N端B细胞表位缺失的兔出血症病毒VP60蛋白的表达及其免疫原性

本研究将A3C单抗识别的VP60蛋白NTA区域作为识别标记,设计一系列编码VP60 NTA区域重叠多肽的基因序列并连接于pGEX-4T-1载体,确定A3C单抗识别的精确表位。然后构建重组质粒Bacmid-VP60△A3C,将Bacmid-VP60△A3C转染Sf9昆虫细胞,得到重组杆状病毒rBac-VP60△A3C。RT-PCR、HA、IFA和Western Blot鉴定结果表明,重组蛋白VP60△A3C在Sf9细胞中高效表达,电镜观察显示其形态和结构与兔出血症病毒VP60蛋白类似。将重组蛋白VP60△A3C以每只200μg免疫2月龄RHDV血清阴性的新西兰兔,免疫后14 d,以兔出血症病毒WF株攻毒新西兰兔。结果表明,免疫组无死亡,而对照组全部死亡。本研究结果为制备表位缺失的兔出血症亚单位疫苗奠定了基础。

兔出血症病毒VP60蛋白的原核表达及检测方法初步应用

VP60是免出血症病毒（RHDV）的主要结构蛋白，也是免疫原性蛋白，与诱导抗病毒免疫反应直接相关，因而也是检测用首选抗原。本实验在原核系统pPRoEX^TMHTa中表达了VP60基因，经SDS—PAGE电泳中可见表达带。Western blot鉴定结果表明，重组蛋白可被RHD阳性血清特异性识别，具有相应的抗原性。将表达蛋白经SDS—PAGE电泳切胶纯化后免疫BALB／c小鼠，免疫血清经全病毒ELISA检测，效价可达1：3200-1：6400，经琼脂扩散试验检测效价为1：16。重组蛋白纯化、复性后，作为包被抗原初步建立了间接ELISA方法，并检测了48份免血清样品，与全病毒间接ELSIA试剂盒检测结果相同。实验结果表明．用原核系统表达的VP60蛋白．可以作为RHD新型诊断试剂的候选抗原。

兔出血症病毒VP60基因在昆虫细胞中形成病毒样颗粒及其特性

目的将兔出血症病毒(RHDV)VP60全长基因在昆虫细胞-杆状病毒系统中表达,验证重组蛋白形成病毒样颗粒(VLPs)的能力及其生物学特性,探讨VLPs作为检测抗原及亚单位疫苗的潜力。方法用Bac-to-Bac系统体外表达RHDVVP60全长基因。以免疫荧光及Western blotting检测蛋白表达情况及确定蛋白最佳表达条件;免疫电镜观察VLPs形态,并对VLPs的血凝性、免疫原性进行检测。结果SDS-PAGE电泳分析表明,表达的重组蛋白分子量大小约为68KDa,在免疫荧光、琼脂扩散、ELISA试验中均与RHD多克隆抗血清特异性反应;接种重组病毒的Sf9细胞裂解液在电镜下可观察到与RHDV形态相似的VLPs;该VLPs可凝集人“O”、“B”型红细胞,凝集可被RHD多克隆抗血清所抑制;含VLPs的Sf9细胞裂解液可不经纯化用作间接ELISA抗原,所建立的ELISA方法与进口商品化试剂盒相比,特异性良好,敏感性、检出率稍低;将含VLPs的细胞裂解液加氟氏佐剂免疫兔,HI效价可达1∶40,可经受致死量病毒攻击。结论RHDV-VLPs的获得及其良好的免疫原性,为RHD血清学检测试剂的标准化、亚单位疫苗研制应用奠定基础,同时在转移载体及RHDV受体方面研究亦有潜在应用价值。

兔出血症病毒VP60蛋白T细胞表位优势区的筛选

应用戊二醛醛化的人的"O"型红细胞纯化兔出血症病毒(RHDV),对非免兔进行3次免疫后,经分段表达的重组杆状病毒、纯化的病毒、Con A分别刺激后进行细胞增殖检测、IL-2、IL-4、IFN-γ检测。WST检测结果表明,3号重组杆状病毒刺激的值最高,所有重组杆状病毒与空白对照组差异显著;IL-2和IFN-γ检测结果表明,3号重组杆状病毒刺激的值最高,其次为2号、4号,而1号、5号重组杆状病毒刺激指数较低,但均高于对照组;IL-4检测结果表明,2号、3号、4号重组杆状病毒刺激的值低于对照组,1号、5号重组杆状病毒刺激组略低于对照组。研究结果表明,重组病毒3号区域为RHDV VP60 T细胞表位的优势区,从而为后期的试验奠定了基础。

兔出血症病毒VP60主要抗原表位的原核表达及其免疫原性

[目的]研究兔出血症病毒(RHDV)VP60主要抗原表位基因原核表达蛋白的免疫原性。[方法]采用RT-PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60主要抗原表位基因。以pET-28b(+)为表达载体,在E.coliRosetta菌株中表达重组蛋白。通过Western blot分析和接种家兔检测了重组蛋白的免疫原性。[结果]经Western blot检测,在相对分子量24.0k Da处出现特异性的反应带。以纯化的重组蛋白制备的抗血清可以与纯化的RHDV发生特异性的ELISA反应。[结论]RHDV VP60主要抗原表位的原核表达产物具有较好的免疫原性。

兔出血症病毒VP60基因的表达及其免疫原性研究

为研究兔出血症病毒VP60基因原核表达蛋白的免疫原性。采用RT-PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60基因。PCR产物纯化后连接T载体,提取质粒后进行序列测定,将测序正确的纯化产物经双酶切,克隆入原核表达载体PET28b中,构建原核表达载体。将鉴定正确的重组质粒转化表达宿主菌E.coliRosettaTM中,用IPTG诱导培养重组表达菌。结果表明:经SDS-PAGE分析,在相对分子量62.0KD处可见明显的表达带,经Western-blot鉴定,在62.0KD处出现明显的反应带。以纯化的重组蛋白制备的抗血清可以与纯化的RHDV发生特异性的ELISA反应。说明RHDVVP60基因原核表达蛋白具有较好的免疫原性。

与兔出血症病毒VP60蛋白相互作用蛋白的初步鉴定

为获得与兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白(VP60)相互作用的细胞蛋白,本研究以pMD-VP60重组质粒为模板扩增RHDV的VP60基因,克隆于表达载体pGEX-6p-1中,构建了重组表达质粒pGEX-VP60,并转化大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达GST重组蛋白(rVP60),western blot分析表明该蛋白具有与VP60单克隆抗体(MAb)良好的反应原性。以亲和层析纯化的rVP60进行pull-down实验,从兔的肝脏细胞膜蛋白中获得与VP60相互作用的蛋白,多肽质量指纹图谱分析表明,其相互作用的蛋白为ATP合成酶β亚基,提示该蛋白可能与RHDV的感染相关。

表达兔出血症病毒VP60蛋白重组牛疱疹病毒1型的构建及免疫原性分析

为制备表达兔出血症病毒(RHDV)VP60蛋白的重组病毒疫苗,本研究将RHDV VP60基因插入到CMV启动子下,构建牛疱疹病毒1型(BoHV-1)gE基因缺失转移载体,利用磷酸钙介导转染法将该转移载体与gE基因缺失的亲本病毒基因组DNA共转染牛肺细胞,制备了表达RHDV VP60基因的重组BoHV-1(rBoHV-1/gE-/VP60)。通过PCR、western blot及间接免疫荧光鉴定表明VP60基因在rBoHV-1/gE-/VP60中获得表达。并且体内试验表明重组病毒能够有效诱导小鼠产生RHDV特异性抗体。本研究构建了表达RHDV VP60基因的rBoHV-1/gE-/VP60,为研制预防兔出血症的BoHV-1活载体疫苗奠定了基础。

兔出血症病毒VP60蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化的重组兔出血症病毒核衣壳蛋白(VP60)为抗原,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术制备抗衣壳蛋白的单克隆抗体,获得了2株能稳定分泌抗VP60蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(AE11和AH4).分别利用Western blot、间接ELISA和间接免疫荧光(IFA)等方法对单抗的免疫活性和特异性进行检测,结果证明,此两株单抗均能识别重组的VP60和天然病毒的衣壳蛋白,而IFA结果显示只有AE11能和RHDV反应,可观察到强烈的特异性绿色荧光,表明成功制备了抗RHDV的VP60特异性单抗.

兔出血症病毒VP60蛋白单克隆抗体的制备及活性鉴定

为制备兔出血症病毒VP60单克隆抗体,利用HEK293T细胞瞬时表达VP60,免疫Balb/c小鼠,将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA筛选获得阳性克隆细胞株-5D11。利用血凝抑制(HI)、间接免疫荧光(IFA)和Westernblot等方法对5D11分泌的单克隆抗体活性进行鉴定,并对其识别区域进行了定位。结果显示,5D11能抑制病毒凝集人“O”型红细胞,与杆状病毒表达的VP60蛋白发生特异性抗原抗体反应,且其识别VP60蛋白线性抗原表位,并定位于494aa-579aa区段。成功制备了抗VP60蛋白单克隆抗体,为开展病原学检测、流行病学研究等奠定了基础。

兔出血症病毒VP60蛋白在杆状病毒表达系统中的表达优化

为提高兔出血症病毒衣壳蛋白VP60在Bac-to-Bac系统的表达量,本研究使用Hr1、Hr3、WPRE、SV40、CAG、Melt等顺式作用元件及元件组合对pFastBacDual供体质粒进行改造,将改造后的供体质粒用于重组VP60蛋白的表达。通过重组杆状病毒滴度测定、IFA、SDS-PAGE、Western blot、血凝效价测定等方法对重组VP60蛋白的产量、反应原性进行评价。结果表明,所有重组VP60蛋白均能够与VP60单克隆抗体反应,具有良好的反应原性,Hr1、Hr3、SV40、Hr1-WPRE、Hr3-WPRE、SV40-WPRE、SV40-WPRE-Melt能够提高重组VP60蛋白产量,其中Hr3、SV40-WPRE改造类型的提升作用更为显著,研究结果为降低兔出血症病毒亚单位疫苗生产成本提供参考,对其他重组蛋白在Bac-to-Bac系统中的表达量提升具有一定的借鉴意义。

兔出血症病毒VP60蛋白真核表达及其免疫原性研究

将兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)衣壳蛋白VP60基因,克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建pcDNA-VP60,并将其转染Vero细胞。间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)检测pcDNA-VP60在细胞中的表达情况,同时将pcDNA-VP60免疫实验兔,观察血清中特异性抗体变化情况。试验结果表明,本文构建的pcDNA-VP60不仅能在Vero细胞中表达VP60蛋白,而且能够诱导机体产生免疫应答。

兔出血症病毒VP60蛋白研究进展

兔出血症是由兔出血症病毒引起的一种发病率高、致死率高的烈性传染病,以肝坏死和肺出血为典型组织病变。兔出血症病毒VP60蛋白是该病毒主要的结构蛋白和免疫原性蛋白,能够诱导机体发生免疫应答,产生保护性抗体,因此关于该蛋白的结构、表达及功能是研究该病毒的一个重要内容。本文综述了国内学者近几年关于VP60蛋白的基因、表达和变异研究进展情况,希望能为兔出血症病毒研究提供参考。

含兔出血症病毒VP60蛋白病毒样颗粒的兔三联灭活疫苗的研究

为研究兔出血症病毒(RHDV)VP60蛋白形成的病毒样颗粒联合多杀性巴氏杆菌(Pm)、产气荚膜梭菌(Cp)的免疫效果,将3种抗原与铝胶佐剂混合制成三联灭活疫苗,进行安全检验、最小免疫剂量测定及免疫持续期研究。结果表明,3批疫苗以4.0 mL/只免疫兔未见任何不良反应;对兔的最小免疫剂量为1.0 mL/只,免疫后14日,血清RHDV HI效价为1∶16~1∶64,攻毒后免疫兔均健活(5/5);免疫后21 d,用Pm和Cp分别攻毒,免疫兔80%以上(4/5~5/5)保护;免疫持续期可达210 d。RHDV VP60蛋白形成的病毒样颗粒可与Pm、Cp联合制备疫苗,解决了传统RHDV组织灭活苗生产过程存在的生物安全风险问题,同时实现了一针三防。

N端携带HBGAs受体结合表位的兔出血症病毒嵌合VP60蛋白的表达及其免疫原性

将HBGAs受体结合表位插入兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60的N端,分析嵌合VP60蛋白的表达及病毒样颗粒(VLPs)形成情况,并研究N端HBGAs受体结合表位的插入对嵌合VP60蛋白免疫原性的影响。通过VP60蛋白N端起始位点HBGAs受体结合表位的插入,获得表位插入的VP60基因。利用Bac-to-Bac系统构建杆状病毒重组质粒,命名为Bacmid-VP60-CR,转染Sf9昆虫细胞后,得到重组杆状病毒rBac-VP60-CR,经HA、IFA和Western Blot鉴定,结果显示,重组蛋白VP60-CR在Sf 9昆虫细胞中得到高效表达,电镜观察显示其可形成与VP60类似的VLPs结构。将重组蛋白免疫2月龄RHDV血清阴性的新西兰兔,200μg/只,免疫后每周采血检测HBGAs表位抗体水平,同时在免疫后14 d,以RHDV WF株攻毒观察VP60-CR重组蛋白的免疫保护效果。结果显示,与VP60对照相比,VP60-CR蛋白可产生更高水平的针对HBGAs表位的抗体水平,且VP60-CR免疫兔可完全抵抗RHDV强毒的攻击。本研究构建了一种N端插入HBGAs受体结合表位的嵌合VP60蛋白,为研究高免疫原性兔出血症基因工程疫苗抗原奠定了基础。

Kozak序列引导的表达兔出血症病毒2型VP60蛋白重组腺病毒的构建及鉴定

【目的】试验旨在以复制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)为载体,构建Kozak序列引导的表达兔出血症病毒2型(RHDV2)VP60蛋白的重组腺病毒,为RHDV2新型疫苗研究提供依据。【方法】修饰、合成带有Kozak序列的VP 60基因序列,将其与腺病毒穿梭质粒进行重组,转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,构建重组腺病毒穿梭质粒,并利用酶切与测序对重组腺病毒穿梭质粒进行鉴定;采用Ad Max腺病毒包装系统,基于HEK293细胞进行穿梭质粒与腺病毒骨架质粒的定点同源重组,构建重组腺病毒Ad5-RHDV2-VP60并感染HEK293细胞,通过RT-PCR、Western blotting及间接免疫荧光试验(IFA)对重组腺病毒进行表达验证;利用Reed-Muench方法测定重组腺病毒的病毒滴度。【结果】重组腺病毒穿梭质粒酶切鉴定结果可见2条大小分别为3895和1752 bp的条带,测序比对结果显示,其与GenBank中公布的相应序列相似性>99%,表明穿梭质粒构建成功。RT-PCR结果可见大小约为515 bp的特异性条带;Western blotting结果显示,大小约为60 ku的VP60蛋白特异性条带;IFA观察结果显示,感染重组腺病毒的HEK293细胞产生了绿色荧光,表明重组病毒能在HEK293细胞中表达VP60蛋白,且该蛋白具有良好的抗原性;病毒滴度测定结果显示,初代重组腺病毒的TCID_(50)为10^(5.5)/0.1 mL。【结论】本试验构建了含RHDV2 VP 60基因的重组腺病毒,并成功表达了RHDV2 VP60蛋白,为进一步研究开发RHDV2疫苗提供了病毒模型。

兔出血症病毒和多杀巴氏杆菌嵌合蛋白VP60-Plp E的构建及其免疫原性鉴定

兔病毒性出血症(兔瘟)和兔巴氏杆菌病是对家兔危害最严重的两种疫病。用于防控这两种疫病的二联灭活疫苗存在着生产成本偏高问题。虽然基因工程亚单位疫苗的应用有助于提升二联苗的效力,但是生产成本依然偏高。本研究的目的是获得一种嵌合了巴氏杆菌保护性抗原PlpE的表位的兔出血症病毒VP60重组蛋白。首先通过Bepipred-2.0分析,确定PlpE的免疫显性区域主要位于N端。然后将编码PlpE26-45位、51-95位氨基酸序列的基因片段连接到VP60基因的5’端和3’端,并通过杆状病毒-昆虫细胞表达系统获得嵌合了PlpE表位的重组蛋白VP60-PlpE。血凝试验显示VP60-PlpE具有明显的血凝活性,提示重组蛋白仍然能够形成病毒样颗粒。Western blot实验结果表明VP60-PlpE与PlpE抗血清反应明显。小鼠免疫保护力实验表明VP60-PlpE对巴氏杆菌具有免疫保护力。家兔免疫保护力实验表明VP60-PlpE对兔出血症病毒和巴氏杆菌均具有免疫保护作用。总之,本研究成功构建出一种嵌合了巴氏杆菌保护性表位的兔出血症病毒VP60,为研制更低成本的兔病毒性出血症、兔巴氏杆菌病亚单位疫苗提供了基础。

兔出血症病毒2型SC株VP60蛋白特异性单克隆抗体的制备及鉴定

为了获得我国兔出血症病毒2型(RHDV2)SC株特异性单克隆抗体,研究以纯化RHDV2作为抗原免疫BALB/c小鼠,4次免疫后取脾细胞与SP2/0细胞融合,经间接ELISA方法筛选,获得一株能够稳定分泌RHDV2 VP60蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为6B3。经Western blot和间接免疫荧光试验验证,该单克隆抗体可识别RHDV2,不与RHDV1反应,具有良好的毒株特异性。亚型鉴定结果为IgG3,轻链为Kappa型,腹水ELISA效价为1∶80 000。本研究得到的针对RHDV2的特异性单抗,将对我国兔出血症的诊断及流行病学调查提供有效制剂。

兔出血症病毒VP60截短基因原核表达及诱导条件优化

兔瘟是由兔出血症病毒(RHDV)引起的传染病,给肉兔养殖产业带来巨大损失。根据RHDV VP60基因序列进行抗原肽分析,选择该基因主要抗原肽段后,设计一对特异性引物进行PCR扩增,并插入pET32a(+)载体中构建重组质粒。经PCR鉴定、酶切鉴定和测序,结果表明p ET32a(+)-VP60截短基因质粒构建成功。对RHDV-VP60截短基因蛋白原核表达系统筛选诱导条件,结果表明:IPTG浓度为0.8 mmoL/L,诱导时间为8 h,诱导温度为37℃,表达量最高。研究为后续兔瘟亚单位疫苗和诊断试剂的研究奠定基础。