猪圆环病毒2型免疫过氧化物酶单层细胞试验抗体检测试剂盒的研制及应用

本研究建立了一种免疫过氧化物酶单层细胞试验(Immunoperoxidase monolayer assay,IPMA),用于猪圆环病毒2型血清抗体检测,通过对IPMA反应条件的优化,组装了诊断试剂盒。研究结果表明,用IPMA检测猪圆环病毒2型人工感染猪血清,于感染后3周抗体阳转,第3周～10周抗体阳性检出率为92.8%(52/56),对照组猪血清抗体检测均为阴性(33/33)。试剂盒在-20℃稳定保存18个月与其他几种猪病毒参考血清无交叉反应,与用重组蛋白抗原建立的rcELISA符合率为89.2%。对来自黑龙江、吉林、河北、上海、内蒙古、云南、江西等地猪场健康成年猪血清480份和发病猪血清424份进行了检测,抗体检出率分别为91.7%和79.2%,表明我国猪群中猪圆环病毒2型污染相当严重。该试剂盒的研制为我国PCV2流行病学调查和疫苗免疫效果的评价提供了技术手段。

猪繁殖与呼吸综合征病毒免疫过氧化物酶单层细胞检测方法的建立

【目的】建立一种可直观判断猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的检测方法。【方法】应用PRRSV多抗血清作为一抗,建立了PRRSV免疫过氧化物酶单层细胞检测体系,并对相关反应条件进行优化,对其特异性和敏感性进行检测。【结果】最佳病毒接种感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.1,最佳感染时间为24 h,一抗最佳稀释度为1∶1000,所建立的PRRSV免疫过氧化物酶单层细胞检测方法与其他几种流行猪病无交叉反应。对300份来自不同地区的临床血清进行检测,IPMA与PCR检测阳性符合率达93%。【结论】该方法具有良好的特异性和敏感性,为PRRSV的临床检测提供新方法。

猪瘟病毒免疫过氧化物酶单层细胞试验检测方法的建立

本研究旨在建立一种针对猪瘟病毒测定的免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)方法。通过优化一抗二抗的稀释倍数、细胞接毒时间、细胞固定条件等,建立能够测定猪瘟病毒的特异性方法。结果显示,建立的IPMA检测方法最优反应条件为接种CSFV,37℃、5%CO_(2)培养72 h后,用含0.3%H_(2)O_(2)的甲醇溶液固定10 min,5%BSA封闭处理,1:200倍稀释的高免血清作用2 h,以1:1000倍稀释羊抗兔HRP-IgG作为二抗作用1 h,AEC 37℃显色15 min。结论:成功建立能够快速对猪瘟病毒含量测定的方法,该方法特异性强、操作方便,可以在生产过程中对猪瘟病毒的产毒情况进行监测。

应用免疫过氧化物酶试验诊断猪PRRS

1995年波兰学者建立一种免疫过氧化物酶单层细胞试验,用于诊断猪生殖—呼吸综合症(即蓝耳病,PRRS)血清抗体,从可疑猪场采集42份猪血清样本,经该法检测结果有23份为PRRS抗体阳性,其中有10份抗体滴度】1:256;另对没有感染PRRS猪场采集的60份血样检测,结果全为阴性。证实该法是比较特异的。目前,波兰已将此法作为PRRS常规诊断方法应用。

补肾益髓胶囊调节实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠小胶质细胞的作用及其机制研究

目的探讨补肾益髓(Bushen Yisui,BSYS)胶囊对实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠小胶质细胞的调节作用及其机制。方法将80只C57BL/6小鼠随机分为正常组、模型组、醋酸泼尼松组和补肾益髓胶囊组。应用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG)35-55与完全弗氏式佐剂(complete Freund’s adjuvant,CFA)制成的抗原乳剂配合百日咳毒素(pertussis toxin,PTX)免疫小鼠,制备EAE模型,以醋酸泼尼松和补肾益髓胶囊灌胃给药,共40天。记录小鼠体重,分析其疾病负荷,分别在第23天(急性期)和第40天(缓解期)取小鼠脑和脊髓,透射电镜观察其病理变化,免疫组化检测小鼠脑及脊髓钙离子结合蛋白-1(ionized calcium-binding adapter molecule-1,Iba-1)和CD68表达水平;酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测小鼠脑白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)及IL-4水平;实时定量聚合酶链反应(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)测定小鼠脑及脊髓过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(peroxisome proliferators-activated receptors-γ,PPAR-γ)mRNA表达。结果与模型组相比,补肾益髓胶囊能够明显延长EAE小鼠的潜伏期(P<0.05),升高小鼠降低的体重(P<0.05),减轻其疾病负荷(P<0.05),减轻脑及脊髓髓鞘损伤(P<0.05或P<0.01);补肾益髓胶囊还能下调脑及脊髓Iba-1和CD68蛋白表达(P<0.05或P<0.01),减少IL-1β含量,并增加IL-4含量(P<0.05或P<0.01),显著上调PPAR-γmRNA表达(P<0.05)。结论补肾益髓胶囊对EAE小鼠有神经保护作用,其机制可能与其降低小胶质细胞过度激活,调节相关细胞因子及上调PPAR-γ信号通路有关。

苦参素对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的改善作用及机制

目的探讨苦参素能否通过调控铁死亡途径发挥对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠的改善作用。方法将30只雌性C57BL/6小鼠随机分为正常组、模型组、苦参素组,每组10只。模型组和苦参素组小鼠以含灭活结核分枝杆菌和MOG35-55的抗原乳剂诱导复制EAE模型。苦参素组小鼠自免疫后第7天开始腹腔注射苦参素注射液(50 mg/kg),正常组和模型组小鼠腹腔注射等体积生理盐水,每天1次至免疫后第18天。记录各组小鼠的神经功能学评分,以苏木精-伊红染色法和勒克斯光蓝染色法分别观察脊髓组织炎症细胞浸润和髓鞘脱失情况,以定量逆转录聚合酶链反应法和Western blot法分别检测其转铁蛋白受体1(TFR1)、核受体共激活因子4(NCOA4)、膜铁转运辅助蛋白(Heph)m RNA和胱氨酸-谷氨酸反向转运体(xCT)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPx4)蛋白的表达情况。结果与正常组比较,模型组小鼠的累计神经功能学评分显著升高(P<0.01),脊髓组织内炎症细胞浸润和髓鞘脱失现象明显,相关评分均显著升高(P<0.01),髓鞘组织中TFR1、NCOA4 mRNA的表达均显著上调,Heph mRNA和xCT、GPx4蛋白的表达均显著下调(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,苦参素组小鼠上述指标均显著改善(P<0.05或P<0.01)。结论苦参素对EAE小鼠有一定的改善作用,且这种作用可能与调节铁死亡中的铁代谢途径和xCT/GPx4通路有关。

免疫过氧化物酶单层细胞试验检测猪圆环病毒2型方法的建立

猪圆环病毒（Porcinecircovirus，PCV）是目前发现的最小的动物病毒，属圆环病毒科、圆环病毒属病毒。根据PCV的致病性、抗原性和核苷酸的序列差异将它分为猪圆环病毒1型（PCV-1）和猪圆环病毒2型（PCV-2）2个血清型。以前的研究认为，PCV-1对猪没有致病性，PCV-2对猪有致病性，但两者都不引起细胞病变。但近年来从死产的仔猪分离到该病毒，表明可能并非如此。

兽医实验室酶联免疫吸附试验操作要点

1样品的基本知识主要介绍样品采集、处理以及保存的知识,ELISA测定样品很多,如血清、尿液、唾液、排泄物等。部分样品可直接开展ELISA检测,比如血清;而部分样品则需要经过预处理,比如粪便。兽医实验室一般根据常规方式采集样品,禽类采心脏、翅静脉血的方式;猪采前腔静脉等处血;羊采颈静脉血;牛采颈静脉、尾静脉血。将血清分离时,避免出现溶血°现阶段,ELISA试剂盒多数使用的辣根过氧化物酶作为标记,红细胞溶解就会释放出较多的过氧化酶活性物质,在ELISA检测中,溶血会造成非特异性显色,导致假阳性,最后很难得到精确的检测结果。

灵芝水煎剂对老年大鼠NO、GSH-PX、LIP以及免疫功能影响的实验研究

目的 :本实验探讨灵芝水煎剂抗衰老作用的研究。测定老年大鼠胸腺组织中一氧化氮 (NO)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH -PX)、脂褐质 (LIP)含量变化 ,观察单核细胞吞噬功能的变化。方法 :采用考马斯亮兰法测定胸腺组织中蛋白含量 ,应用化学比色法测定组织中NO、GSH -PX、LIP含量 ,采用碳粒廓清法测定单核细胞的吞噬指数。结果 :灵芝水煎剂能调节胸腺组织中NO的含量 ,使GSH -PX的含量增高 ,LIP的含量降低 ,并能提高单核巨噬系统的吞噬指数。结论 :灵芝水煎剂能起到抗氧化作用 。

乙肝Ⅱ号治疗慢性乙型肝炎临床与实验研究

目的:观察乙肝Ⅱ号治疗慢性乙型肝炎的临床疗效,并探讨其作用机理。方法:采用乙肝Ⅱ号治疗慢性乙型肝炎60例,并与乙肝宁颗粒剂组26例作对照,同时进行实验研究,观察乙肝Ⅱ号对实验性肝损伤及免疫性肝损伤小鼠抗氧化功能的影响。结果:临床治疗组治疗后症状积分及血清ALT、AST、TBIL有明显改善(P<0.05),HBeAg阴转率达41.7%,HBV-DNA阴转率达35%,均优于对照组(P<0.05);实验研究表明,乙肝Ⅱ号防治组与模型组相比,肝损伤明显减轻,血清(肝匀浆)MDA含量下降,SOD活力上升,GSH-PX活力上升,变化程度与用药量呈明显的量效关系,且抗自由基的作用优于乙肝宁颗粒剂组。结论:乙肝Ⅱ号对慢性乙型肝炎患者有明显疗效,其机理可能与抑制过氧化反应有关。

小鹅瘟的实验室诊断技术

鹅细小病毒(Goose Parvovirus,GPV)主要引起4～20日龄雏鹅和雏番鸭的高致死性疾病,称为小鹅瘟或Derzsy′s病.本病以消化道,尤其是小肠部位典型纤维素性栓塞病变为特征,发病率和死亡率可达70%～100%,是危害养鹅业的主要疾病之.早在1956年,我国学者方定一教授首先发现了此病,认为其病原是鹅细小病毒,并将该病命名为小鹅瘟(gosling plague,GP).

鸡传染性支气管炎实验室诊断方法研究进展

鸡传染性支气管炎（IB）是由冠状病毒科、冠状病毒属的鸡传染性支气管炎病毒（IBV）引起的一种急性、高度接触性传染病。20世纪30年代在美国爆发以来，现在已经成为全球流行的主要禽病。鉴于IB的广泛流行．国内外不少学者都致力于对IB的快速诊断的研究上．先后建立了电镜技术、病毒分离、琼脂扩散、免疫荧光、免疫过氧化物酶、病毒中和、ELISA。

一例猪伪狂犬病野毒感染的实验室诊断

为确诊衡阳市某猪场育肥猪发生的疑似猪伪狂犬病(PR)疫情,采集发病猪脾脏,运用PCR方法进行猪伪狂犬病病毒(PRV)核酸检测,利用非洲绿猴肾细胞(Vero)进行病毒分离培养,采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)进行病毒血清学鉴定;用分离培养物进行家兔感染试验,观察临床症状和病例剖检变化,采用PCR检测各器官中的病毒分布情况。结果显示:病料接种Vero细胞培养3 d后,出现明显的细胞病变效应(CPE);分离培养的病毒与PRV阳性血清呈阳性反应;家兔感染后出现奇痒等神经症状并死亡,其肝、脾组织均为PRV gE核酸检测阳性。试验结果证实,分离到的病毒为PRV野毒,从而确诊了该疑似疫情。

免疫学检验

9939564 甲状腺球蛋白抗体。

草鱼呼肠孤病毒HZ08株抗体IPMA检测方法的建立及应用

为建立一种检测草鱼呼肠孤病毒HZ08株(HZ08)抗体的免疫学方法,本实验以接种HZ08病毒的细胞培养板为抗原板,以免疫弱毒疫苗的草鱼血清为抗体,通过反应条件优化,建立了检测GCRV HZ08血清抗体的免疫过氧化物酶单层细胞实验(IPMA)方法,并对该方法特异性、敏感性、重复性、与ELISA检测结果的符合率及对临床血清样品的检测效果等进行了验证。结果显示,HZ08株种毒按照1×103拷贝/μL浓度接种后72h固定,HRP-Ig G二抗1∶1000稀释,待检血清1∶100稀释时效果最佳;该IPMA方法与草鱼阴性血清、免疫细菌三联疫苗的草鱼血清、感染GCRV JX0901(GCRVⅠ型)的草鱼血清无交叉反应;GCRV HZ08株阳性血清稀释至1∶800时仍能检出;批内和批间重复性实验显示,该方法具有良好的重复性;符合性实验结果显示,该IPMA方法与ELSIA方法的阳性和阴性符合率分别为95.7%和87.5%;用建立的IPMA方法检测草鱼出血病弱毒疫苗免疫草鱼,免疫2周后抗体水平达到峰值;对现地送检的126份草鱼血清样本进行检测,平均检出阳性率为72.2%。研究表明,建立的HZ08株IPMA方法特异性强、重复性好、敏感性高,为GCRVⅡ型的流行病学调查、疫苗免疫效果评价及抗原抗体检测提供了一种有效的检测手段。

PRRSV-IPMA抗体检测试剂盒的研制及其应用

建立了一种检测猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）血清抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验法（IPMA），并组装成PRRSV-IPMA抗体检测试剂盒。对该试剂盒的敏感性、特异性、重复性及保存期等进行了试验，并与国外IDEXX ELISA试剂盒进行了比较。结果显示，用该试剂盒检测PRRSV人工接种猪血清样品，第1周抗体阳性检出率为50％，从第2周起抗体阳性检出率均为100％，而对照组猪血清抗体检测均为阴性。该试剂盒重复性好，-20℃保存18个月稳定，与其他病毒参考血清无交叉反应，与国外IDEXX ELISA试剂盒的符合率为83．3%。用该试剂盒对采自黑龙江、吉林、辽宁、河北、上海等地13个猪场的520份正常猪血清样品进行了抗体检测，结果，4个猪场阳性率高达90％以上，仅有2个猪场为阴性，其余猪场阳性率为10％～57%。

猪圆环病毒1型抗体IPMA检测方法的建立及应用

建立了一种用于检测猪圆环病毒1型(PCV1)血清抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)方法。对该方法的反应条件、特异性、敏感性及重复性等进行了系统试验,并与用昆虫杆状病毒表达的PCV1-Cap重组蛋白抗原建立的间接ELISA的检测结果进行了比较。结果显示,用IPMA法对已知PCV1和猪圆环病毒2型(PCV2)参考阳性血清进行检测,血清稀释度≥1∶100即可消除2种病毒间的低水平交叉反应,与其他几种猪病毒参考阳性血清无交叉反应;与用昆虫杆状病毒表达的PCV1-Cap重组蛋白抗原建立的间接ELISA的检测符合率为88.9%。用该方法对黑龙江省、吉林省、河北省、上海市、辽宁省等地猪场送检的257份血清样品进行检测,PCV1和PCV2血清抗体阳性检出率分别为19.1%和80.5%,PCV1抗体阳性猪中有95.9%为PCV2阳性,表明我国猪群已存在PCV1感染,在临床上PCV1与PCV2多以混合感染形式存在。建立的PCV1-IPMA方法具有操作简便、特异和敏感等特点,不失为PCV1流行病学调查及血清抗体检测的有效技术手段。

PRV-IPMA抗体检测试剂盒的研制及其应用

本研究建立了一种免疫过氧化物酶单层细胞试验法(IPMA),用于猪伪狂犬病病毒(PRV)血清抗体检测。通过对IPMA反应条件的优化,组装成PRV-IPMA诊断试剂盒,并对该试剂盒检测的敏感性、特异性、重复性及保存期等进行了试验。结果表明,IPMA检测相对于SN的敏感性为96.2%,特异性为97.7%,两者的总符合率为96.9%;该试剂盒检测的重复性好,与其它病毒参考血清无交叉反应;试剂盒可在-20℃保存12个月,用该试剂盒检测PRV人工感染猪血清,于感染后2周抗体全部阳转,健康对照组猪血清抗体检测均为阴性结果。对来自黑龙江、吉林、上海、内蒙古、河北等地采集的5个猪场后备母猪150份血清样本进行检测,PRV血清抗体阳性检出率为16.7%～50%。检测结果表明这些猪场后备猪群仍需加强疫苗免疫。该试剂盒的研制为我国PRV流行病学调查和疫苗免疫效果的评价提供了技术手段。

猪流感病毒NP蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备猪流感病毒(SIV)核蛋白(NP)的单克隆抗体(MAb),采用差速离心法纯化H1N1和H3N2亚型SIV后交叉免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,通过建立的免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)单克隆抗体检测方法进行筛选。获得3株能稳定分泌抗NP蛋白的杂交瘤细胞,分别命名为16D5、18G8和20C4,将它们诱导小鼠产生的腹水IPMA效价分别为1×10^-6、1×10^-6和1×10^-5。亚型鉴定结果显示,3株单克隆抗体的重链均为IgG1,轻链为κ链。3株单克隆抗体特异识别H1N1、H3N2、H5N1、H7N9和H9N2亚型流感病毒,并且与猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒无交叉反应。Westernblot检测结果表明,3株杂交瘤细胞培养上清均在56ku附近出现一条特异性的蛋白质条带,说明针对SIV的NP蛋白制备了3株单克隆抗体。综上,成功制备了针对SIVNP蛋白的3株单克隆抗体,可识别不同亚型的SIV。

鸡新城疫病毒中和单克隆抗体的制备及鉴定

采用差速离心法纯化鸡新城疫病毒(NDV)标准毒株F48E8,免疫Balb/c小鼠,应用杂交瘤细胞技术制备抗NDV单克隆抗体,旨在为NDV中和抗原表位分析奠定基础。将NDV感染BHK-21细胞,建立异源免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)的单克隆抗体检测方法,筛选获得14株分泌抗NDV单克隆抗体杂交瘤细胞株,其单克隆抗体腹水IPMA效价均在0.50×10-2~2.56×10-5(F48E8株和La Sota株)。血凝抑制试验(HI)结果表明,单克隆抗体1G6、2C1、4D2、5F2和13A5具有血凝抑制活性,其HI效价在(6~12)log2(F48E8株)和(9~11)log2(La Sota株)。病毒中和试验结果表明,单克隆抗体5F2和13A5对F48E8株和La Sota株均有明显的病毒中和活性,中和效价分别为1∶400~1∶800和1∶25。夹心ELISA结果表明,单克隆抗体5F2识别NDV HN蛋白,13A5识别F蛋白。综上,成功制备了具有中和活性的NDV单克隆抗体(5F2和13A5)。