘤形成、复发、转移和耐药的根源。本文就头颈部肿瘤干细胞表面特异分子标志物,头颈部肿瘤干细胞的分选等研究进展作一综述。

细胞量少的卵巢癌腹腔液漏诊和过度诊断的实验分析

目的探讨细胞量少的卵巢癌腹腔液的漏诊及过度诊断情况及原因。方法建立卵巢癌腹水模型,分阴性组和4个阳性组,即4 ml良性腹腔冲洗液中有0、5、10、20、40个卵巢癌SKOV3细胞,每组重复3次,以观察HE和免疫细胞化学染色切片、磁激活细胞分选(magnetic activated cell sorting,MACS)联合流式细胞鉴定的方法检测该模型。结果判断阴性组的样本中无癌细胞,部分阳性组样本中有癌细胞;Ep CAM、Calretinin均阳性,Pax-8、CK5/6部分阳性;5组中均有EBA-1免疫荧光阳性的上皮细胞,阳性率分别为13.6%、6.7%、9.0%、6.2%、6.3%。结论卵巢癌腹腔液中的细胞量少时,形态学观察癌细胞易造成漏诊,免疫细胞化学染色易出现假阳性,MACS不能有效分离其中的癌细胞,应采用新方法以识别分离腹腔液中的少量癌细胞。

磁激活细胞分选技术用于结直肠癌外周血癌细胞富集的研究

目的用磁激活细胞分选技术富集并定量分析结直肠癌患者外周血循环中的癌细胞。方法术前抽取 2 1例结直肠癌患者和 9例对照者的外周血样 ,标记带磁珠的细胞角蛋白 (Cytokeratin ,CK)抗体 ,经磁柱富集CK+ 上皮细胞 ,用流式细胞仪检测其含量。结果在未经富集的标本中均未发现CK+ CD45 -细胞 ;在经富集的标本中其含量在对照组与患者组间 (P <0 0 1)以及DukesA B期与DukesC D期患者间 (P <0 0 1)均差异有显著意义。结论本方法能有效地富集上皮来源细胞 ;CK+ CD45 -细胞能反映外周组织中肿瘤细胞情况 ;其与恶性肿瘤的存在。

MACS法对骨髓中胃癌细胞的富集效率研究

目的探讨和比较微型免疫磁珠在胃癌微转移细胞检测方面的特异性、富集效率及回收率。方法选取2002年12月-2003年6月间行手术治疗的胃良性病变患者15例,将其骨髓有核细胞与胃癌细胞株OCUM-2MD3细胞以10种不同比例混合,使其中肿瘤细胞的频数自(0-5)×10-5作为骨髓微转移肿瘤细胞模型。以结合有CK7/8抗体的MACS微型免疫磁珠、标记异硫氰酸荧光素的抗CK抗体(CK-FITC)以及标记叶绿素蛋白的抗CD45抗体(CD45-PerCP)标记后,以MS+/RS+ 型阳性分选柱进行2次肿瘤细胞富集。在富集前后分别进行FACS分析和免疫荧光检测。结果FACS分析9组混合细胞标本中,肿瘤细胞的富集倍数为8664±1222,回收率为(61.4±8.7)%;直接免疫荧光法测得4组混合细胞的总回收率为(49.3±8.2)%,明显低于FACS测得的回收率(P=0.037)。结论MACS法可有效地富集骨髓细胞中存在的胃癌细胞; MACS免疫磁珠富集结合FACS分析敏感性高,可重复性好,是检测骨髓中胃癌微转移细胞的有效方法。

磁激活细胞分选术联合混合抗体提高模拟恶性腹水中游离癌细胞检出效率的分析

背景磁激活细胞分选术（magnetic activated cell sorting，MACS）是一种新的免疫磁性分离技术。其原理是基于抗体对抗原的特异性识别，将50nm磁性微珠直接或者间接耦联在抗体上，与有相应抗原表达的细胞相连，在高强度、高梯度磁场中达到细胞磁性分离的目的。该法具有分离纯度和回收率均较高的优势，也能分离出体液中存在的少量肿瘤细胞。目的评价MACS联合一组肿瘤细胞标志物的方法对提高模拟恶性腹水中游离癌细胞检出效率的作用。方法选择5种与恶性腹水病因有关的肿瘤细胞株作为研究对象，采用免疫荧光反应和流式细胞仪（FCM）检测上皮相关抗原（epithlial-related antigen，EpCAM）、CA125、癌胚抗原和TAG-72共4种单克隆抗体及其混合抗体在各肿瘤细胞的表达。将肿瘤细胞以不同比例掺入单个核细胞中模拟恶性腹水细胞成分，与联合单个抗体进行分选对比，观察MACS术联合混合抗体分选肿瘤细胞的效率。结果FCM结果表明，混合抗体在5种肿瘤细胞的阳性表达率均高于4种抗体单独反应的阳性率。MACS术联合混合抗体检出模拟恶性腹水中肿瘤细胞的得率比联合单个抗体的得率要高，其中以2种胃癌细胞和结肠癌细胞的平均得率提高较多（分别为69．18％±20．84％比45．23％±11．54％、78．75％±15．42％比59．73％±16．640和85．63％±12．30％比76．88％±8．650），卵巢癌细胞次之（32．490±3．58％比31．79％±4．820），肝癌细胞最少（11．78％±0．430比7．16％±0．460）。结论与联合单个抗体进行分选相比，应用MACS术联合一组混合抗体的方法可有效提高恶性腹水中游离癌细胞的检出效率，尤其对胃肠道肿瘤所致的恶性腹水有潜在的临床应用价值。

FACS技术在酶定向进化中的应用

流式细胞术(flow cytometry,FCM)是一种在单细胞水平上对大量细胞进行快速、相对定量的多参数分析技术。基于FCM建立的荧光激活细胞分选术(fluorescence-activated cell sorting,FACS)可物理分离荧光标记的单细胞,目前已被广泛应用于酶定向进化领域。定向进化已被证明是获得高酶活、强热稳定性、耐溶剂性等优良性质工业酶的有效方法,其首先需通过随机突变和DNA重组等方法构建酶突变文库,随后需在人工选择压力下对突变文库进行筛选。传统筛选方法如平板法、微孔板法等,存在通量低、成本高、误差大、准确性差等局限,无法实现对大型文库的高通量筛选。相较于传统筛选方法,FACS具有高通量、耗费低、误差小、精度高等优势。本文首先总结了FCM及FACS的发展进程,以及由此衍生的相关仪器的组成和分类,随后讨论了FACS在酶定向进化中的应用现状及现阶段的应用局限性,最后总结并展望了FACS发展方向及其在酶定向进化领域的应用前景。

肿瘤坏死因子调节的肥大细胞蛋白酶激活受体表达分析

目的检测肿瘤坏死因子（TNF）引起的肥大细胞蛋白酶激活受体（PAR）．1，2，3，4表达。方法肥大细胞P815培养后以不同浓度的TNF激发肥大细胞，在不同时间点收集细胞，给予聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX一100）非TritonX-100处理后用流式细胞术和激光共聚焦方法检测肥大细胞蛋白酶激活受体的表达。结果TNF激发肥大细胞2h、6h和16h后，TritonX．100与非TritonX．100处理后，肥大细胞PAR-1，3表达均无明显变化；但TNF以浓度依赖方式上调P515肥大细胞PAR．2，4表达（P〈0．05）；上述各时间点检测PAR-1，2，3表达情况，TritonX．100处理组与非TritonX．100处理组检测结果无明显差异，但PAR-4表达结果显示TritonX-100处理组表达强于非TritonX．100处理组。结论TNF可以上调P815肥大细胞PAR-2，4表达，但对PAR-1，3表达的调节作用不明显，TritonX-100处理和非TritonX-100处理不影响TNF调节的肥大细胞PARs表达的检测结果。