猪圆环病毒2型免疫过氧化物酶单层细胞试验抗体检测试剂盒的研制及应用

本研究建立了一种免疫过氧化物酶单层细胞试验(Immunoperoxidase monolayer assay,IPMA),用于猪圆环病毒2型血清抗体检测,通过对IPMA反应条件的优化,组装了诊断试剂盒。研究结果表明,用IPMA检测猪圆环病毒2型人工感染猪血清,于感染后3周抗体阳转,第3周～10周抗体阳性检出率为92.8%(52/56),对照组猪血清抗体检测均为阴性(33/33)。试剂盒在-20℃稳定保存18个月与其他几种猪病毒参考血清无交叉反应,与用重组蛋白抗原建立的rcELISA符合率为89.2%。对来自黑龙江、吉林、河北、上海、内蒙古、云南、江西等地猪场健康成年猪血清480份和发病猪血清424份进行了检测,抗体检出率分别为91.7%和79.2%,表明我国猪群中猪圆环病毒2型污染相当严重。该试剂盒的研制为我国PCV2流行病学调查和疫苗免疫效果的评价提供了技术手段。

免疫过氧化物酶单层细胞试验检测猪圆环病毒2型方法的建立

猪圆环病毒（Porcinecircovirus，PCV）是目前发现的最小的动物病毒，属圆环病毒科、圆环病毒属病毒。根据PCV的致病性、抗原性和核苷酸的序列差异将它分为猪圆环病毒1型（PCV-1）和猪圆环病毒2型（PCV-2）2个血清型。以前的研究认为，PCV-1对猪没有致病性，PCV-2对猪有致病性，但两者都不引起细胞病变。但近年来从死产的仔猪分离到该病毒，表明可能并非如此。

猪繁殖与呼吸综合征病毒免疫过氧化物酶单层细胞检测方法的建立

【目的】建立一种可直观判断猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的检测方法。【方法】应用PRRSV多抗血清作为一抗,建立了PRRSV免疫过氧化物酶单层细胞检测体系,并对相关反应条件进行优化,对其特异性和敏感性进行检测。【结果】最佳病毒接种感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.1,最佳感染时间为24 h,一抗最佳稀释度为1∶1000,所建立的PRRSV免疫过氧化物酶单层细胞检测方法与其他几种流行猪病无交叉反应。对300份来自不同地区的临床血清进行检测,IPMA与PCR检测阳性符合率达93%。【结论】该方法具有良好的特异性和敏感性,为PRRSV的临床检测提供新方法。

免疫过氧化物酶单层细胞试验检测猪圆环病毒Ⅱ型抗体方法的建立

猪圆环病毒病（PCVD）是由猪圆环病毒Ⅱ型（PCV-2）引起的猪传染性疫病，是继猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）之后新发现的又一重要疫病，临床主要表现为生长迟缓、进行性消瘦、呼吸困难、黄疸、腹泻、皮炎、繁殖障碍、震颤等。自1997年Clark等人首次分离到PCV-2以来，该病已给全世界养猪业造成巨大的经济损失，我国为养猪大国，PCV-2感染也相当严重，全国各大小猪场均存在PCV一2感染的报道。

猪瘟病毒免疫过氧化物酶单层细胞试验检测方法的建立

本研究旨在建立一种针对猪瘟病毒测定的免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)方法。通过优化一抗二抗的稀释倍数、细胞接毒时间、细胞固定条件等,建立能够测定猪瘟病毒的特异性方法。结果显示,建立的IPMA检测方法最优反应条件为接种CSFV,37℃、5%CO_(2)培养72 h后,用含0.3%H_(2)O_(2)的甲醇溶液固定10 min,5%BSA封闭处理,1:200倍稀释的高免血清作用2 h,以1:1000倍稀释羊抗兔HRP-IgG作为二抗作用1 h,AEC 37℃显色15 min。结论:成功建立能够快速对猪瘟病毒含量测定的方法,该方法特异性强、操作方便,可以在生产过程中对猪瘟病毒的产毒情况进行监测。

犬恶丝虫硫氧还蛋白过氧化物酶真核表达质粒的构建及初步免疫试验

为评价犬恶丝虫硫氧还蛋白过氧化物酶（TPx）真核表达质粒的免疫原性，本实验利用RT—PCR方法扩增TPx基因，将其克隆于真核表达载体pvAxloe构建重组质粒pVAXI—TPx，并对其进行体外表达鉴定及通过特异性抗体水平及相关的免疫因子的检测，评价其在体内诱导的免疫反应。

应用免疫过氧化物酶试验诊断猪PRRS

1995年波兰学者建立一种免疫过氧化物酶单层细胞试验,用于诊断猪生殖—呼吸综合症(即蓝耳病,PRRS)血清抗体,从可疑猪场采集42份猪血清样本,经该法检测结果有23份为PRRS抗体阳性,其中有10份抗体滴度】1:256;另对没有感染PRRS猪场采集的60份血样检测,结果全为阴性。证实该法是比较特异的。目前,波兰已将此法作为PRRS常规诊断方法应用。

用间接免疫过氧化物酶试验检测鸡呼肠孤病毒

最近,美国阿拉巴马州农业试验站和Auburn大学兽医学院的研究人员研制生产出抗禽呼肠孤病毒株S1133的单克隆抗体（MAb）,并用于诊断试验。使用MAb的间接免疫过氧化物酶（IP）试验,在检测福尔马林固定。

B．ovis死菌制剂苗接种后的过氧化物酶试验检查

本文报告了死菌制剂佐剂苗免疫后的过氧化物酶（Ｐｏｘ）检查试验，结果显示免疫组在注苗后３０天、７５天、１６５天Ｐｏｘ染色阳性率分别是９２％、９６％、１００％，积分是２８９、３１７、３３７。感染对照组是２５％、２５％、３３％，积分是３８、３１．４、３３．３。免疫攻毒组分别是８０％、８５％，积分为２３０、２４０。这两个试验组和对照组存在着非常显著差异（Ｐ＜０．０１）。作者认为Ｐｏｘ试验可能是一个有用的免疫学指标，在反映抗体对Ｂｒ．ｏｖｉｓ的免疫状态方面可加以利用。

血清抗甲状腺过氧化物酶抗体ELISA定量方法的建立

目的建立一种ELISA方法用于定量分析血清抗甲状腺过氧化物酶(TPO)抗体(TPOAb)。方法用生物素化牛血清清蛋白(BSA)和链霉亲合素包被微孔板,同时加入生物素化TPO抗原和待检血清,再加入酶标记抗人IgG,建立间接包被模式酶联免疫法测定抗TPO抗体。经方阵滴定确定生物素化抗原和酶标抗体的最适浓度,优化反应条件,并进行方法学评价。结果本法抗原包被量为0.083μg/mL,检测灵敏度为0.165 IU/mL;高、低浓度混合血清批间变异系数(CV)为9.2%、9.0%,批内CV为4.6%、5.6%;回收率为96.0%～104.0%;包被板37℃放置5 d保持稳定;与抗甲状腺球蛋白抗体(TGAb)交叉反应率为0.22%。经检测120例健康人,将参考值定为<65.7 IU/mL。与Abbott公司试剂盒检测结果的相关系数(r)为0.985(P<0.01)。结论间接包被模式适合TPOAb测定,包被抗原用量少,方法灵敏度高,特异性强;操作简单,成本较低,适合基层医院。

酶联免疫吸附试验检测血清抗中性粒细胞胞质抗体方法的建立与临床应用

目的建立总抗原酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)的方法,初步探讨其在ANCA相关血管炎中的表达及临床应用价值。方法从人的中性粒细胞中提取总抗原,用棋盘滴定法选择ELISA测定的最佳条件,确定临界值。测定系统性红斑狼疮(SLE)、肾病、血管炎、类风湿关节炎(RA)等患者血清总ANCA,并与间接免疫荧光(IIF)法、特异性髓过氧化物酶(MPO)-ANCA及蛋白酶3(PR3)-ANCA进行分析比较。结果总抗原ELISA与IIF法检测肾病、SLE、血管炎及RA患者血清ANCA阳性率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。抗原特异性ELISA、IIF法检测肾病、血管炎、RA患者血清ANCA阳性率比较差异均无统计学意义(P>0.05),而SLE差异有统计学意义(P<0.05)。结论ELISA检测ANCA可行且具有广泛的推广应用前景。

辣根过氧化物酶标记兔抗丝状噬菌体衣壳蛋白抗体的制备与初步应用

为了制备用于噬菌体展示肽库的筛选及鉴定等环节的辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗丝状噬菌体(M13)衣壳蛋白抗体,试验制备了兔源的M13KE多克隆抗体,将多克隆抗体经饱和硫酸铵法和Protein G Resin层析柱纯化后运用过碘酸钠法对其进行辣根过氧化物酶标记,对标记前和标记后纯化产物进行活性测定,同时对标记后产物进行Western-blot鉴定,以及将其应用到验证已知的阳性噬菌体H11、H12、H14、H16、H18中。结果表明:兔抗M13KE多克隆抗体效价高于1∶32 000,标记后活性高于1∶4 000,标记抗体与已知阳性噬菌体的ELISA鉴定结果与前期测序结果一致。说明此酶标抗体有一定的应用价值。

髓过氧化物酶双抗体夹心光激化学发光检测法的建立

目的建立一种定量检测血浆中髓过氧化物酶(MPO)浓度的双抗体夹心光激化学发光检测法(LiCA),用于心血管疾病的辅助诊断。方法采用棋盘格滴定法,从针对MPO抗原的12株单克隆抗体(McAb)中筛选出最佳双抗体组合(1株McAb包被发光微粒,另1株McAb进行生物素化),进而探索2种抗体最适反应浓度及MPO LiCA的最适反应条件,评价该法的重复性、敏感性、抗干扰性及回收率,并与经典的CardioMPOTM酶联免疫吸附试验(ELISA)进行平行比较分析。结果筛选到2株最适McAb,并与链霉亲和素包被的感光微粒连接,建立用于MPO定量测定的LiCA。该法敏感性为1.76 ng/mL,批内变异系数(CV)和天间CV分别为2.73%、3.76%,平均回收率为102.5%±8.6%,与CardioMPOTMELISA具有良好的相关性(r=0.961,P<0.01),正常参考范围为13.16～128.79 ng/mL。结论成功建立了一种用于MPO定量检测的LiCA,该法具有高的敏感性和好的稳定性,试剂有效期长,并且操作流程简便,耗时短,在心血管疾病的辅助诊断中具有很好的应用前景。

间接酶联免疫吸附试验显色系统主要影响因素的探讨

酶联免疫吸附试验(ELISA)易受多种因素影响,其中包括显色系统。本文就ELISA常用的四甲基联苯胺(TMB)显色系统的成份、含量及反应条件对ELISA显色状态的影响进行了探讨,制订了一种通用的调整包括pH值、底物成份及含量、反应时间等在内的显色系统参量的方法,应用该方法为确定适用于任一特定ELISA的显色系统以及建立稳定的ELISA体系奠定了基础。

酶联免疫吸附试验竞争法检测HBeAg的探讨

目的研究酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清标本与辣根过氧化物酶(HRP)标记的乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb-HRP),加入间隔时间对HBeAg检测结果的影响。方法选择乙型肝炎病毒(HBV)标志物检测结果为阴性的标本分为甲、乙两组,甲组:加样后延长室温放置时间再加入HBeAb-HRP;乙组:加样同时加入HBeAb-HRP,延长室温放置时间。结果甲组加样方式对HBeAg检测结果影响明显,且加样和加入HBeAb-HRP的间隔时间越长,标本的假阳性越多;乙组加样方式对HBeAg检测结果基本无影响。结论甲组的不公平竞争在不同时间内可出现程度不等的HBeAg假阳性;乙组加样方式可最大限度地减少HBeAg假阳性,以确保检测结果的准确性。

夹心酶联免疫吸附试验检测人表皮生长因子的方法建立及其应用研究

目的:建立临床适用的表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)酶联免疫检测方法,探讨EGF在临床常见肿瘤患者血清中的含量变化规律。方法:采用EGF单抗包被酶标板,兔抗EGF多抗为二抗,以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG作为酶标抗体建立夹心法ELISA检测临床常见肿瘤患者及健康体检人群的血清EGF含量。结果:建立的EGF酶联免疫吸附法最小检测限达15.6ng/L,批内精密度为8.7%,批间精密度为11.6%,平均回收率为94.7%,符合临床检测要求。血清EGF含量在31名正常人为(1.305±0.382)ng/mL,24名乳腺癌病人术前值为(0.729±0.347)ng/mL,术后为(0.711±0.332)ng/mL,17名结直肠癌病人术前为(0.678±0.311)ng/mL,术后为(0.658±0.298)ng/mL,19名胃癌病人术前为(0.598±0.224)ng/mL,术后为(0.614±0.257)ng/mL。各肿瘤组患者血清EGF水平较健康对照组明显降低(P<0.01)。结论:建立了适用于临床检测的EGF酶联免疫检测方法,肿瘤患者血清中EGF含量较健康对照组明显下降,该检测方法的建立为进一步探讨肿瘤的发病机制提供了有效的手段。

间接酶联免疫吸附试验检测血清抗凝血酶原抗体

目的建立人抗凝血酶原抗体IgG、IgM的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法。方法纯化人凝血酶原浓度10μg/ml包被于高吸附活性的聚氯乙烯微孔中,用山羊血清封闭,血清在Tirs盐酸缓冲生理盐水并含有1%牛血清清蛋白的溶液中按1:100稀释,第2抗体为辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG或IgM,稀释度为1:10 000,以四甲基联苯胺为底物,1mmol/L HCl为终止液建立的ELISA反应体系检测血清中的抗凝血酶原抗体(aPT)-IgG与IgM。结果本实验建立检测血清中aPT-IgG、IgM的ELISA法,稳定性、特异性及重复性佳,与国外商品试剂盒有很好的相关性,有较好的准确度及精密度。结论本实验应用的间接ELISA半定量检测aPT,适合于实验研究及临床应用。

兽医实验室酶联免疫吸附试验操作要点

1样品的基本知识主要介绍样品采集、处理以及保存的知识,ELISA测定样品很多,如血清、尿液、唾液、排泄物等。部分样品可直接开展ELISA检测,比如血清;而部分样品则需要经过预处理,比如粪便。兽医实验室一般根据常规方式采集样品,禽类采心脏、翅静脉血的方式;猪采前腔静脉等处血;羊采颈静脉血;牛采颈静脉、尾静脉血。将血清分离时,避免出现溶血°现阶段,ELISA试剂盒多数使用的辣根过氧化物酶作为标记,红细胞溶解就会释放出较多的过氧化酶活性物质,在ELISA检测中,溶血会造成非特异性显色,导致假阳性,最后很难得到精确的检测结果。