霍乱肠毒素B亚单位在转基因番茄果实中特异性表达及其免疫原性的研究

利用番茄果实特异性启动子-E8启动子,将霍乱肠毒素B亚单位基因(ctb)用根癌农杆菌浸润法转入番茄植株,并使其在果实中特异表达,然后对试验小鼠进行口服免疫,研究转基因番茄果实的免疫原性。结果表明,ctb基因在14株番茄植物基因组中被证实有整合,并在其中2株的番茄果实中有特异性表达,最高表达量分别为455和385 ng·g-1FW,口服免疫后的小鼠血液和肠道粘膜中均检测到抗CTB抗体。表明获得了在番茄果实中特异、高效表达霍乱肠毒素B亚单位基因(ctb)的植物口服疫苗候选植株。

霍乱毒素B亚单位和旋毛虫幼虫抗原诱导黏膜免疫结果分析

目的探讨黏膜佐剂霍乱毒素B 亚单位（CT-B ）在激发旋毛虫感染的黏膜免疫中的作用。方法24只NI H 小鼠随机分为4 组，每组6 只。CT-B 免疫组：每只小鼠于0 、7 、14 d 用含幼虫抗原100 μg 、C T-B 10 μg 的免疫原200 μl 经口灌服；正常对照组；免疫后感染组：免疫方法同CT-B 免疫组，末次免疫后第7 天，每只小鼠用200 条旋毛虫进行感染；单纯感染组：不免疫，与免疫后感染组同时进行感染。CT 蛳B 免疫组与正常对照组在免疫后第7 天、免疫后感染组与单纯感染组在感染后第7 天分别取血检测Ig A 、Ig G 1 、Ig G 2 b ，刮取肠黏液检测sIgA ，检测肠道成虫数，并收集每鼠雌虫，在体外检查其生殖力。结果与单纯感染组相比，CT-B 免疫后感染组肠道成虫数明显减少，雌虫生殖力明显降低，成虫与新生幼虫减虫率分别为88.2%和72.4%。CT-B 免疫组小鼠肠黏液sIg A 、血清Ig A 较对照组小鼠明显提高(0 .2 9 ±0 .04 vs 0.09 ±0.02，0.21 ±0.06 vs 0.08 ±0.01，P <0.001)；而两组Ig G 1 和Ig G 2 b 水平无显著性差异(P>0.05)。CT-B 免疫后感染组小鼠肠黏液sIg A 、血清Ig A 较单纯感染组小鼠相比有显著性差异(0 .5 5 ±0 .28 vs0.08 ±0.15，0.33 ±0.06 vs 0.10 ±0.10，P <0.001)。

大肠杆菌热稳定肠毒素与霍乱毒素B亚单位融合蛋白免疫原性的评价

构建了霍乱毒素B亚单位CTB和大肠杆菌热稳定肠毒素ST的重组表达载体pMCST1、pMCST2。二者的不同是,前者为单拷贝ST,后者为双拷贝ST。在大肠杆菌DH5α中融合蛋白高效表达。用这两种重组蛋白分别免疫小鼠,都诱导产生了高滴度的抗CTB和抗ST的血清。表明这两组融合蛋白具有良好的CTB和ST的免疫原性,为进一步构建抗CTB和抗ST的产毒性细菌腹泻疫苗打下了基础。

烟草生产霍乱毒素B亚单位疫苗的免疫分析

用纯化的CTB后腿肌肉注射免疫小鼠 ,每次 12 .5 μg ,每隔 14天加强一次 ,共注射三次 ,末次免疫后两周收集血清 ,免疫小鼠诱导产生了特异性抗CTB抗体。在CHO细胞中 ,免疫小鼠血清能够中和CT的细胞病变效应 ;小鼠肠结扎实验表明 ,抗CTB血清能够抑制CT结合细胞表面受体GM1神经节苷脂。

霍乱毒素B亚单位免疫佐剂的研究进展

简要介绍了霍乱毒素B亚单位 (CTB)佐剂的作用方式、免疫途径及CTB—融合蛋白的免疫原性 ,大量实验证据表明 ,CTB是一种具有良好应用前景的粘膜免疫佐剂 .

霍乱毒素B亚单位免疫佐剂的研究进展

研究表明霍乱毒素B亚单位 (CTB)是一种良好的蛋白抗原载体 ,具有较强的免疫佐剂活性。本文对纯化CTB、重组CTB和CTB与特异性抗原融合蛋白中的CTB的佐剂活性的研究进展以及不同的CTB使用剂量、使用方式和不同免疫途径对其佐剂活性的影响进行了综述 。

霍乱毒素B亚单位与p277融合基因在大肠杆菌中表达及免疫分析

为了增强多肽表位的免疫原性,构建了霍乱毒素B亚单位(Cholera toxin B subunit,CTB)和p277的融合基因CTB-p277,将该融合基因克隆到pET28a(+)中,获得原核表达载体pET28a-CTB-p277;并将该质粒转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中;重组菌株经2%的乳糖诱导5 h后的表达产物用12%的SDS-PAGE分析表明可以表达融合蛋白,融合蛋白占全菌蛋白约40%,且主要以包含体的形式存在。包含体经洗涤、裂解,用DEAE纤维素离子交换纯化,可以获得99.1%的重组蛋白。重组蛋白的包含体经复性后,在体外可以自组装成五聚体。重组蛋白免疫KK-Ay小鼠后,ELISA的分析表明可以产生抗p277的抗体。血糖和体重的测定结果显示,给药组小鼠的血糖有明显的降低,体重也有相应的减轻。同时GM1-ELISA的检测表明,CTB-p277在体外可以和神经节苷脂GM1(Monosialoganglioside)特异结合,具有生物活性。

霍乱毒素B亚单位对小鼠免疫细胞及细胞因子的影响

目的探讨侧脑室注射霍乱毒素B亚单位(CTB)对小鼠免疫细胞及细胞因子的影响。方法 C57雌性小鼠侧脑室注射CTB,运用流式细胞术检测外周血免疫细胞亚群变化;流式微球捕获芯片技术(CBA)检测血清中细胞因子及趋化因子的变化。结果 CTB能够明显升高单核巨噬细胞、CD4^+T细胞及B细胞的比例;炎症因子γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-9(IL-9)及趋化因子巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)、巨噬细胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)、B淋巴细胞趋化因子(BLC)、γ干扰素诱导的单核因子(Mig)、调节活化正常T细胞表达与分泌的趋化因子(RANTES)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)也相应升高。结论侧脑室注射CTB能够明显改变小鼠免疫应答状态。

与霍乱毒素B亚单位结合的重组人AChR片断经鼻腔治疗实验性自身免疫性重症肌无力

目的探讨与霍乱毒素B亚单位结合的重组人AChRα亚单位片断(CTB-Hα1-205)治疗实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)的有效性和基本作用机制。方法将用AChR诱导的Lewis EAMG鼠随机分为3组:CTB-Hα1-205治疗组、Hα1-205组和CTB-HGG对照组,在诱导EAMG后第14天分别按上述3组从鼻腔滴入CTB-Hα1-205、Hα1-205和CTB-HGG。对各组进行临床分数评估、测定鼠血清中抗AChR特异抗体和淋巴细胞增殖反应。结果CTB-Hα1-205组和Hα1-205组平均临床分数均较对照组有明显减少,差异有统计学意义(均为P<0.01),同时CTB-Hα1-205组较Hα1-205组也有明显减少(P<0.05);与对照组比较,CTB-Hα1-205组和Ha1-205组血清中鼠抗AChR特异抗体IgG、IgG2a、IgG2b和IgG2c的产生均明显被抑制(P<0.01),CTB-Hα1-205治疗组的IgG、IgG2b和IgG2c较Hα1-205组低,且差异有统计学意义(P<0.05);另一方面,CTB-Hα1-205组和Hα1-205组的IgG1较对照组却有明显升高(P<0.05),同时,CTB-Hα1-205组和Hα1-205组对AChR特异性抗原的淋巴细胞增殖反应也被明显抑制(P<0.05)。结论CTB-Hα1-205比Hα1-205能更加有效治疗EAMG,其作用机制是抑制了自身抗体的产生、IgG亚型的转换和特异的淋巴细胞增殖反应。

霍乱肠毒素B亚单位在转基因番茄中表达的研究

将霍乱肠毒素 B亚单位 (CT-B)基因及内质网引导序列 (SEKDEL)克隆到质粒 p RTL2和 p BI1 2 1中 ,分别构建植物双元表达载体 p BI-CTB和 p BI-CTBK,CT-B基因由 Ca3 5 S启动子控制表达 .采用叶盘法经根癌农杆菌介导转化番茄 (金丰 1号 ,Jinfeng1 ) ,各表达载体得到一批转基因植株 .经 PCR和 Southern blot分析表明 CT-B基因整合到了番茄基因组中 ;ELISA和 Western blot分析表明 p BI-CTB和 p BI-CTBK的转基因植株能够有效表达 CT-B多肽 ,分别占番茄叶片可溶性蛋白的 0 .0 5 5 %和 0 .0 84% .

霍乱毒素B亚单位的研究进展

目的 介绍霍乱毒素B亚单位最新研究进展。方法 从霍乱毒素B亚单位的基因表达、作为载体蛋白与免疫佐剂的应用、与免疫原的不同使用方法和不同的免疫途径对其免疫佐剂作用的影响等方面进行介绍。结果 霍乱毒素B亚单位是有较好应用前景的载体蛋白 ,具有较强的佐剂活性 ,可以增强细菌、病毒以及其他抗原的免疫原性。

霍乱弧菌肠毒素B亚单位基因在大肠杆菌和双歧杆菌的表达

目的构建霍乱弧菌肠毒素B亚单位(Cholera toxin B subunit,CTB)基因的大肠杆菌表达重组质粒,并观察其在大肠杆菌和双歧杆菌中的表达。方法从pBI121质粒PCR扩增获得CTB基因片断,克隆到大肠杆菌载体pGEX-4T-1上,构建重组质粒,然后转化大肠杆菌DH5α和双歧杆菌。转化菌经IPTG诱导,然后用SDS-PAGE和Western blot方法鉴定表达的重组蛋白。结果构建了重组质粒pGEX-4T-CTB,CTB基因片段分子量约为376bp;在大肠杆菌中表达出35kD的霍乱弧菌B亚单位融合蛋白,经SDS-PAGE分析,相对分子量与文献相符,表达的蛋白约占细菌总蛋白的10%;在双岐杆菌中也能得到正确表达,表达量较大肠杆菌低,占细菌总蛋白约5%。Western blotting结果确认了该条带为CTB基因的产物。结论构建的重组质粒pGEX-4T-CTB能够在大肠杆菌及双歧杆菌中获得表达。

变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合基因转基因黄瓜植株的获得及鉴定

目的:经农杆菌介导将变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合基因导入黄瓜,获得转基因黄瓜植株,为转基因可食防龋疫苗的研究提供实验基础。方法:利用双元载体pCAMBIA2301构建变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合质粒(PAcA-ctxB)的植物表达载体p2355-PAcA-CTB;电转化法导入农杆菌EHA105;采用叶盘转化法转化黄瓜,转基因植物经过卡那霉素抗性筛选、GUS基因染色、PCR及Southern blot杂交分析检测目的基因鉴定。结果:成功得到转基因黄瓜植株,卡那霉素抗性筛选、GUS基因染色、PCR及Southern blot杂交分析检测证实目的基因PAcA-ctxB已整合至黄瓜基因组中。结论:获得了含有变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合基因的转基因黄瓜植株,为转基因可食防龋疫苗的进一步研究提供了实验基础。

热不稳定大肠杆菌肠毒素B亚单位免疫调节功能的实验研究

目的 :探讨大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位 (LTB)的免疫调节功能及其可能的机制。方法 :用SephacrylS 10 0凝胶柱层析纯化LTB蛋白。选用BALB/c小鼠 ,以鸡溶菌酶 (HEL)为抗原 ,经鼻黏膜单独免疫 ,或以不同剂量的LTB为佐剂与HEL共免疫。用ELISA法检测血清和肠分泌液中HEL特异性抗体的水平。用3 H TdR掺入法 ,体外测定LTB蛋白对刀豆蛋白A(ConA)及同种异体抗原介导的淋巴细胞增殖反应的影响。结果 :HEL单独免疫组血清中仅有弱的抗HELIgG ,未检测到抗HELIgA ,且其肠分泌液中亦未见HEL特异性IgA抗体。但加用LTB佐剂的 3个组 ,其血清中抗HELIgG、IgA的水平及肠分泌液中抗HELIgA的水平均显著高于HEL单独免疫组 (P <0 .0 0 1)。体外实验显示 ,LTB可明显抑制ConA及同种异体抗原介导的淋巴细胞增殖反应。结论 :我们制备的LTB蛋白对免疫系统具有双向的调节功能 ,既可作为有效的黏膜佐剂 ,辅佐外来抗原刺激机体产生黏膜免疫应答 ,又具免疫抑制效应 ,有效地抑制淋巴细胞活化。LTB免疫调节功能的发挥 。

霍乱毒素B亚单位基因的克隆及其核苷酸序列分析

利用 PCR技术从含有霍乱毒素 B亚单位 ( CTB)基因的质粒 p UCT1中扩增出不包括信号肽的 3 0 9bp的 CTB全基因 ,并通过点突变技术消除了 CTB阅读框内的终止密码子 ( TAA→GAA) ,以便于在 CTB基因的下游融合其他的外源基因。用限制性内切酶 Bam H 和 Eco R 对 PCR产物进行双酶切 ,以 T4DNA连接酶将其定向连接于经同样酶切处理的质粒 p ET-2 8b( +)的多克隆位点上 ,构建成重组质粒 p ECTB,转化至BL2 1 ( DE3 )中。经 Bam H 和 Eco R 双酶切分析和 PCR扩增检测 ,证明重组质粒 p ECTB中含有 CTB基因。核苷酸序列分析表明 ,克隆的

弓形虫抗原与霍乱毒素A2/B亚基复合基因在小鼠体内诱导的免疫反应

目的 观察弓形虫主要表面抗原SAG1、SAG2 与霍乱毒素A2 /B亚基复合基因真核质粒经肌肉免疫小鼠所诱导的免疫反应。方法 将SAG1基因、SAG2 基因及CTXA2 /B基因定向连接插入真核表达质粒pcDNA3.1,经酶切及测序,获得pcDNA3.1 SAG1 SAG2 及pcDNA3.1 SAG1 SAG2 CTXA2 /B的重组子;碱裂解法大量制备经肌肉注射免疫BALB/c鼠,每只鼠经后腿肌肉注射质粒10 0 μg ,每2周免疫1次,共3次,以PcDNA3.1空质粒注射组及PBS组为对照,分别于每次免疫前断尾取血和免疫后4周取小鼠脾脏测定T淋巴细胞增殖活性及NK细胞活性,ELISA法测定IgG抗体。结果 免疫组小鼠的IgG抗体水平明显提高,NK细胞杀伤活性和T细胞增殖活性也明显增强。免疫鼠抗攻击感染的时间延长。结论 含有霍乱毒素的复合基因免疫小鼠后体液免疫和细胞免疫水平均有提高。

纯化重组霍乱毒素B亚单位与天然霍乱毒素B亚单位性质的对比研究

霍乱毒素Ｂ亚单位（ＢＳ）已用于新型口服霍乱疫苗、佐剂及蛋白质载体，但成本高，来源困难．用重组霍乱毒素Ｂ亚单位（ｒＢＳ）代替ＢＳ可克服上述缺点．ｒＢＳ用于上述目的前必须证实其在物理、化学及免疫学性质方面与天然同类产品的一致性．用亲和层析法从各批次大罐发酵所获工程菌Ｅ．ｃｏｌｉＭＭ２（ｐＭＭ－ＣＴＢ）培养物上清中制备得到了小批量ｒＢＳ纯品，在同等条件下与ＢＳ（Ｓｉｇ－ｍａ公司产品）进行理化、免疫学性质的对比研究，证实二者在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中电泳带位置一致、分子量相同，纯度达９９％；在反相ＨＰＬＣ中出峰行为一致，纯度达１００％；在半干式聚焦电泳分析中电泳带分布相同，等电点为７．９１．ｒＢＳＮ端起的２０个氨基酸序列为ＴＰＱＮＩＴＤＬＣＡＥＹＨＮＴＱＩＨＴＬ，与克隆基因来源株的毒素Ｂ亚单位同一段序列完全一致．氨基酸组成分析证实ｒＢＳ与ＢＳ相近．在免疫学性质分析中，ｒＢＳ与ＢＳ在免疫双扩散试验中与抗ＣＴ均出一条沉淀线且相互吻合；在免疫电泳试验中二者与抗ＣＴ在相应位置上产生一条沉淀弧；二者均能与神经节苷脂ＧＭ１结合且这种结合均可通过二者与抗ＣＴ的预保温处理而被阻断．对比研究结果揭示ｒＢＳ与ＢＳ性质完全一致，可代替ＢＳ用于?

霍乱毒素B亚单位工程菌MM2的表达与lac启动子的关系

研究了不同碳源(葡萄糖、乳酸和乙酸)以及IPTG诱导对工程菌MM2表达霍乱毒素B亚单位(CTB)的影响,ctb基因位于lac启动子的下游。在YC培养基中分别加入0.048mol/L的葡萄糖、0.102mol/L的乳酸和0.167mol/L的乙酸,它们在完全氧化后可产生相同的能量。结果表明,加入葡萄糖会大幅度降低ctb基因的表达水平,其原因和培养过程中pH值下降有关;加入乳酸可提高ctb基因表达水平1.15倍,且不抑制菌体生长;加入乙酸可提高ctb基因的表达水平0.9倍,但对菌体生长有抑制作用。不同时间及不同浓度的IPTG诱导未能提高ctb基因的表达水平,说明lac启动子对ctb基因的表达没有影响或影响很小。

宋内Ⅰ相O抗原及霍乱毒素B亚基在福氏2a痢疾菌中的表达及其免疫保护效果的观察

本文利用基因重组的方法，将宋内Ｉ相Ｏ抗原基因以及霍乱毒素Ｂ亚单位基因（ｃｔｘ－Ｂ）克隆至带链球菌的ａｓｄ基因的表达载体，然后转化至ａｓｄ－痢疾菌苗株福氏２ａＴ３２。脂多糖银染以及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ实验证实以上两基因都能在宿主菌中稳定表达。动物（小白鼠）保护实验表明，该重组菌对福氏２ａ、宋内氏痢疾菌的保护效率达１００％，对霍乱弧菌的保护效率也达７０％。该菌具有稳定、无抗生素标记、多价的特点。