多头带绦虫dUTPase基因的原核表达、组织定位及酶学活性分析

探讨多头带绦虫脱氧尿苷三磷酸酶(Tm-dUTPase)的基因特征,并初步分析Tm-dUTPase的酶学活性。通过原核表达,得到重组Tm-dUTPase蛋白,并对其进行Western blot分析、免疫荧光定位及酶学活性分析。序列分析结果显示,Tm-dUTPase基因ORF框为447bp,编码148个氨基酸,预测的蛋白质分子大小为16.39ku,等电点为6.263;与猪囊尾蚴和豆状囊尾蚴dUTPase基因的氨基酸序列相似性分别为97%和91%。原核表达的TmdUTPase为可溶性蛋白,纯化后的蛋白质质量浓度为0.907mg·mL^(-1),Western blot分析显示,该蛋白质能够被山羊脑多头蚴阳性血清所识别,具有较强的反应原性。免疫荧光定位显示Tm-dUTPase主要分布于多头带绦虫成虫的体内实质区,同时广泛分布于多头带绦虫幼虫(脑多头蚴)的头节和包囊囊壁外层。酶学活性试验测得重组Tm-dUTPase的比活力为986.29U·mg^(-1),EDTA能够抑制Tm-dUTPase活性,而金属离子Mg^(2+)、Zn^(2+)、Cu^(2+)能够增强Tm-dUTPase活性。上述结果为进一步研究Tm-dUTPase基因的生物学功能奠定了基础。

滑液支原体NADH氧化酶的酶学活性及亚细胞定位研究

【背景】许多研究表明,支原体的NADH氧化酶(NADH oxidase,NOX)不仅在胞浆中发挥生物酶学功能,也存在于细胞膜上发挥黏附宿主细胞功能。【目的】对滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)的NOX进行酶学活性及亚细胞定位研究,分析其在MS致病过程中的潜在作用。【方法】对MS的NOX蛋白进行原核表达、纯化,然后对重组MSNOX(rMSNOX)的酶学活性及影响酶活的条件进行研究,测定其酶比活力、米氏常数及最大反应速率,接着用MS阳性血清及制备的rMSNOX兔多克隆抗体,分别与rMSNOX蛋白及MS全菌、膜蛋白和胞浆蛋白进行Western blotting反应,鉴定rMSNOX的免疫原性及其在MS中的分布情况。【结果】在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达rMSNOX蛋白,相对分子质量约为53 kD,并获得纯化的rMSNOX蛋白;酶活测定显示rMSNOX蛋白的酶比活力为14.17 IU/mg,最适酶促温度为37℃,最适pH为7.5,双倒数法求得rMSNOX的最大反应速率Vmax为21.8μmol/(L·min),米氏常数Km(NADH)为244.0μmol/L;rMSNOX蛋白与MS阳性血清特异性结合,证明具有良好的免疫原性;亚细胞定位研究表明NOX蛋白主要存在于MS的胞浆中,细胞膜上有少量的分布。【结论】首次证实MS的NOX不仅具有NADH氧化酶活性,也是MS具有免疫原性的膜蛋白,为进一步探索NOX在MS致病过程中的作用提供了分子基础。

烟草花发育过程中花药和花粉IAA分布规律的研究

以烟草(Nicotiana tabacumL.)花药为材料,通过4,’6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色详细观察花粉发育过程,获得了花药发育时期与花蕾大小的对应关系;通过吲哚乙酸(IAA)单克隆抗体、免疫组织化学技术以及DR5∶∶GUS转基因植株的GUS活性对花药和花粉发育过程中生长素的分布规律进行了研究。免疫酶标记结果表明,在不同的花药发育时期IAA水平呈现出明显的差别。小孢子母细胞时期,IAA在整个花药中均有分布,并且在小孢子母细胞发育晚期,IAA信号集中在小孢子母细胞的细胞核中;随着小孢子母细胞减数分裂后形成四分体,IAA信号逐渐减弱,四分体中几乎没有信号;单核花粉期的花药中IAA信号进一步减弱,仅存在于花药壁中;待小孢子继续发育为成熟二核期时,花粉和整个花药组织中均出现较强的IAA信号。GUS活性检测结果表明,烟草DR5∶∶GUS转基因植株中花药和花粉粒的GUS信号与IAA免疫酶定位结果基本一致。总的来说,IAA在烟草花药和花粉中的积累呈现出由强到弱、再由弱到强的分布规律,暗示IAA在被子植物花药和花粉发育过程中可能起着较为重要的作用。