免疫辣根过氧化物酶染色法诊断猪弓形虫病的研究

根据病猪临床表现以及病猪组织切片的常规苏木素-伊红(HE)染色和免疫辣根过氧化物酶染色对病猪作出初步诊断;采集病猪的各脏器组织,研磨后接种ICR鼠,分离鉴定病原,探讨免疫辣根过氧化物酶染色法快速诊断猪弓形虫病的可行性。结果表明:常规HE染色法和免疫辣根过氧化物酶染色法都能发现弓形虫的假包囊或速殖子。但是,HE染色切片仅能在个别视野中发现弓形虫,而免疫辣根过氧化物酶染色法可在许多器官切片的多个视野中观察到更多的被染成棕黄色的弓形虫速殖子和假包囊,证明免疫辣根过氧化物酶染色法是诊断猪弓形虫病的有效方法。

肼化辣根过氧化物酶糖蛋白染色法

探索一种简便灵敏的糖蛋白半定量法。在 ｐＨ ５．０，碳二亚胺（ＥＤＣ）催化下，辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）与己二酰二肼反应生成肼化的ＨＲＰ（ＨＲＰ－ＨＺ），固相于硝酸纤维素膜上的糖蛋白（纤连蛋白或转铁蛋白）经过碘酸氧化其糖链中的糖基后生成的醛基可与ＨＲＰ—ＨＺ缩合，用ＨＲＰ的发包底物显色即可检出精蛋白的存在与否。结果：糖蛋白中，１０ ｎｇ的糖即可被检出。结论：与其他糖定量方法相比，该方法灵敏度高，方法简便，能够普遍应用。

血红蛋白模拟辣根过氧化物酶在酶联免疫分析中的应用

提出了以血红蛋白(Hb)作为辣根过氧化物酶模拟酶,用碳二亚胺法将其标记人IgG,Hb标记人IgG在形成免疫复合物后,仍可保持其95%的催化活性.以邻苯二胺作为氢供体,以羊抗人IgG为分析模型,建立了以血红蛋白作为酶标记物的竞争型免疫分析新体系.人IgG在15～1000μg/L范围内与体系吸光度呈良好的线性关系,线性方程为A=0.297-1.286E-4[IgG](μg/L),相关系数r=0.9992(n=8),检测限为15μg/L.用于人正常血清中人IgG含量的测定,加标回收率为94%～108%,结果令人满意.

2-氨基-3-羟基吡啶-过氧化氢-辣根过氧化物酶伏安酶联免疫体系分析人血清癌胚抗原

以氮杂环化合物为电化学分析底物的2-氨基-3-羟基吡啶-H2O2-辣根过氧化物酶(HRP)伏安酶联免疫体系测定人血清癌胚抗原(CEA)。HRP催化H2O2氧化2-氨基-3-羟基吡啶的酶促反应产物,在缓冲液中-0.36V处产生一个灵敏的伏安还原峰,借助此峰可以测定游离的HRP,进而可用于以HRP为标记物的酶联免疫分析。对酶促反应条件和测定条件的优化反应条件为:以B-R缓冲液(pH6.0)为反应介质,在10mL总反应液中含有1.0mL0.2mol/LB-R缓冲液、3.0mL8.0mmol/L2-氨基-3-羟基吡啶溶液以及1.5mL0.5mmol/LH2O2溶液,反应温度37℃,反应时间30min。最佳测定条件为:B-R缓冲液(pH7.0)为支持电解质,在10mL总测定溶液中含有5mL上述总反应液、1.0mL0.2mol/LB-R缓冲液。测定仪器条件:起始电位0.00V,终止电位-0.80V,电位扫描速度400mV/s,滴汞静止时间7s。在最佳的反应条件和测定条件下,新体系测定游离HRP的线性范围为4.0×10-4～1.0μg/L;对HRP的检出限为0.12ng/L。新体系对CEA测定的线性范围为0.50～80.0μg/L;检出限为0.50μg/L。为经典ELISA法的检出限的1/10。

4-羟基苯乙烯基吡啶为辣根过氧化物酶底物的酶荧光免疫传感体系测定布氏杆菌抗体

合成了一种新型辣根过氧化物酶(HRP)荧光底物-4-羟基苯乙基吡啶(pHSP),并首次将它运用于酶联荧光免疫传感体系.对pHSP化学性质的研究证实,pHSP在空气中较稳定,对HRP,H2O2的荧光响应性能优于传统HRP荧光底物,如对羟苯乙酸、Amplex Red和佳味醇等.在pH5.8的Britton-Robinson缓冲溶液中,pHSP本身只有极弱的荧光,在HRP-IgG催化下可被H2O2氧化成二聚体产物,该二聚体在300nm的激发光下能发射波长为437nm的强荧光,并且反应体系的荧光增加与HRP量在一定浓度范围内成线性相关.根据此原理,建立了兔布氏杆菌抗体的酶联荧光传感分析新方法.运用制备的传感装置测定兔布氏杆菌抗体的线性范围为6.3×10-11～1×10-8mol·L-1,抗体检出限为6.3×10-11mol·L-1,相对标准偏差为4.1%(n=11).pHSP的二聚体产物水溶性很低,利用设计的装置较好地解决了传统测定溶液体系方法灵敏度不高的问题.

白藜芦醇作辣根过氧化物酶底物的布氏杆菌抗体酶联免疫传感器研究

一种纯天然产物白藜芦醇用作辣根过氧化物酶（HRP）底物。对其化学性质的研究证实，白藜芦醇在空气中较稳定，对HRP、H2O2的电化学响应性能优于传统HRP底物，对人体无毒害。白藜芦醇在HRP催化下可被H2O2氧化成醌，产物醌在电极上于一376mV处可被还原，其电流的大小与HRP的浓试在一定浓度范围内呈线性相关。将兔布氏杆菌抗原包埋在石墨．石蜡基质中制备了测定兔布氏杆菌抗体的电化学酶联免疫传感器，该传感器测定兔布氏杆菌抗体的线性范围为3×10^-4～1．65×10^-2g／L；检出限为1×10^-4g／L；RSD为4．6％。本方法制备免疫传感器的电化学性能稳定，抗原活性保持良好。

辣根过氧化物酶标记JWA抗体及其在免疫检测反应中的应用

目的:运用辣根过氧化物酶标记JWA单克隆抗体,并且将标记的抗体应用于ELISA法和western blot等免疫检测反应中。方法:运用高碘酸盐-四氢硼化钠氧化还原体系活化辣根过氧化物酶,活化的辣根过氧化物酶按1∶1标记JWA单克隆抗体;将HRP标记的抗体分别运用直接和双夹心ELISA测试;同时将标记单克隆抗体运用于western blot检测。结果:辣根过氧化物酶成功标记JWA单克隆抗体。其中HRP-JWA(4C9)抗体在直接法ELISA试验中和多肽的结合能力高于HRP-JWA(7C3);其在450 nm处的最大吸光度值为0.96。双夹心ELISA实验中,预先包被JWA(4C9)单抗,检测抗体使用HRP-JWA(7C3)可以得到较好的实验结果,在450nm处的最大吸光度值为1.30。在western blot实验HRP-JWA抗体浓度1.0μg·m L-1可以检测出SGC7901细胞中目的蛋白。结论:运用氧化还原方法成功标记JWA单克隆抗体,并可以初步应用于免疫反应的检测。

毛细管电泳流动注射化学发光检测辣根过氧化物酶及其在免疫分析中的应用

辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)是从植物辣根中提取出来的一种由无色的酶蛋白和深棕色的卟啉结合而成的糖蛋白,能催化鲁米诺(luminol)、异鲁米诺(isoluminol)及其衍生物而发光.……

以变色酸2R为底物测定辣根过氧化物酶的研究

变色酸 2R(CT2R)是一种具有电化学活性的物质 ,在碱性条件下 ,该物质在滴汞电极上 - 6 6 0mV(vs.SCE)左右产生还原波 ,加入H2 O2 和辣根过氧化物酶 (HRP)后 ,该物质被氧化生成具有非电化学活性的物质 ,导致溶液中游离的CT2R浓度降低 ,相应还原波波高降低 ,HRP在一定含量范围内与伏安峰的降低值具有良好的线性关系。通过测定波高的降低值可测定HRP ,测定游离HRP的线性范围是 4 .0× 10 -5～ 4 .0× 10 -3 g/L。对酶促反应的动力学进行了研究 ,反应的米氏常数Km =1.38mmol/L ,最大反应速率Vmax=5 3.9nA/min。

光镜和电镜研究免疫酶的组织化学染色法

本文对免疫酶组织化学的样品制备程序和染色方法做了详细的阐述。用直接法、间进法和ABC法,对IgA、Leu4、HLA-DR、CEA和4型角蛋白的定位,进行了光镜和电镜的观察,染色阳性反应显著,获得了满意的效果。并对染色技巧做了分析和探讨。

以1-萘胺为底物伏安法测定辣根过氧化物酶

提出了1-萘胺-过氧化氢-辣根过氧化物酶(HRP)伏安酶联免疫分析体系应用于HRP的伏安法测定。在pH 7.0的KH_2PO_4-Na_2HPO_4缓冲溶液中,HRP催化过氧化氢氧化1-萘胺生成电活性产物,在极谱仪上进行二阶导数伏安线性扫描,该产物在滴汞电极上发生还原反应,于-0.43 V(vs.SCE)左右产生一灵敏的还原峰。HRP浓度在3.0×10^(-7)～5.0×10^(-5)g·L^(-1)范围内与线性扫描峰电流的二阶导数值(△I″_p)呈线性关系,检出限为2.5×10^(-7)g·L^(-1)。

以1-氯萘酚为底物的分光光度法测定辣根过氧化物酶

提出了1-氯萘酚-H2O2-辣根过氧化物酶（HRP）催化动力学光度法测定HRP的新方法。在pH10.0的B-R缓冲溶液中,HRP催化H2O2氧化1-氯萘酚生成有色化合物,通过测定该有色化合物在波长为580 nm处的吸光度值,间接测定HRP的含量。在所选定的实验条件下,测定HRP的线性范围是3.0×10^-9-5.0×10^-7g/mL,检测下限为2.0×10^-9g/mL。此方法可以应用于测定动植物体内的抗原和抗体。

以OT为底物固体电极伏安法测定辣根过氧化物酶及其标记物的研究

以玻碳电极为工作电极研究了邻联甲苯胺(OT)为底物微分脉冲伏安法测定辣根过氧化物酶(HRP)及其标记物的方法。HRP能够催化H2O2氧化OT,其反应产物在玻碳电极上-0.58V(vs.Ag/AgCl)左右被还原产生一个灵敏的还原峰,还原峰电流随着酶浓度的增大而增大,借助此还原电流可以测定HRP,并进而可用于以HRP为标记物的酶免疫分析。对酶催化反应条件和酶催化反应产物的测定条件进行了详细的研究,在最佳实验条件下测定游离HRP的线性范围是2.0×10-9～4.0×10-8g/mL,检出限为1.6×10-9g/mL;测定游离的酶标记物(IgG HRP),稀释范围为1∶2000～1∶400000,最大稀释比为1∶400000。

RmIL-18多克隆抗体的制备及辣根过氧化物酶的标记

目的用纯品rmIL-18免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,并予辣根过氧化物酶标记。方法使用免疫佐剂包被rmIL-18分次免疫新西兰兔,得到兔血清,再采用硫酸铵沉淀粗提法和QAE-Sephadex A-50离子交换层析法提纯IL-18抗体,最后用HRP简易过碘酸钠法标记IL-18抗体。结果用以上方法标记的IL-18抗体酶标记率为40.29%,酶标抗体的效价为1∶3200,最佳工作浓度为l∶1600。结论成功制备出标记HRP的IL-18多克隆抗体,建立了IL-18抗原的酶联免疫检测,以进一步用于实验研究。

以对苯二酚为底物伏安法测定辣根过氧化物酶

提出了以对苯二酚作为辣根过氧化物酶(HRP)的底物,伏安法测定辣根过氧化物酶活性的新方法。在醋酸-酸酸钠缓冲溶液中,对于 HRP 催化 H_2O_2氧化对苯二酚的反应,其氧化产物在滴汞电极上可以发生还原反应,于—0.81 V(vs.SCE)处产生一个较为灵敏的伏安峰。此伏安峰可用于测定 HRP 的活性,测定 HRP的线性范围为8×10^(-10)～5×10^(-8)g/mL,检测下限为6×10^(-10)g/mL。同时,考察了酶催化反应条件和伏安测定条件。

中耳粘膜辣根过氧化物酶逆行追踪

采用辣根过氧化物酶(HRP)束路追踪法,中耳粘膜多点注射HRP逆行追踪,研究中耳粘膜的神经支配。结果发现,中耳粘膜自主神经主要来源于颈上神经,感觉神经主要来源于脊髓背角神经、三叉神经及舌咽神经。讨论了中耳粘膜自主神经及感觉神经的分布特点,和中耳神经肽的可能来源,为中耳神经能性炎症机制提供了新的理论依据。

以对氨基联苯为底物伏安法测定辣根过氧化物酶

伏安酶联免疫分析法是将伏安法与酶联免疫分析法相结合的一种分析方法，以测定标记酶的活性为基础，进而应用到各种模式的酶联免疫分析中，已经应用于植物病毒血清学的检测和动物病毒抗原抗体的测定等多个领域。辣根过氧化物酶（HRP）的测定对免疫学和组织化学的研究及临床疾病诊断具有重要的意义和广泛的应用前景。本文提出了以对氨基联苯为底物的伏安酶联免疫分析新体系，建立了测定HRP的伏安酶联免疫分析新方法。

辣根过氧化物酶标记兔抗丝状噬菌体衣壳蛋白抗体的制备与初步应用

为了制备用于噬菌体展示肽库的筛选及鉴定等环节的辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗丝状噬菌体(M13)衣壳蛋白抗体,试验制备了兔源的M13KE多克隆抗体,将多克隆抗体经饱和硫酸铵法和Protein G Resin层析柱纯化后运用过碘酸钠法对其进行辣根过氧化物酶标记,对标记前和标记后纯化产物进行活性测定,同时对标记后产物进行Western-blot鉴定,以及将其应用到验证已知的阳性噬菌体H11、H12、H14、H16、H18中。结果表明:兔抗M13KE多克隆抗体效价高于1∶32 000,标记后活性高于1∶4 000,标记抗体与已知阳性噬菌体的ELISA鉴定结果与前期测序结果一致。说明此酶标抗体有一定的应用价值。

季胺-辣根过氧化物酶-过氧化氢显色新体系及其在酶活性检测中的应用

建立了光度法测定辣根过氧化物酶(HRP)活性的季胺-过氧化氢-HRP新体系,探讨了反应机理.该方法基于含KI的pH4.5PBS介质中,HRP催化H2O2氧化季胺[二(4–二甲氨基苯基)甲烷]的显色反应在462nm处的吸光度.吸光度与HRP活性呈线性关系.该可溶性的季胺比目前临床常用显色剂3,3',5,5'-四甲基联苯胺更稳定,克服了后者的缺点.在选定的实验条件下,测定HRP的线性范围为2.0×10-9～2.5×10-7g/mL,检出限为3×10-10g/mL.应用于HRP标记马抗人甲胎蛋白免疫标记物的测定,结果满意.该方法操作简便,灵敏度高,在临床上有较好的应用前景.

辣根过氧化物酶和荧光碳点的复合物研究

辣根过氧化物酶(HRP)是一种来源于辣根的含有铁离子的糖蛋白,可用于生化分析且在过氧化氢存在时能催化苯酚等物质氧化,HRP可与许多物质复合进而改善性能并拓宽其应用。采用一步水热法合成了平均尺寸约2 nm的氟掺杂的荧光碳点(F-CDs)。所得F-CDs在紫外灯下发黄绿色荧光且具有明显的激发光依赖性和浓度依赖性,以硫酸喹啉盐为参比计算出其相对量子产率高达45.6%。研究表明,F-CDs在Hela细胞内具有较好显影性能,F-CDs可与HRP形成稳定的复合物(F-CDs/HRP),该复合物不仅保留酶氧化2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)的能力,还保留着F-CDs优异的荧光性能。此外,加入过氧化氢的浓度影响F-CDs/HRP催化氧化ABTS的能力。在低温如4℃时,F-CDs/HRP复合物仍然可以迅速催化氧化ABTS,能通过溶液显色程度来定性分析F-CDs/HRP中HRP的催化活性。因此,F-CDs/HRP复合物有应用于免疫荧光分析的潜力。