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蛋白免疫印迹杂交法研究葛根素对成骨细胞TGF-β1及Smad2/3蛋白表达的影响 被引量:12
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作者 钱康琦 孙玉明 詹秀琴 《长春中医药大学学报》 2013年第1期18-20,共3页
目的:观察采用蛋白免疫印迹杂交(Western Bloting)法探讨葛根素通过TGF-β1及其信号转导蛋白Smad 2/3对于促进成骨细胞增殖分化机制的研究。方法:原代培养新生小鼠成骨细胞,分别用空白对照组(含10%DMEM)及3种不同浓度分别为1μg/mL,0.1... 目的:观察采用蛋白免疫印迹杂交(Western Bloting)法探讨葛根素通过TGF-β1及其信号转导蛋白Smad 2/3对于促进成骨细胞增殖分化机制的研究。方法:原代培养新生小鼠成骨细胞,分别用空白对照组(含10%DMEM)及3种不同浓度分别为1μg/mL,0.1μg/mL,0.01μg/mL的葛根素干预液处理成骨细胞。采用MTT实验法检测葛根素对成骨细胞生长的影响,Western Bloting法检测葛根素对成骨细胞TGF-β1及其信号转导蛋白Smad 2/3表达的影响。结果:不同浓度的葛根素有促进成骨细胞生长的作用,并可以提高TGF-β1及其信号转导蛋白Smad 2/3的表达,呈浓度依赖性,分别与空白对照组相比有统计学意义(P<0.05)。结论:葛根素可以通过TGF-β1及Smad 2/3信号转导途径促进成骨细胞增殖与分化。 展开更多
关键词 蛋白免疫印迹杂交(Western Bloting) 葛根素 TGF-β1 Smad2/3 成骨细胞
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水通道蛋白基因在胎肺发育过程中的表达 被引量:1
2
作者 刘慧姝 曾瑞萍 E.M.Wintour 《中山大学学报(医学科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2003年第B03期23-26,共4页
【目的】测定水通道蛋白基因(Aquaporins,AQPs)是否在中晚期妊娠羊胎肺中表达及其表达模式。【方法】应用荧光定量 PCR 技术对妊娠80d,100d,120d,140d 的羊胎外周肺组织各4例及4例成年羊外周肺组织行 AQP1,3,4和5基因的 mRNA 表达的定... 【目的】测定水通道蛋白基因(Aquaporins,AQPs)是否在中晚期妊娠羊胎肺中表达及其表达模式。【方法】应用荧光定量 PCR 技术对妊娠80d,100d,120d,140d 的羊胎外周肺组织各4例及4例成年羊外周肺组织行 AQP1,3,4和5基因的 mRNA 表达的定量检测;应用 Western 免疫蛋白杂交对妊娠100d,130d的羊胎的外周肺组织行 AQP1,3,4和5基因的蛋白表达的检测。【结果】AQP1,3,4,5基因 mRNA 及蛋白质均在妊娠中晚期羊胎肺中表达;AQP5mRNA 在胎肺的表达显著高于成羊肺。【结论】AQPs 基因在胎肺中表达及 AQP5在胎肺中高于成年肺的特定表达模式提示 AQPs 在胎肺液体产生及吸收中发挥一定作用。 展开更多
关键词 胎肺发育 水通道蛋白基因的表达 荧光定量PCR技术 免疫蛋白杂交
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链状亚历山大藻组蛋白H3基因克隆与生长过程中的表达分析
3
作者 刘昊昕 Sadaf Riaz +3 位作者 刘源 Anam Khurshid 张巍 隋正红 《海洋科学》 CAS 北大核心 2019年第11期19-27,共9页
链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)是一种典型的产毒赤潮甲藻。甲藻曾被认为没有组蛋白,但近年来在多种甲藻中检测到全部四个核心组蛋白的活跃转录,而目前对甲藻中组蛋白表达模式与具体功能还缺乏深入的研究。本文报道了链状亚历... 链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)是一种典型的产毒赤潮甲藻。甲藻曾被认为没有组蛋白,但近年来在多种甲藻中检测到全部四个核心组蛋白的活跃转录,而目前对甲藻中组蛋白表达模式与具体功能还缺乏深入的研究。本文报道了链状亚历山大藻组蛋白H3变体之一H3.c的全长ORF序列的克隆和分析;分析了链状亚历山大藻生长过程中组蛋白H3在基因和蛋白水平的表达。目前研究发现的链状亚历山大藻H3变体共三个,其中H3.b在N末端序列与其他物种差异最大,为链状亚历山大藻特有的H3变体。对数生长期的组蛋白H3在基因与蛋白水平上均活跃表达,但表达量并不会随着爆发性增长而显著变化,其中H3.b的基因表达在对数末期呈现上调;培养至衰亡期,各H3变体表达均下调,尤其在蛋白水平上呈现明显衰减。结合前期研究,本文认为链状亚历山大藻三个H3均为复制非依赖型(RI)变体,一些变体可响应伴随藻不断生长而逐渐增强的细胞密度等复杂胁迫,推测其参与某些表观遗传修饰,调控生长进程;而衰亡期基于H3的表观遗传调控受到抑制。 展开更多
关键词 链状亚历山大藻 蛋白H3 表观遗传调控 实时荧光定量PCR 蛋白免疫印记杂交
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HRP标记的二抗检测heme结合蛋白造成假阳性问题的探讨
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作者 张亚男 张春晓 陈晓波 《河北科技大学学报》 CAS 2019年第3期273-278,共6页
为了验证对辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)作为二抗标记物在检测heme结合蛋白时产生假阳性问题的推测,以菠菜细胞色素b6f复合体(Cyt b6f)和铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶(FNR)为检测对象(前者含有heme结合蛋白Cyt f,后者不含... 为了验证对辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)作为二抗标记物在检测heme结合蛋白时产生假阳性问题的推测,以菠菜细胞色素b6f复合体(Cyt b6f)和铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶(FNR)为检测对象(前者含有heme结合蛋白Cyt f,后者不含heme基团),采用菠菜FNR一抗、HRP和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)标记的二抗,设计对比实验。结果表明,在使用HRP标记的二抗体系中,Cyt f不经一抗和二抗孵育即可显色,这是明显的假阳性;而在ALP标记的二抗体系中,Cyt f条带不显色,只有FNR条带显色。在western blot实验中,如果被检测蛋白为heme结合蛋白或者混有少量heme结合蛋白,应避免采用HRP标记的二抗,建议使用ALP标记的二抗或者其他二抗产品;heme结合蛋白具有类似HRP的氧化还原酶活性,其本身可以和显色液反应,从而产生假阳性,干扰对实验结果的判断。 展开更多
关键词 植物生物化学 蛋白免疫印迹杂交 辣根过氧化物酶 heme结合蛋白 假阳性
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罗汉果提取物诱导肺癌细胞A549凋亡的研究 被引量:17
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作者 刘灿 蔡天宇 +3 位作者 赵晓萌 马兰青 窦德泉 孙媛霞 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第9期1310-1314,共5页
目的探讨罗汉果醇诱导肺癌细胞凋亡的作用及可能的分子机制。方法通过分离、纯化得到罗汉果醇单体,以肺癌细胞A549为对象,采用MTT法检测罗汉果醇对肺癌细胞的抑制作用;利用荧光染色、流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期;以蛋白印迹法检... 目的探讨罗汉果醇诱导肺癌细胞凋亡的作用及可能的分子机制。方法通过分离、纯化得到罗汉果醇单体,以肺癌细胞A549为对象,采用MTT法检测罗汉果醇对肺癌细胞的抑制作用;利用荧光染色、流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期;以蛋白印迹法检测罗汉果醇对p21、Bcl-2蛋白表达的影响。结果罗汉果醇能抑制肺癌细胞的增殖,具有促进细胞凋亡、阻滞细胞周期的作用;蛋白印迹检测表明,罗汉果醇可以促进p21表达升高,Bcl-2表达下降。结论罗汉果醇通过调节p21、Bcl-2的表达来诱导细胞凋亡和周期阻滞,从而促进肺癌细胞A549的凋亡。 展开更多
关键词 罗汉果 肺癌细胞A549 药食两用 细胞凋亡 P21 蛋白免疫杂交
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山羊IGFBP-2基因的克隆、序列分析及其组织表达 被引量:3
6
作者 占思远 董尧 +3 位作者 李利 仲涛 王林杰 张红平 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第10期1998-2007,共10页
【目的】克隆获得南江黄羊IGFBP-2(Insulin-like growth factor binding protein-2)基因的CDS区全序列,对其进行生物信息学分析,并分析IGFBP-2的mRNA和蛋白组织表达特征,为深入研究该基因在出生后山羊生长和发育过程中的作用以及表达调... 【目的】克隆获得南江黄羊IGFBP-2(Insulin-like growth factor binding protein-2)基因的CDS区全序列,对其进行生物信息学分析,并分析IGFBP-2的mRNA和蛋白组织表达特征,为深入研究该基因在出生后山羊生长和发育过程中的作用以及表达调控提供基础资料。【方法】下载NCBI的Gen Bank数据库中公布的绵羊(Ovis aries,NM_001009436)和牛(Bos taurus,NM_174555)的IGFBP-2基因的mRNA序列,经序列比对后采用保守区域序列并利用Primer Premier 6.0软件设计克隆引物,经PCR扩增后采用TA克隆技术获取含有阳性克隆子的菌液,送公司测序得到山羊IGFBP-2基因的完整编码区序列,并利用Edit Seq、DNAMAN 6.0、MEGA 6.0和Ex PASy在线平台等软件对CDS区序列和其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析;获得山羊IGFBP-2基因CDS区序列后,利用该序列设计实时荧光定量PCR(Q-PCR)引物,采用Q-PCR和蛋白质免疫印迹杂交(Western blotting)方法检测了IGFBP-2的mRNA和蛋白在出生后南江黄羊不同组织(心脏、肝脏、肺、背最长肌、半膜肌和臂三头肌)和不同发育阶段(3、30、60、90和120 d)的表达情况。【结果】1克隆得到954bp的南江黄羊IGFBP-2基因的CDS区全序列,碱基组成为GC含量69.39%,AT含量30.61%,共编码317个氨基酸残基,预测的山羊IGFBP-2蛋白分子量大小为33.8808 kD,等电点为7.82,二级结构由无规卷曲(68.14%)、α-螺旋(18.30%)和延伸链(13.56%)三种形式组成;蛋白结构域分析发现,IGFBP-2蛋白序列包含保守的IB(IGFBP homologues)和TY(Thyroglobulin typeΙrepeats)结构域,IB结构域位于第37—125位氨基酸处,TY结构域位于第250—302位氨基酸处;2磷酸化位点预测发现,IGFBP-2蛋白中存在Ser(5)和Thr(7)共12个磷酸化位点;糖基化位点预测发现,IGFBP-2蛋白序列中存在10个N-糖基化位点和2个O-糖基化位点;3CDS区序列相似性比较发现,山羊IGFBP-2与绵羊、牛、猪、人和小鼠的相似性分别达到98.99%、97.73%、87.12%、78.33%和76.26%;氨基酸序列相似性比较发现,山羊IGFBP-2与绵羊、牛、猪、人和小鼠的相似性分别达到99.24%、98.10%、87.07%、70.27%和73.00%;4系统进化树分析发现,山羊IGFBP-2与绵羊和牛的亲缘关系最近;5组织表达分析表明,IGFBP-2在肝脏中的mRNA和蛋白的相对表达量均最高(P<0.01),背最长肌次之;在不同发育阶段的肝脏组织中,IGFBP-2 mRNA和蛋白相对表达量均呈现一直上升的趋势;在不同发育阶段的背最长肌组织中,IGFBP-2的mRNA表达水平呈现一种"上升-下降-上升"的波动平衡。【结论】获得了山羊IGFBP-2基因完整的编码区序列和组织表达特征,生物信息学分析发现IGFBP-2基因的编码区序列具有物种间的保守性,肝脏是山羊IGFBP-2的mRNA和蛋白表达的主要组织,同时在山羊不同发育阶段的肝脏和背最长肌组织中,IGFBP-2基因的mRNA和蛋白表达丰度呈现一定的规律性,表明IGFBP-2基因可能在出生后山羊的早期生长发育过程中发挥着重要的作用。 展开更多
关键词 山羊 IGFBP-2 基因克隆 荧光定量PCR 蛋白免疫印迹杂交
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一种对转基因植物基因表达进行检测的新方法 被引量:2
7
作者 王逸群 郑金贵 +2 位作者 王玉兰 吴若菁 孙珊珊 《吉林农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第1期15-17,共3页
介绍了对一种检测转基因植物基因表达的新方法———蛋白免疫原位杂交法。该法与常规的West ernblot相比 ,具有操作简便、有效可行、所需仪器少等特点 ,适用于在翻译水平上对转基因植物进行分子检测。
关键词 检测 转基因植物 基因表达 蛋白免疫原位杂交 基因检测
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重要转录因子FoxO3a在斑马鱼性腺中的表达分析 被引量:1
8
作者 熊振 罗仲文 +5 位作者 蒋明贵 周勇华 文胜 刘文彬 肖亚梅 李万程 《生命科学研究》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期6-8,41,共4页
FoxO蛋白作为Forkhead Box家族的重要一员,在动物的生长发育、细胞分化、代谢、免疫和凋亡等方面起重要作用,研究发现FoxO蛋白是哺乳动物卵泡发育的重要调节因子.通过检测雌雄斑马鱼性腺中foxo3a基因的表达情况,初步研究FoxO在鱼类生殖... FoxO蛋白作为Forkhead Box家族的重要一员,在动物的生长发育、细胞分化、代谢、免疫和凋亡等方面起重要作用,研究发现FoxO蛋白是哺乳动物卵泡发育的重要调节因子.通过检测雌雄斑马鱼性腺中foxo3a基因的表达情况,初步研究FoxO在鱼类生殖发育中的作用.PCR和蛋白免疫杂交结果都显示foxo3a基因在斑马鱼雌性性腺中的表达量要明显高于雄性.这一结果提示,foxo3a基因在斑马鱼的卵巢发育中可能发挥重要作用. 展开更多
关键词 斑马鱼 性腺 FOXO3A 蛋白免疫印迹杂交
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结缔组织生长因子表达水平与垂体腺瘤侵袭性之间关系 被引量:1
9
作者 康现鑫 赵天书 +3 位作者 董白晶 汤加斌 林祖岩 刘晓谦 《临床神经外科杂志》 CAS 2013年第3期152-155,共4页
目的探讨结缔组织生长因子(CTGF)在垂体腺瘤中表达水平与垂体腺瘤侵袭性之间的关系,为侵袭性垂体腺瘤的诊断和生物学治疗提供理论依据。方法采用实时定量聚合酶链反应(Real-timePCR)和蛋白免疫印记杂交(Westernblot)方法检测16例非侵袭... 目的探讨结缔组织生长因子(CTGF)在垂体腺瘤中表达水平与垂体腺瘤侵袭性之间的关系,为侵袭性垂体腺瘤的诊断和生物学治疗提供理论依据。方法采用实时定量聚合酶链反应(Real-timePCR)和蛋白免疫印记杂交(Westernblot)方法检测16例非侵袭垂体腺瘤及52例侵袭性垂体腺瘤组织中CTGF的表达水平。结果 52例侵袭性垂体腺瘤和16例非侵袭性垂体腺瘤均可见CTGF的表达。在mRNA和蛋白水平上,侵袭性垂体腺瘤较非侵袭性垂体腺瘤CTGF表达高,且CTGF的表达差异有统计学意义(P<0.01)。结论 CTGF在侵袭性垂体腺瘤中表达明显高于非侵袭性垂体腺瘤,且与肿瘤的大小相关。 展开更多
关键词 侵袭性垂体腺 结缔组织生长因子 实时定量聚合酶链反应 蛋白免疫印记杂交
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ERK1/2在三倍体湘云鲫组织及胚胎中的表达分析
10
作者 罗仲文 蒋明贵 +4 位作者 周勇华 文胜 汪妹 刘少军 肖亚梅 《生命科学研究》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期11-13,42,共4页
在细胞信号网络中丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号传递途径起着极为重要的作用,控制着细胞多种生理过程,如细胞生长、发育、分裂、死亡等.ERK是MAPK家族重要的成员,通过检测三倍体湘云鲫胚胎和成体组织... 在细胞信号网络中丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号传递途径起着极为重要的作用,控制着细胞多种生理过程,如细胞生长、发育、分裂、死亡等.ERK是MAPK家族重要的成员,通过检测三倍体湘云鲫胚胎和成体组织中ERK1/2的表达情况,初步研究ERK在鱼类发育中的作用.蛋白免疫杂交结果显示ERK1/2在三倍体湘云鲫的胚胎发育各个时期和组织中均有较高的表达,该结果表明ERK在鱼类发育的过程中发挥重要的作用. 展开更多
关键词 湘云鲫 细胞外调节激酶1 2(ERK1 2) 蛋白免疫印迹杂交
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东亚三角涡虫Dj14-3-3ε原核表达及鉴定
11
作者 杨武 赵博生 《山东理工大学学报(自然科学版)》 CAS 2010年第6期104-106,共3页
从东亚三角涡虫cDNA文库中挑选出克隆M455,经BLASTP确定隶属于14-3-3ε基因家族,具有14-3-3蛋白的保守结构域命名为Dj14-3-3ε基因.该基因含有完整的最大开放阅读框(ORF),编码蛋白约10.7 kDa.构建pET28b-Dj14-3-3ε原核表达载体,通过IPT... 从东亚三角涡虫cDNA文库中挑选出克隆M455,经BLASTP确定隶属于14-3-3ε基因家族,具有14-3-3蛋白的保守结构域命名为Dj14-3-3ε基因.该基因含有完整的最大开放阅读框(ORF),编码蛋白约10.7 kDa.构建pET28b-Dj14-3-3ε原核表达载体,通过IPTG诱导在大肠杆菌中表达,western blot鉴定,表明原核表达载体构建成功,并在大肠杆菌中正常表达. 展开更多
关键词 原核表达 14—3—3蛋白 蛋白免疫印迹杂交 涡虫
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褪黑素受体基因MTR1在绵羊生殖轴系的表达定位 被引量:4
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作者 康文利 魏亮亮 +3 位作者 赵淑琴 李佩华 戴丽君 刘存慧 《中国草食动物科学》 CAS 2020年第3期1-7,共7页
褪黑素(Melatonion,MT)通过分布于生殖系统不同部位的褪黑素受体(Melatonin receptor,MTR)来调节动物的生殖活动。研究褪黑素受体1型(MTR1)在繁殖期与非繁殖期动物生殖系统不同组织的分布和表达对于了解动物的生殖活动规律以及褪黑素对... 褪黑素(Melatonion,MT)通过分布于生殖系统不同部位的褪黑素受体(Melatonin receptor,MTR)来调节动物的生殖活动。研究褪黑素受体1型(MTR1)在繁殖期与非繁殖期动物生殖系统不同组织的分布和表达对于了解动物的生殖活动规律以及褪黑素对动物生殖活动的调节机制具有重要意义。应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western Blotting,WB)和免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)等方法研究了MT1在绵羊繁殖期与非繁殖期生殖轴系不同部位分布和表达情况。H&E染色结果表明,各组织都呈现了正常的细胞形态;IHC结果表明,MTR1在绵羊繁殖期与非繁殖期卵巢和睾丸组织中均有表达,其中繁殖期绵羊卵巢组织中颗粒细胞表达信号较强;qRT-PCR和WB法结果均表明,绵羊在繁殖期附睾组织中MTR1的相对表达量极显著高于其他组织(P<0.01),在非繁殖期下丘脑组织中MT1的相对表达量极显著高于其他组织(P<0.01)。综上,MT在绵羊繁殖期与非繁殖期生殖轴系不同部位均有表达并存在显著差异,为进一步探讨MTR在绵羊生殖轴系中的作用机制提供了科学的数据参考。 展开更多
关键词 褪黑素 生殖轴系 免疫组化 实时荧光定量PCR 蛋白免疫印迹杂交
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Effects of different doses of acitretin on FGF10 mRNA transcription and its protein translation in HaCaT cells
13
作者 于春水 谭升顺 +1 位作者 眭维耻 郗彦萍 《Journal of Medical Colleges of PLA(China)》 CAS 2006年第6期375-378,共4页
Objective: To observe the effects of different doses of acitretin on the transcription of FGF10 mRNA and the translation of FGF10 protein in cultured HaCaT cells. Methods: HaCaT cells were treated with different dos... Objective: To observe the effects of different doses of acitretin on the transcription of FGF10 mRNA and the translation of FGF10 protein in cultured HaCaT cells. Methods: HaCaT cells were treated with different doses of acitretin for 48 h, then the changes on the transcription of FGF10 mRNA and the translation of FGF10 protein in these cells were detected by immunofluorescence and in situ hybridization assay. Results: Compared with the control group, the transcription of FGF10 mRNA and the translation of FGF10 protein were gradually decreased along with the increasing dose of aeitretin. There were significant differences between different groups (P〈0.01). Conclusion: Aeitretin could inhibit the transcription of FGF10 mRNA and the translation of FGF10 protein in HaCaT cells. With the dose of aeitretin increased, the stains of both FGF10 mRNA and FGF10 protein in HaCaT cells are reduced. 展开更多
关键词 ACITRETIN HaCaT cells FGF10 IMMUNOFLUORESCENCE in situ hybridization
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Clinicopathologic features of 112 cases with mantle cell lymphoma 被引量:2
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作者 Dong-Mei Zhou Gang Chen +2 位作者 Xiong-Wei Zheng Wei-Feng Zhu Bao-Zhen Chen 《Cancer Biology & Medicine》 SCIE CAS CSCD 2015年第1期46-52,共7页
Objective: This study aims to explore the clinicopathologic features of 112 patients with mantle cell lymphoma (MCL). Methods: Data from 112 MCL cases were collected, and immunohistochemical assay was conducted. F... Objective: This study aims to explore the clinicopathologic features of 112 patients with mantle cell lymphoma (MCL). Methods: Data from 112 MCL cases were collected, and immunohistochemical assay was conducted. Fluorescence in situ hybridization (FISH) detected a break in the CCND 1 gene. The t-test was used in the statistical analysis. Results: All tumor cells in the 112 cases expressed B cell-related antigen, including 1 blastoid subtype and 1 polymorphic subtype. Among all cases, 106 expressed CD5 and 104 expressed cyclin D1. A break in the CCND1 gene was not found in 3 cases with CDS-MCL. IgH/CCND 1 polyploid was observed in 2 classic cases. Conclusion: MCL is a type of special immunophenotypic B-cell lymphoma, The prognoses ofblastoid and polymorphic subtypes are poor. Special subtypes should be classified during diagnosis. 展开更多
关键词 Mantle cell lymphoma (MCL) IMMUNOHISTOCHEMISTRY fluorescence in situ hybridization (FISH) PROGNOSIS
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山羊TNNT3基因可变剪切及其对骨骼肌细胞分化的作用
15
作者 陈媛 蔡禾 +3 位作者 李利 王林杰 仲涛 张红平 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2021年第20期4466-4477,共12页
【目的】快速骨骼肌肌钙蛋白T(fast skeletal troponin T3,TNNT3)作为肌钙蛋白(troponin,Tn)家族成员,调节横纹肌收缩、参与骨骼肌的生长发育并影响家畜肉质性状。通过获得山羊TNNT3基因的可变剪切体,分析山羊TNNT3基因可变剪切的表达... 【目的】快速骨骼肌肌钙蛋白T(fast skeletal troponin T3,TNNT3)作为肌钙蛋白(troponin,Tn)家族成员,调节横纹肌收缩、参与骨骼肌的生长发育并影响家畜肉质性状。通过获得山羊TNNT3基因的可变剪切体,分析山羊TNNT3基因可变剪切的表达模式及其在肌细胞分化中的作用,深入解析TNNT3基因在山羊骨骼肌生长发育过程中的作用机制。【方法】基于NCBI已公布山羊TNNT3基因(NM_001314210.1)和牛TNNT3基因(XM_010821200)mRNA序列,使用软件Primer Premier 6.0设计引物,以简州大耳羊胚胎期和出生后7个阶段骨骼肌为试验材料,克隆测序获得山羊TNNT3基因的CDS区可变剪切体,利用软件ORF Finder、EditSeq、DNAMAN、ClustalW和MEGA_X_10.1.8等对序列进行生物信息学分析;进一步设计实时荧光定量(real-time PCR,RT-qPCR)及半定量引物,研究TNNT3基因剪切体在7个不同组织(背最长肌(longissimus dorsi muscle,LD)、半膜肌(semimembranosus muscle,SM)、心、肝、脾、肺、肾)和7个发育阶段(胚胎期E75、E90、E105和出生后B3、B45、B150、B300)肌肉组织(背最长肌和半膜肌)中表达模式;此外,对转录本TNNT3_3进行体外编码能力检测确定其具有编码蛋白的能力,并在山羊骨骼肌卫星细胞(skeletal muscle satellite cells,MuSCs)中过表达,观察细胞形态变化以及检测标志基因的表达变化,研究其对山羊MuSCs分化的作用。【结果】①TNNT3(NM_001314210.1)CDS区全序列主要含有18个外显子,其中外显子16/17相互排斥,转录后单一表达。克隆发现山羊TNNT3基因5个新转录本(TNNT3_1—5),其外显子数分别是15、15、20、16、14。②生物信息学分析结果显示山羊TNNT3基因核苷酸序列和氨基酸序列与绵羊、牛、猪等哺乳动物具有很高的一致性,而与鱼类和爬行类动物的一致性较低,说明TNNT3基因序列在哺乳动物高度保守。③TNNT3 mRNA在背最长肌、半膜肌、心、肝、脾、肺、肾7个组织中都有表达,其中在骨骼肌中高度富集(P<0.01),心脏及肺次之,其余组织中较低;TNNT3 mRNA在背最长肌和半膜肌中的表达始终处于一个动态变化中,胚胎期TNNT3在半膜肌的表达量高于背最长肌(P<0.05);出生后则背最长肌中高于半膜肌(P<0.05)。④山羊TNNT3基因转录本TNNT3_3重复出现保守的外显子9—11(138bp),体外翻译实验显示其可编码蛋白且蛋白大小与预期基本相符(37 kD);相较于对照组,在山羊MuSCs中过表达该转录本使肌分化标志基因Myomaker、MyoG和MyH4 mRNA极显著升高(P<0.01)。【结论】获得了山羊TNNT3基因具有完整CDS区5个新可变剪切体,TNNT3主要在肌肉组织(背最长肌和半膜肌)中高表达,在哺乳动物中高度保守且促进成肌分化。初步表明TNNT3基因在动物肌肉生长发育中具有重要的生物学功能。 展开更多
关键词 山羊 TNNT3 可变剪切体 荧光定量PCR 体外转录翻译 蛋白免疫印迹杂交 肌原分化
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