N端携带HBGAs受体结合表位的兔出血症病毒嵌合VP60蛋白的表达及其免疫原性

将HBGAs受体结合表位插入兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60的N端,分析嵌合VP60蛋白的表达及病毒样颗粒(VLPs)形成情况,并研究N端HBGAs受体结合表位的插入对嵌合VP60蛋白免疫原性的影响。通过VP60蛋白N端起始位点HBGAs受体结合表位的插入,获得表位插入的VP60基因。利用Bac-to-Bac系统构建杆状病毒重组质粒,命名为Bacmid-VP60-CR,转染Sf9昆虫细胞后,得到重组杆状病毒rBac-VP60-CR,经HA、IFA和Western Blot鉴定,结果显示,重组蛋白VP60-CR在Sf 9昆虫细胞中得到高效表达,电镜观察显示其可形成与VP60类似的VLPs结构。将重组蛋白免疫2月龄RHDV血清阴性的新西兰兔,200μg/只,免疫后每周采血检测HBGAs表位抗体水平,同时在免疫后14 d,以RHDV WF株攻毒观察VP60-CR重组蛋白的免疫保护效果。结果显示,与VP60对照相比,VP60-CR蛋白可产生更高水平的针对HBGAs表位的抗体水平,且VP60-CR免疫兔可完全抵抗RHDV强毒的攻击。本研究构建了一种N端插入HBGAs受体结合表位的嵌合VP60蛋白,为研究高免疫原性兔出血症基因工程疫苗抗原奠定了基础。

N端B细胞表位缺失的兔出血症病毒VP60蛋白的表达及其免疫原性

本研究将A3C单抗识别的VP60蛋白NTA区域作为识别标记,设计一系列编码VP60 NTA区域重叠多肽的基因序列并连接于pGEX-4T-1载体,确定A3C单抗识别的精确表位。然后构建重组质粒Bacmid-VP60△A3C,将Bacmid-VP60△A3C转染Sf9昆虫细胞,得到重组杆状病毒rBac-VP60△A3C。RT-PCR、HA、IFA和Western Blot鉴定结果表明,重组蛋白VP60△A3C在Sf9细胞中高效表达,电镜观察显示其形态和结构与兔出血症病毒VP60蛋白类似。将重组蛋白VP60△A3C以每只200μg免疫2月龄RHDV血清阴性的新西兰兔,免疫后14 d,以兔出血症病毒WF株攻毒新西兰兔。结果表明,免疫组无死亡,而对照组全部死亡。本研究结果为制备表位缺失的兔出血症亚单位疫苗奠定了基础。

山东省某规模化兔场GI.1a型兔出血症病毒的分子特性分析

2023年10月,山东省某规模化兔场(存栏2000只母兔)免疫过兔出血症(RHD)疫苗的经产母兔出现精神不振、体温升高、猝死等情况。为查明发病原因,采集4只病死兔组织进行细菌分离培养和病原核酸检测,并对检出的1份阳性样品(命名为S1001)进行了兔出血症病毒(RHDV)分型鉴定及遗传进化分析。结果显示:未分离到细菌,4份病料均为RHDV阳性;经测序S1001属于RHDV GI.1a基因型,其p16、p23、p29、VP10基因均属于GI.1a分支;与疫苗株(NJ株)相比,VP60基因的核苷酸同源性为95.9%,p16、p23、p29、VP10等蛋白分别存在9、18、11、2处氨基酸变化。蛋白结构预测结果显示,S1001 VP60蛋白的N端片层结构区变化明显,与参考株结构相似性为93%,TM-score为0.59(越接近于1,结构越相似)。结果说明:该兔场存在RHDV感染,感染的RHDV与疫苗株相比存在较多分子差异,蛋白构象变化有可能导致VP60蛋白抗原性发生变化。建议持续加强RHDV的遗传变异监测,及时掌握病毒变异情况,以期为新型疫苗研发奠定基础。

Kozak序列引导的表达兔出血症病毒2型VP60蛋白重组腺病毒的构建及鉴定

【目的】试验旨在以复制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)为载体,构建Kozak序列引导的表达兔出血症病毒2型(RHDV2)VP60蛋白的重组腺病毒,为RHDV2新型疫苗研究提供依据。【方法】修饰、合成带有Kozak序列的VP 60基因序列,将其与腺病毒穿梭质粒进行重组,转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,构建重组腺病毒穿梭质粒,并利用酶切与测序对重组腺病毒穿梭质粒进行鉴定;采用Ad Max腺病毒包装系统,基于HEK293细胞进行穿梭质粒与腺病毒骨架质粒的定点同源重组,构建重组腺病毒Ad5-RHDV2-VP60并感染HEK293细胞,通过RT-PCR、Western blotting及间接免疫荧光试验(IFA)对重组腺病毒进行表达验证;利用Reed-Muench方法测定重组腺病毒的病毒滴度。【结果】重组腺病毒穿梭质粒酶切鉴定结果可见2条大小分别为3895和1752 bp的条带,测序比对结果显示,其与GenBank中公布的相应序列相似性>99%,表明穿梭质粒构建成功。RT-PCR结果可见大小约为515 bp的特异性条带;Western blotting结果显示,大小约为60 ku的VP60蛋白特异性条带;IFA观察结果显示,感染重组腺病毒的HEK293细胞产生了绿色荧光,表明重组病毒能在HEK293细胞中表达VP60蛋白,且该蛋白具有良好的抗原性;病毒滴度测定结果显示,初代重组腺病毒的TCID_(50)为10^(5.5)/0.1 mL。【结论】本试验构建了含RHDV2 VP 60基因的重组腺病毒,并成功表达了RHDV2 VP60蛋白,为进一步研究开发RHDV2疫苗提供了病毒模型。

兔多杀性巴氏杆菌和兔出血症病毒双重PCR检测方法的建立及初步应用

为建立兔多杀性巴氏杆菌(Pm)和兔出血症病毒(RHDV)的双重PCR检测方法,本研究根据Pm kmt1基因和RHDV VP60基因保守区域,设计2对特异性引物,经PCR分别扩增Pm kmt1基因和RHDV VP60基因保守区域,构建重组质粒pMD-Pm和pMD-RHDV,并经菌液PCR和测序鉴定后作为重组质粒标准品。经各反应条件优化后初步建立了检测Pm和RHDV的双重PCR方法。反应条件优化结果显示,该方法的最适退火温度为59℃,扩增kmt1和VP60基因的最优引物浓度均为0.5μL(10μmol/L)。对Pm和RHDV及其他病原包括兔源支气管败血波氏杆菌、产气荚膜梭菌等20种相关病原的特异性试验结果显示,除Pm和RHDV有特异性扩增条带外,其余相关病原均无扩增条带,特异性较强。将两种重组质粒标准品分别10倍倍比稀释并等体积混合后作为模板,经该双重PCR方法扩增。结果显示,该方法对pMD-Pm的检测限为17.9拷贝/μL,对pMD-RHDV的检测限为1260拷贝/μL,敏感性较高;对两种病原的DNA和cDNA混合物的批内和批间重复性试验结果均一致,重复性较好。对100份临床患病兔肺脏样品的检测结果显示,Pm和RHDV的阳性率分别为13%(13/100)和7%(7/100),二者混合感染率为37%(37/100),与已报道的Pm和RHDV单一PCR方法的检测结果均一致。表明该方法检测的准确性较高,可以用于临床样品的检测。本研究建立的同时快速检测Pm和RHDV的双重PCR方法为临床这两种病的诊断提供了技术支持。

鉴别检测兔出血症病毒1型、2型双抗体夹心ELISA方法的建立及应用

为实现对兔出血症病毒1型(RHDV1)和兔出血症病毒2型(RHDV2)的有效鉴别诊断,从而有效预防和控制兔出血症,将抗RHDV广谱单抗2A11作为捕获抗体包被于ELISA板,以HRP标记的抗RHDV1特异性单抗1D4、抗RHDV2特异性单抗6B3分别作为检测抗体,经条件优化,建立了鉴别检测兔出血症病毒1型、2型的双抗体夹心ELISA方法,并进行敏感性、特异性试验,对送检的60份兔肝脏样品用该双抗体夹心ELISA方法和RT-PCR方法进行检测,比较这2种方法的符合率。结果显示,该双抗体夹心ELISA方法的最佳工作条件为:捕获抗体浓度为4μg/mL,2种HRP标记的检测抗体的浓度均为0.5μg/mL;判定标准为:以检测抗体HRP-1D4检测样品D值>0.195判为RHDV1阳性,以检测抗体HRP-6B3检测样品D值>0.166判为RHDV2阳性;通过特异性和敏感性试验发现,该双抗体夹心ELISA方法具有较强特异性和较高敏感性。检测60份送检的兔肝脏样品,发现本方法与RT-PCR方法相比,检测RHDV1阳性样品的符合率为100%(9/9),RHDV2阳性样品的符合率为82.61%(19/23),阴性样品的符合率为87.5%(28/32),总符合率为93.33%(56/60),且该方法阳性样品检出率高于RT-PCR方法。本研究建立的双抗体夹心ELISA方法可有效地鉴别检测RHDV1和RHDV2这2种不同基因型的病毒,为兔出血症的流行病学研究提供有力的技术支撑。

兔出血症病毒(RHDV)WHNRH株的分离鉴定及基因组全序列的测定与分析

从发病长毛兔中分离鉴定了兔病毒性出血症病毒WHNRH株。参考GenBank中已登录的RHDV毒株序列对RHDV WHNRH分离株进行了全基因组序列测定与分析。设计5对扩增区段相互重叠的RHDV特异性引物，扩增除5’和3’末端以外的序列，采用设计锚引物的5’RACE方法以及针对RHDV 3’末端的polyA结构设计引物获得了RHDV WHNRH株的5’和3’末端序列。胶回收各PCR产物，连接pMD18-T克隆载体，测得RHDV WHNRH分离株的基因组全长为7437nt（不包括polyA），与GenBank公布的全部共6株RHDV全基因序列进行同源性比较分析，同源性在89．0％～97．1％之间，ORF1同源性为89．0％～97．1％，编码氨基酸序列的同源性为95．2％～98．7％；ORF2的核酸苷序列同源性为92．1％～97．7％，编码氨基酸序列的同源性为94．1％～96．6％。

两株GI.1型和GI.2型兔出血症病毒RdRp基因的克隆与分析

为了解兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)RdRp基因的遗传稳定性和变异规律,本研究分别克隆了RHDV SCH04株和RHDV2 SCCN03株的RdRp基因,然后对基因序列进行比对和系统发育分析,并通过编码蛋白质的理化性质、信号肽、跨膜区域、二级结构、三级结构、磷酸化和糖基化修饰位点的预测,对RdRp进行生物信息学分析。结果显示,两株RdRp基因序列全长均为1548 bp,编码516个氨基酸。GI.1型RHDV毒株间序列相似性为86.9%~99.9%,GI.2型RHDV毒株间为91.3%~99.9%。GI.1型和GI.2型RHDV毒株间序列相似性为84.3%~88.3%。SCH04株和SCCN03株分别属于GI.1a型和GI.2型RHDV,且SCH04株和SCCN03株的RdRp基因核苷酸序列相似性为84.95%,其编码蛋白存在17个氨基酸差异位点,氨基酸序列相似性为96.71%;二者均属于稳定蛋白,不存在信号肽和跨膜区域;其分子量、等电点、脂溶系数、平均亲水系数和不稳定系数等指标无显著差异。SCH04株RdRp的α螺旋和β转角比例比SCCN03株略高,分别为41.86%和4.26%,而SCCN03株RdRp的延伸链和无规则卷曲比例比SCH04株略高,分别为12.79%和43.41%;SCCN03株RdRp比SCH04株多4个磷酸化位点和1个N-糖基化位点。分析结果表明不同型间RHDV RdRp基因核苷酸变异率较高,GI.1 RHDV毒株间的变异范围大于GI.2 RHDV毒株。SCH04株和SCCN03株RHDV RdRp的氨基酸序列相似性高于核苷酸序列相似性,其二级结构和高级结构差异较小,遗传相对稳定。本研究为RHDV的遗传演变和生物合成等分子病原学研究提供了科学参考。

兔出血症病毒1、2型双重TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立和应用

兔出血症(rabbit hemorrhagic disease,RHD)是由兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起的欧洲兔(Oryctolagus cuniculus)的急性致死性传染性疾病。RHDV属于杯状病毒科(Calicivirus)兔病毒属(Lagovirus)。目前兔出血症病毒1型(GI.1)和兔出血症病毒2型(GI.2)2种基因型均有在我国流行。为了更好地进行流行病学调查、实时监测兔出血症发展趋势和临床诊断,建立了一种检测RHDV1型和RHDV2型病原的快速、简单、特异且敏感的Taq Man实时PCR。结果显示,稀释度为1×10^(8)~1×10^(4) copies/μL标准品建立的标准曲线有良好的线性关系,决定系数r^(2)为0.999;该方法对RHDV1型和RHDV2型具有高度特异性,与兔多杀性巴氏杆菌、兔支气管败血波氏菌等其他病原没有任何交叉反应;检测灵敏度为100~1000 copies/μL;组内和组间变异系数在0.01%~1.61%之间。用该方法对60份临床肝脏样品和52份鼻肛拭子样本进行检测,结果显示,RHDV检出率为70.5%,敏感性显著高于普通RT-PCR方法(51%)。因此,该方法能够同时检测RHDV1型和RHDV2型,可用于鉴别诊断兔出血症病毒。

兔出血症病毒新毒株RHDV2的流行与控制(综述)

兔出血症病毒(RHDV)可引起兔病毒性出血症(RHD)。RHD是一种急烈性、高度致死性兔传染病,给家兔养殖业造成巨大经济损失。2010年,研究人员在法国兔场发现一种新型兔出血症病毒RHDV2。与经典RHDV不同,该毒株能够感染幼龄家兔,甚至跨物种感染野兔,并突破经典RHDV疫苗的免疫防线,迅速在世界范围内流行。目前我国还未有RHDV2的报道,但随时面临发生该疫情的风险。本文综述RHDV2的病原学、流行病学特征、临床症状、诊断和防控等方面的研究进展,旨在提高对RHDV2的认识,加强对RHDV2的监测,提前做好防控措施。

兔出血症病毒和多杀巴氏杆菌嵌合蛋白VP60-Plp E的构建及其免疫原性鉴定

兔病毒性出血症(兔瘟)和兔巴氏杆菌病是对家兔危害最严重的两种疫病。用于防控这两种疫病的二联灭活疫苗存在着生产成本偏高问题。虽然基因工程亚单位疫苗的应用有助于提升二联苗的效力,但是生产成本依然偏高。本研究的目的是获得一种嵌合了巴氏杆菌保护性抗原PlpE的表位的兔出血症病毒VP60重组蛋白。首先通过Bepipred-2.0分析,确定PlpE的免疫显性区域主要位于N端。然后将编码PlpE26-45位、51-95位氨基酸序列的基因片段连接到VP60基因的5’端和3’端,并通过杆状病毒-昆虫细胞表达系统获得嵌合了PlpE表位的重组蛋白VP60-PlpE。血凝试验显示VP60-PlpE具有明显的血凝活性,提示重组蛋白仍然能够形成病毒样颗粒。Western blot实验结果表明VP60-PlpE与PlpE抗血清反应明显。小鼠免疫保护力实验表明VP60-PlpE对巴氏杆菌具有免疫保护力。家兔免疫保护力实验表明VP60-PlpE对兔出血症病毒和巴氏杆菌均具有免疫保护作用。总之,本研究成功构建出一种嵌合了巴氏杆菌保护性表位的兔出血症病毒VP60,为研制更低成本的兔病毒性出血症、兔巴氏杆菌病亚单位疫苗提供了基础。

兔出血症病毒(RHDV)蛋白亚基及免疫原性的研究

本文报道了兔出血症病毒RHDV蛋白亚基的组成及其分子量,并用Western-blot技术鉴定了RHDV抗原。研究结果显示,RHDV的外壳蛋白主要由四种蛋白亚基组成,其分子量分别为52kD、17kD、16kD和14kD。其中分子量为52kD和17kD的两个蛋白亚基有较强的免疫原性。

兔出血症病毒2型SC株VP60蛋白特异性单克隆抗体的制备及鉴定

为了获得我国兔出血症病毒2型(RHDV2)SC株特异性单克隆抗体,研究以纯化RHDV2作为抗原免疫BALB/c小鼠,4次免疫后取脾细胞与SP2/0细胞融合,经间接ELISA方法筛选,获得一株能够稳定分泌RHDV2 VP60蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为6B3。经Western blot和间接免疫荧光试验验证,该单克隆抗体可识别RHDV2,不与RHDV1反应,具有良好的毒株特异性。亚型鉴定结果为IgG3,轻链为Kappa型,腹水ELISA效价为1∶80 000。本研究得到的针对RHDV2的特异性单抗,将对我国兔出血症的诊断及流行病学调查提供有效制剂。

兔出血症病毒(RHDV)抗原多肽的氨基酸组份分析

兔出血症病毒（ＲＨＤＶ）抗原多肽的氨基酸组份分析盛祖恬杜青云何永强孙理云周明龙（浙江省农业科学院病毒室，杭州３１００２１）Ａｎａｌｙｓｉｓｏｎｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆａｍｉｎｏ－ａｃｉｄｏｆｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓｏｆｒａｂｂｉｔｈｅｍｏｒｈａｇ...

兔出血症病毒(RHDV)全基因组克隆与分子流行病学分析

根据GenBank已发表的多株RHDV全基因组序列,设计3对扩增RHDVCD株的特异性引物,扩增了RHDVCD株包含全序列的3个片段,并分别克隆到pMD18-T载体上。根据引物上唯一的交叉酶切位点,把三个克隆片段同时克隆到pUC18载体上,获得了RHDVCD株全基因组克隆,测定了全基因组序列(GenBankaccessionnumberAY523410)。进行了CD株全序列与GenBank上已发布的其他6株全序列比较及基因进化树分析。发现除CD株外,其余6株(西班牙AST-89株、法国SD株、意大利BS89株、德国分离1株、德国分离2株、澳大利亚CzechV351株)之间的同源性均很高,在93.9%～100%之间,而CD株与其他6株之间的同源性均较低,在89.0%～89.6%之间。德国的2个分离株序列完全相同,应为同一毒株。进化树分析表明,此7株病毒可形成2个明显的分支,中国CD株形成一个分支,其余欧洲、澳大利亚分离株开成一个分支,具有明显地域差异特征。

中国首例兔出血症病毒2型(RHDV2/b/GI.2)的鉴定及病理学观察

本试验旨在鉴定四川金堂某兔场疑似兔出血症病毒2型(RHDV2)感染疫情的病原,并分析病兔的病理组织学变化。利用血凝试验和RT-PCR检测病死兔内脏组织中的病原,取病变组织制作病理切片,观察分析各组织的病理组织学变化,同时应用病兔肝脏悬液感染幼兔,分析该毒株的致病力。血凝试验结果显示,所采集病死兔肝脏样品能凝集人“O”型血红细胞;RT-PCR扩增及测序结果显示,多对引物均能从样品中扩增出RHDV2特异性条带;病理组织学观察结果显示,病兔多脏器严重出血、肿胀,淋巴细胞和中性粒细胞大量浸润,气管黏膜、肝脏、肺脏出血尤为严重;动物试验结果显示,该毒株毒力较强,含毒肝脏悬液能在24 h内迅速致死幼兔。本研究经临床诊断、核酸检测及测序证实了此次疫情确由RHDV2感染引起,动物试验和病理组织学观察表明该毒株毒力较强,可引发脏器严重出血,造成病兔急性死亡,RHDV2的出现提示病毒的跨境传播情况不容乐观,应引起更大的重视。

密码子优化的RHDV2双VP60基因重组杆状病毒构建及表达蛋白免疫原性分析

[目的]试验旨在优化兔出血症病毒2型(Rabbit hemorrhagic disease virus 2,RHDV2)病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)疫苗的制备策略,探究RHDV2 VLP疫苗对家兔的免疫原性,为低成本、高产量RHDV2新型疫苗研发提供新思路。[方法]根据昆虫细胞的密码子偏好性优化合成RHDV2 VP60全基因,将双VP60基因插入真核载体pFastBacTMDual,转化携带Bacmid质粒的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,构建含双VP60基因的重组杆粒Bacmid-VP60-VP60,转染Sf9昆虫细胞,通过Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)及透射电镜对重组杆状病毒Bacmid-VP60-VP60进行表达验证;将优化策略制备的重组蛋白抗原与氢氧化铝佐剂按照9∶1比例制备VLP灭活疫苗,通过安全性检验、最小免疫剂量、免疫持续期等评估优化策略制备的RHDV2 VLP疫苗的保护效果。[结果]试验成功构建重组杆粒Bacmid-VP60-VP60。Western blotting鉴定结果显示,重组杆状病毒转染Sf9细胞表达出大小约60 ku的RHDV2 VP60蛋白。IFA鉴定结果显示,感染重组杆状病毒的Sf9细胞产生了大量的黄绿色荧光,表明重组杆状病毒在Sf9细胞中大量表达VP60蛋白。透射电镜观察结果显示,VP60蛋白折叠成VLP,大小为40 nm左右,呈现球形结构,表面光滑。优化策略制备的RHDV2 VLP疫苗对家兔具有良好的安全性和免疫原性,最小免疫剂量为0.5 mL/只,免疫持续期可达210 d以上。[结论]试验构建了含有密码子优化的双VP60基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中成功表达RHDV2 VP60蛋白,该蛋白制备的VLP疫苗对家兔具有良好的免疫原性。

兔出血症病毒(RHDV)McAb的研制及初步应用

用酒石酸钾─甘油梯度离心纯化的RHDV抗原免疫BALB／C小鼠，取脾细胞与SP2／0融合．获得4株稳定分泌RHDVMcAb的杂交瘤细胞株（1F7，1H4，2A9，2D6）。经检测，所分泌的抗体亚类分别为IgG2a（1F，1H4，2D6）和IgG1（2A9）。应用双抗体夹心ELISA法检测70份标本，并与直接免疫荧光法和HA法比较，取得较好的实验结果。

兔病毒性出血症病毒的分离和鉴定

本试验对山东某兔场疑似感染兔瘟致死的病料进行中和试验、血凝和血凝抑制试验、PCR鉴定及测序比对。试验结果表明,4份分离的病毒上清液都能与1%人O型红细胞发生凝集,凝集效价均为1:1024;与兔病毒性出血症阳性血清中和反应后,对人O型红细胞没有凝集反应;PCR扩增结果显示4份送检样品均在286 bp位置出现了目的条带,经测序比对,该序列与中国的03/China/2016毒株VP60基因(登入号为MF669712.1)序列同源性最高,相似度为99.65%。试验结果充分说明该病毒为兔病毒性出血症病毒,该兔场流行疫病为兔瘟。