对虾Toll受体及其在虾类营养免疫评价中的应用

Toll受体是一类跨膜蛋白,其胞外区能够识别仅表达在病原微生物上的高度保守的结构基序(motifs)——病原相关的分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),并将病原入侵的信号传递到细胞内,诱导产生一系列的免疫效应因子和免疫反应。Toll受体是机体对入侵病原微生物产生免疫效应的关键分子。多种对虾中存在Toll受体,但对虾Toll受体在虾类营养免疫研究中的应用尚未得到发掘。本文综述了Toll信号途径及对虾Toll受体的研究进展,并探讨了Toll受体在虾类营养免疫评价中的应用价值,认为对虾Toll受体表达量的变化可以反映机体对入侵病原识别的灵敏性,在今后的营养免疫学研究中具有重要价值,并提出了今后对虾Toll受体研究的方向。

幽门螺杆菌UreB和HspA DNA疫苗的构建及免疫评价

本研究选择幽门螺杆菌尿素酶B和热休克蛋白A为候选抗原,通过PCR扩增基因,克隆至真核表达质粒pCD-NA3.1(-)His-Myc上,构建成DNA疫苗。通过小鼠免疫效果的评价,获得两株具有免疫源性DNA疫苗。

猪全血中IFN-γ、IL-2、TNF-αTaqMan定量RT-PCR方法的建立及对猪瘟疫苗的免疫评价

为建立猪相关细胞因子的检测方法,本研究针对GenBank中猪IFN-γ、IL-2、TNF-α的基因设计特异性引物和荧光探针,建立了这3种细胞因子TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,建立的检测方法在101～109拷贝/μL模板范围内具有良好的线性关系,相关系数R2均高达0.999。利用该方法对猪瘟(CSF)活疫苗进行细胞免疫评价,结果显示,CSF疫苗免疫组猪瘟病毒(CSFV)刺激细胞相对于空白对照细胞,IFN-γ、IL-2、TNF-αmRNA表达量在免疫后3 d～10 d之间均显著升高(p<0.05),而IFN-γ在14 d仍保持高水平表达;对照组CSFV刺激细胞和空白对照细胞的3种细胞因子表达量均无明显差异(p>0.05)。以上结果表明,该方法具有高度的特异性、敏感性和重复性,对不同疫苗的细胞免疫反应评价是可靠的。

溶酶体靶向的汉坦病毒包膜糖蛋白DNA疫苗的体液免疫评价和攻毒保护效果

目的:构建嵌合溶酶体相关膜蛋白(LAMP)的汉坦病毒糖基化蛋白DNA疫苗并对其免疫进行评价。方法:利用前期实验构建的重组质粒pVAX-Gn、pVAX-Gc、pVAX-LAMP/Gn和pVAX-LAMP/Gc以及inactivated疫苗免疫BALB/c小鼠,分别通过间接ELISA和中和试验检测免疫小鼠血清中的特异性抗体和中和抗体;攻毒实验检测小鼠体内的保护效力。结果:间接ELISA结果显示,pVAX-LAMP/Gc组特异性抗体滴度最高,依次为pVAX-Gc、pVAX-LAMP/Gn、pVAX-Gn与inactivated疫苗组;中和结果显示,LAMP组均优于相应传统DNA疫苗组,且抗体效价均优于Inactived vaccine组;攻毒实验显示,DNA疫苗和inactivated疫苗组小鼠体内无汉坦病毒特异性抗原检出。结论:LAMP分子的嵌合DNA疫苗可诱导更高水平的抗体,在小鼠体内有较好的保护效力,这一靶向策略有望成为提高DNA疫苗效价的有效方式。

猪细小病毒病毒样颗粒的制备及其免疫评价

为了研制猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)疫苗,结合大肠杆菌密码子偏好性,经密码子优化,合成猪细小病毒VP2蛋白编码区序列,并将其插入原核表达载体pET28a中,随后转化BL21(DE3)感受态细胞,再转入伴侣蛋白质粒pTf16构建共表达载体,优化诱导表达条件,进行SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果表明,在L-阿拉伯糖质量浓度为2 mg/mL、IPTG浓度为0.1 mmol/L、温度为30℃、诱导12 h时重组蛋白VP2可溶性表达量最高,经硫酸铵沉淀和Ni-NTA亲和层析纯化获得纯度约90%的VP2蛋白,体外装配可形成直径约20 nm的具有血凝活性的VLPs。用制备的VLPs免疫昆明鼠并对其进行免疫评价,结果表明,制备的VLPs能有效刺激机体产生高滴度抗体,ELISA效价高达1∶25600。可见,制备的VLPs能刺激机体产生特异性抗体。

炭疽芽孢杆菌新抗原NlpC的重组表达与免疫评价

目的:构建炭疽芽孢杆菌新抗原NlpC的原核表达质粒,制备NlpC重组蛋白并进行免疫评价,为新型炭疽亚单位疫苗研发提供参考。方法:运用生物信息学软件分析和预测NlpC蛋白的跨膜区、信号肽、疏水性、保守性等性质;PCR扩增nlpc基因片段,构建NlpC原核表达质粒,IPTG诱导表达,His亲和层析法纯化目的蛋白,SDS-PAGE与Western印迹鉴定纯化的蛋白;NlpC重组蛋白联合佐剂免疫小鼠后,ELISA法检测免疫血清的抗体效价,体外实验检测免疫血清抑制芽孢萌发功能,BALB/c小鼠免疫攻毒实验评价免疫保护效果。结果:生物信息学分析结果表明NlpC有信号肽,无跨膜区,亲水性好,具有较高的保守性;构建了NlpC原核表达质粒,经诱导表达与纯化获得了纯度高于95%的NlpC蛋白;免疫评价结果显示NlpC联合Al(OH)3+CpG佐剂可激发小鼠产生高水平的抗体反应,NlpC免疫血清可在体外抑制炭疽芽孢萌发,NlpC免疫组可显著延长炭疽杆菌芽孢攻毒后小鼠存活时间。结论:NlpC具有较好的免疫原性,是潜在的炭疽杆菌保护性抗原,可作为新型炭疽亚单位疫苗的候选组分。

汉滩病毒包膜糖蛋白嵌合DNA疫苗的细胞免疫评价及其优势表位的筛选

目的:筛选Gn和Gc抗原优势表位,为汉滩病毒疫苗研究提供方向.方法:通过构建汉坦病毒包膜糖蛋白Gn与Gc嵌合溶酶体相关膜蛋白的DNA疫苗pVAX-LAMP/Gn,pVAX-LAMP/Gc,利用酶联免疫斑点实验(ELISpot)长期评估了BALB/c小鼠体内的细胞免疫应答.结果:在刺激T淋巴细胞的短效与长效免疫中,pVAX-LAMP/Gc组的效应优于其他组,并筛选出优势抗原表位.结论:目前许多新型汉滩病毒疫苗研究缺少细胞免疫应答评价和记忆免疫应答评价.筛选出的Gn和Gc的抗原优势表位,可以为新型汉滩病毒疫苗的研制奠定良好的基础.

副结核分枝杆菌免疫原蛋白的筛选及免疫保护效果评价

【背景】副结核病(paratuberculosis,PTB)是由副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis,MAP)主要引起反刍动物的一种慢性消耗性传染病。患病动物表现为肉芽肿性肠炎和肠道的功能失调、顽固性腹泻、渐进性消瘦、营养不良、贫血、嗜睡甚至死亡。PTB给畜牧业造成巨大的经济损失,并且严重威胁公共卫生安全。由于目前临床上对于PTB的检测和控制手段不够完善,现有的PTB疫苗保护效果不佳,并且干扰牛结核病的诊断,因此亟需研发免疫原性强、保护效果佳的疫苗以用于PTB的防控。【目的】通过筛选MAP免疫原蛋白,并对其免疫保护效果进行评价,为PTB的防控提供数据支持。【方法】根据MAP的p22、map1272c、map3531c、map3783、map3701c以及map3527这6个基因,分别构建5种重组质粒,在获得5种重组蛋白基础上,联合MONTANIDE ISA 61 VG佐剂皮下多点注射免疫小鼠,通过IFN-γELISPOT试验筛选出最佳免疫原;随后将最佳免疫原和已报道的66NC融合蛋白混合,经皮下多点注射免疫小鼠,在二免3周后用1×10^(8)CFU的MAP K-10菌株腹腔感染小鼠。通过IFN-γELISPOT试验,抗体监测和细胞因子检测,分析感染后小鼠的体重、肝脏病理学和组织病理学变化及其荷菌数差异,综合评价候选亚单位疫苗的免疫原性和免疫保护效果。【结果】以MAP p22、map1272c、map3531c、map3783以及map3701c为基础成功构建和表达了5种融合蛋白58F、62F、69F、46F和52F,其中免疫58F后产生的IFN-γ水平最高,是更具潜力的候选免疫原,且以融合蛋白组合66NC+58F诱导持久高滴度的IgG、IgM、IgG1和IgG2a水平,诱导特异性的IFN-γ、TNF-α和IL-17A的释放;在保护效果评价中,融合蛋白组合66NC+58F抵抗MAP感染造成的体重下降,显著减轻肝脏的病理损伤,降低MAP在肝脏中的定植。【结论】融合蛋白组合66NC+58F诱导小鼠产生Th1和Th17型免疫反应,对MAP感染有着一定免疫保护作用,是PTB重要的候选亚单位疫苗。

复合蛋白粉安全性和免疫功能评价

本研究旨在评估复合蛋白粉(Complex Protein Powder,CPP)的安全性和免疫功能。急性经口毒性实验、遗传毒性实验和亚急性口服毒性实验(28 d)结果显示,CPP安全性较高,不会对小鼠的生长发育产生负面影响。CPP对小鼠免疫功能的影响试验显示,中剂量组(1667 mg·kg^(-1)bw·d^(-1))CPP可以显著提升小鼠的NK细胞活性、巨噬细胞吞噬率等指标,有效增强小鼠的免疫功能。

2020-2023年麻栗坡县家禽新城疫和禽流感免疫效果评价与分析

为了解麻栗坡县禽流感和新城疫疫苗免疫效果,2020-2023年持续4年在11个乡(镇)共采集血清样品7381份,采用HI方法进行血清抗体检测,汇总分析不同年份、不同抗原、不同养殖方式检测数据。结果显示:2020-2023年禽流感(H5+H7)平均抗体阳性率分别为82.39%、82.76%、87.28%、75.79%,年度间抗体阳性率差异显著(P<0.05);不同亚型抗原H5 Re-11、H5 Re-12、H7 Re-3、H5 Re-14、H7 Re-4平均抗体阳性率分别为81.34%、86.58%、81.97%、80.49%、77.11%;2020-2023年规模场禽流感(H5+H7)平均个体抗体阳性率分别为81.51%、93.40%、100%、70.46%;散养户禽流感(H5+H7)平均个体抗体阳性率分别为94.17%、81.31%、86.57%、76.56%;2020-2023年新城疫平均抗体阳性率分别为83.10%、58.60%、44.27%、46.50%;2020-2023年规模场新城疫平均个体抗体阳性率分别为77.40%、90.36%、31.75%、72.08%;散养户平均个体抗体阳性率分别为83.66%、54.26%、46.54%、42.83%。结果表明:2020年以来,麻栗坡县高致病性禽流感免疫效果较好,发生大规模禽流感疫情风险较低。2021-2023年新城疫抗体免疫效果总体不达标(合格率<70%),应引起高度重视。本研究为麻栗坡县禽类疫病防控提供数据支持,能有效预警家禽禽流感、新城疫传播风险,推动麻栗坡县禽类养殖业健康安全发展。

猪传染性胃肠炎疫苗抗体免疫效果评价

1材料与方法1.1一般材料在两个养殖场中各选择100头猪,按照养殖场的不同将这些猪分为两组,一组为养殖场一,这组中猪个体的年龄是在2个月至10个月之间,其中幼猪有21头,孕猪有17头,成年猪有62头;另一组为养殖场二,这组中猪的年龄是在3个月至10个月之间,幼猪的数量为24头,孕猪的数量为21头,成年猪的数量为55头。纳入标准:猪个体不存在其他类型疾病;猪个体的体征情况较为良好;猪个体对疾病疫苗不存在过敏现象;本次研究已征得养殖人员的同意。排除标准:猪个体之间的对比存在较大差异;猪个体的年龄过大;猪个体的身体情况不佳;猪个体已经存在传染性胃肠炎疾病。

A型猪塞内卡病毒CH-HNXC株灭活疫苗免疫效果评价

塞内卡病毒病(Senecavirus Disease,SVD)是由A型塞内卡病毒引起的一种水疱病。SVA属于小RNA病毒科、塞内卡病毒属中唯一成员,其基因组为单股正链不分节段的RNA病毒。SVA感染后各个年龄段猪群均可发病。临床上主要表现为猪鼻吻、蹄部水疱病变,母猪伴有发热和厌食,新生仔猪伴有腹泻、脱水等症状。

不同剂量的猪瘟活疫苗单次免疫效果评价及疫苗存留试验

用1 200 RID、6 000 RID和24 000 RID 3种不同剂量的猪瘟活疫苗单次免疫9头30日龄的断奶仔猪,检测试验猪的抗体消长和疫苗毒核酸在猪体内的存留时间,并用6头猪进行攻毒保护试验。结果表明:不同免疫剂量的试验猪其抗体水平的动态变化没有显著差异,免疫后21 d试验猪的猪瘟抗体均成阳性,63 d后至578 d猪瘟抗体阻断率仍然高于85%,应用荧光定量RT-PCR技术检测,猪瘟疫苗毒核酸在猪血液和扁桃体中的检出时间分别达28 d和42 d;免疫后370 d进行猪瘟强毒攻击后,免疫猪没有出现明显的临床症状,存活且不带毒。本研究证实,没有其他疫病和母源抗体的仔猪单次接种合理剂量的猪瘟活疫苗就能产生坚强的保护力,提出加强种猪场各种病原监测,淘汰病原阳性种猪,净化种猪群对提高猪瘟疫苗免疫效果,最终控制猪瘟具有重要意义。

BVDV-E2截短基因重组卡介苗对牛的免疫效果评价

为评价牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E2截短基因重组卡介苗对牛的免疫效果,将BVDV抗原抗体阴性牛随机分为rBCG-pMV361-E2-1(1 aa-297aa)、rBCG-pMV361-E2-2(1 aa-345 aa)、rBCG-pMV361-E2-3(1 aa-374 aa)、rBCG-pMV361-E2-4(45 aa-297 aa)、rBCG-pMV361-E2-5(45 aa-345 aa)、rBCG-pMV361-E2-6(45 aa-374 aa)、BVDV对照组、BCG对照组和PBS对照组,各组牛免疫相应疫苗后通过特异性抗体检测、淋巴细胞增殖试验、淋巴细胞亚群检测和细胞因子检测分析疫苗的免疫效果。结果显示,BVDV E2截短基因重组卡介苗均可诱导BVDV特异性抗体的产生,rBCG-pMV361-E2-1组抗体水平高于其他重组卡介苗试验组和BVDV对照组。淋巴细胞增殖试验结果显示,rBCG-pMV361-E2-2组SI为2.038±0.21,显著高于其他重组卡介苗试验组(P<0.01)。牛外周血CD4^+、CD8^+T淋巴细胞亚群检测结果显示,rBCG-pMV361-E2-5组牛外周血中CD4^+和CD8^+ T淋巴细胞亚群含量与PBS组比较,差异极显著(P<0.01)。IFN-γ检测结果显示,rBCG-pMV361-E2-1的IFN-γ水平显著高于其他试验组和对照组(P<0.01)。研究表明,rBCG-pMV361-E2-1可诱导接种牛产生较好的体液免疫应答,rBCG-pMV361-E2-1、rBCG-pMV361-E2-2和rBCG-pMV361-E2-5在诱导细胞免疫应答上效果较好。

无针免疫猪圆环病毒2型亚单位疫苗效果评价

为评价用无针注射器接种猪圆环病毒2型亚单位疫苗的安全性及免疫效果,为无针免疫的使用、推广提供数据支撑,将40头3~5周龄三元猪随机均分为4组,即有针注射1头份剂量组以及无针注射低(1/4头份)、中(1/2头份)、高(1头份)剂量组,分别于第1、21天开展两次免疫,观察试验前后动物的临床症状、体重变化,并对第7、14、21、28、42天各组动物体内抗体水平变化及免疫效率等进行研究。结果显示:采用无针注射器进行免疫时动物疼痛反应较小,注射速度快,免疫后各组动物精神状态、饮食、饮水、自发活动等无异常;与有针注射组动物相比,减量注射(1/4头份)可以显著促进仔猪增重(P<0.05),同时可以达到和有针注射同样的免疫效果(P>0.05);同等剂量亚单位疫苗注射免疫后,无针免疫组动物体内抗体水平更高(P<0.01),且各组动物体内抗体阳性率均可有效维持至试验结束。结果表明,用无针注射器接种猪圆环病毒2型亚单位疫苗安全性高、耐受性好、有效性稳定,无针注射器减量免疫可以达到有效保护作用的同时促进了仔猪生长,可尝试推广应用。

猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体和猪瘟疫苗不同免疫程序的免疫效果比较分析

为了评估不同免疫策略对猪场免疫效果和经济效益的影响,以确定最佳的疫苗免疫程序,本试验将处于产前1个月的四胎次健康三元母猪随机分为2个组,A组(联合免疫组)母猪于产前27 d联合免疫猪圆环病毒2型基因工程疫苗、猪肺炎支原体灭活疫苗和猪瘟活疫苗(圆柯欣+柯喘宁+稳柯健),其所产仔猪于21日龄联合免疫圆柯欣、柯喘宁和稳柯健;B组(对照组)母猪于产前34和27 d分别免疫稳柯健、猪圆环病毒疫苗和猪肺炎支原体疫苗二联疫苗(圆-支二联疫苗),其所产仔猪于14日龄免疫圆-支二联疫苗,28日龄免疫稳柯健。统计和分析免疫各组临床指标、生产性能和持续性抗体水平。结果显示,免疫疫苗后,2个组的母猪采食情况均正常;2个组的仔猪整体精神状态良好,哺乳情况正常,均未出现咳嗽和喘气等呼吸道疾病。在试验期间内,2个组的母猪的窝产健仔数和仔猪出生健仔均重并无差别。A组和B组的出生至23日龄死淘率、出生至50日龄死淘率分别为3.77%、5.11%和4.07%、5.43%,A组略优于B组。抗体监测结果显示,A组母猪的CSFV和PCV2抗体水平较B组无显著差异(P>0.05);A组仔猪的CSFV抗体阳性率与B组无明显差异(P>0.05),而PCV2抗体水平在免疫早期阶段(21日龄)明显高于B组(P<0.05)。结果表明,猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体和猪瘟疫苗可以联合免疫,且免疫后相互之间不干扰。该联合免疫策略在确保免疫效果的同时,简化了疫苗免疫程序,为确定最佳的疫苗免疫程序提供了有价值的临床应用参考。

炭疽PA和芽孢双组分候选疫苗免疫豚鼠的免疫学初步评价

目的对豚鼠免疫重组PA抗原和甲醛灭活芽孢组成的炭疽候选疫苗,评价其免疫效果。方法将豚鼠随机分成5个实验组,分别免疫高、中、低剂量候选疫苗、炭疽活疫苗或生理盐水;免疫后不同时间点采血进行抗体检测、XTT法淋巴细胞增殖检测以及皮肤迟发型超敏反应检测。结果抗体检测结果显示,双组分炭疽候选疫苗能诱导较强的体液免疫应答;XTT细胞增殖结果显示,外周血淋巴细胞特异性增殖不明显,但所有候选疫苗组针对rPADTH阳转率24h后均为100%。结论双组分炭疽候选疫苗能诱导豚鼠产生体液免疫和细胞免疫应答。

腹水病(Virulent ascitesosis disease)和溃烂病(Ulcer disease)致病病原四联疫苗制备及免疫牙鲆效果评价

腹水病和溃烂病是海水工厂化养殖牙鲆(Paralichthys olivaceus)危害严重的疾病。作者用本实验室分离鉴定的腹水病、溃烂病致病菌—迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda,Et)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus,Val)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida,As)和同行实验室赠予的鳗弧菌(Vibrio anguillarum,Van)制备灭活菌苗,设计四种不同配比四联疫苗,按正交试验要求,分别腹腔注射接种免疫牙鲆,检测单抗原抗体效价,统计分析筛选出组合合理的四联疫苗,配比为Et:Val:Van:As=2:1:1:2,并进行了疫苗安全性、稳定性评价及免疫牙鲆效果观察。发现该四联疫苗是安全的,稳定的,可在4℃下存放1年以上活性不降低,能有效刺激牙鲆特异性免疫系统产生免疫应答,免疫后7天血清抗体效价明显升高,免疫后14d血清抗体效价达到最高水平,为210;人工攻毒试验测定相对免疫保护率为60%。表明,筛选出的牙鲆腹水病和溃烂病四联疫苗安全有效,可同时预防腹水病、溃烂病的发生和流行。

元江县2018-2021年生猪O型口蹄疫免疫效果评价与分析

为了解元江县生猪O型口蹄疫(FMD-O)疫苗免疫状况,并评估免疫效果,2018-2021年在全县10个乡镇的规模场和散养户中,随机采集生猪血清样品,采用ELISA方法进行免疫抗体检测。结果显示:不同年份FMD-O免疫抗体合格率平均为64.94%;不同区域FMD-O免疫抗体合格率平均为64.01%;不同养殖方式规模场FMD-O的免疫抗体合格率(66.23%)与散养户(64.61%)相比,相差1.62个百分点,差异不显著(P>0.05)。结果表明,近年来元江县生猪FMD-O整体免疫效果不是很理想,出现免疫不达标的年份、区域及养殖方式,应引起高度重视,检测结果可为元江县生猪FMD-O的潜在风险点控制、疫苗选择及防控提供参考。