猪瘟兔化弱毒免疫猪淋巴细胞亚类及转化水平、IFN-γ的变化与分析

为研究免疫猪瘟兔化弱毒(HCLV)对猪细胞免疫应答的影响,本研究分别采用HCLV脾淋毒单独(A组)、HCLV细胞毒与兔脾淋组织液联合(B组)、HCLV细胞毒单独(C组)及生理盐水(对照组)免疫仔猪,应用流式细胞术、淋巴细胞增殖试验及ELISA方法测定免疫前后外周血淋巴细胞(PBL)亚类比值、PBL非特异性(NSI)及特异性(SSI)刺激指数、IFN-γ浓度。结果显示免疫后各组CD3+/PBL与CD3+CD8+/PBL差异不显著;CD3+CD4+/PBL于第7 d时A、B和对照组显著高于C组(p<0.05);CD3+CD4+/CD3+CD8+于第7 d、14 d时A、B和对照组显著高于C组(p<0.05),并且C组CD3+CD4+/CD3+CD8+显著降低(p<0.05);NSI于第3 d、7 d时A与B组显著高于C组(p<0.05),而C组显著高于对照组(p<0.05);SSI于第3 d、7 d时A组显著高于B与C组(p<0.05),而B与C组显著高于对照组(p<0.05);IFN-γ含量由高至低依次为:A、B、C和对照组,并且于第3 d、7 d时差异显著(p<0.05)。研究结果表明,HCLV细胞毒引起机体CD3+CD8+相对更快速增殖,而HCLV脾淋毒引起机体CD3+CD4+相对更快速增殖及NSI、SSI、IFN-γ浓度更高,脾淋毒与细胞毒可能侧重不同的免疫分子途径发挥免疫保护效力;兔脾淋组织液对NSI和IFN-γ浓度具有增强作用。

荧光定量PCR作为猪瘟兔化弱毒疫苗效价检验替代方法的研究与应用

【目的】建立一种快速、敏感、特异的检测猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)的荧光定量PCR方法(FQ-PCR),为猪瘟兔化弱毒疫苗的效力检验提供一替代方法。【方法】在猪瘟兔化弱毒疫苗基因组3′非编码区设计一对针对猪瘟兔化弱毒株的特异性引物和一条MGB探针,并进行反应体系及反应条件优化,以及特异性、灵敏度、稳定性及符合性试验。将此方法用于部分批次疫苗厂疫苗半成品的定量检验,与兔热反应进行比较,寻求两方法的相关性。【结果】试验结果证实,CT值与模板之间呈现良好的相关性,相关系数为0.9998,扩增效率为101.14%;该方法仅扩增HCLV,不扩增HCLV以外的其它病原,显示良好的特异性;具有较高的灵敏度,能检测模板中4.35个cDNA拷贝量,比CSFV-RT-nPCR高1个数量级。将此方法应用于4个厂家17个批次的34份猪瘟兔化弱毒疫苗效力检验,两只兔子均无热反应(不合格)样品共11份,FQ-PCR CT值为21.15—27.30;两只兔子一只呈现定型热,一只无热反应的样品12份,CT值为17.47—23.70;两只兔子都呈现定型热或者一只呈现定型热一只呈现轻热反应(合格品)样品共11份,CT值为17.10—20.8。【结论】建立的HCLV-FQ-PCR方法能特异性的检测疫苗核酸含量,与家兔热反应测定结果存在良好的相关性,可以用于猪瘟疫苗半成品中HCLV定量检测。

猪瘟兔化弱毒疫苗——半个世纪的回顾

猪瘟是一种严重危害养猪业的毁灭性传染病。20世纪50年代中国首创了举世闻名的猪瘟兔化弱毒疫苗(即C株),随后创制了不同的疫苗制造工艺,如细胞培养苗、乳兔组织苗和牛体反应组织苗等。C株是一株非常安全的弱毒疫苗,对各种年龄和品种的猪都没有副作用,并且有良好的免疫效力,它能同时诱导体液免疫和细胞免疫应答,对不同基因型的猪瘟病毒株均能提供有效的免疫保护。免疫母猪通过母乳可对仔猪提供被动免疫保护,但过高水平的母源抗体会影响仔猪对C株疫苗的主动免疫应答。目前已经完成了包括C株及其亲本株在内的几十株猪瘟病毒的全基因组序列测定和注释,建立了猪瘟病毒的反向遗传操作系统,初步解析了猪瘟病毒主要基因的结构与功能,并构建了不同的反向遗传操作标记疫苗,赋予了C株疫苗新的生命和内涵。C株疫苗可以用于猪瘟的控制和根除,借助于C株疫苗密集接种和综合控制措施,有关国家有效地控制了猪瘟,甚至消灭了猪瘟。尽管如此,要在全球范围内根除猪瘟,今后依然有漫长的路要走,这可能有赖于对C株进行进一步改造和利用。

猪瘟兔化弱毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

【目的】建立一种能够实际应用于猪瘟兔化弱毒疫苗中猪瘟病毒含量检测的荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中登录号为AF091507的猪瘟病毒（CSFV）兔化弱毒株的全长基因组序列,在其5′非编码区设计2对特异性引物（标准品引物、定量引物）和1条探针（qPCR-P）,通过标准品引物进行RT-PCR扩增及T7 RNA聚合酶体外转录构建标准品RNA。对荧光定量PCR方法的各项条件进行优化,建立猪瘟兔化弱毒荧光定量PCR检测方法,并采用该法对成品猪瘟兔化弱毒疫苗中的病毒含量进行检测。【结果】成功构建了体外转录的标准品RNA,建立了检测猪瘟兔化弱毒的荧光定量PCR方法。该方法检测灵敏度可达10拷贝/μL,比RT-nPCR方法的灵敏度高出1个数量级;该法对标准品RNA检测的线性范围为1.0×108~1.0×102拷贝/μL。对1.0×108,1.0×106,1.0×103拷贝/μL 3种稀释度的标准品RNA进行重复性试验,批内变异系数分别为0.54%,0.52%和0.39%;批间变异系数分别为1.47%,1.85%和1.01%,具有良好的可重复性。应用该方法对不同厂家猪瘟兔化弱毒疫苗中的病毒含量进行测定,可知同一厂家脾淋苗中的病毒含量比细胞苗高出1~2个数量级,而不同厂家同一类型疫苗中病毒含量也有差异,其中脾淋苗差异不大,而细胞苗间的差异较大,最高可达27.2倍。【结论】建立的猪瘟兔化弱毒荧光定量PCR方法,具有敏感性高、特异性强、重复性好的特点,为实际工作中对猪瘟兔化弱毒疫苗的质量监控提供了重要的技术支撑。

猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株复合实时荧光定量RT-PCR鉴别方法的建立

根据GenBank中的猪瘟病毒强毒和弱毒株基因组序列设计了1对针对猪瘟病毒的通用引物和2条分别针对猪瘟病毒强毒和猪瘟兔化弱毒疫苗株的特异性TaqMan水解探针，建立了一种能区分猪瘟病毒强毒和兔化弱毒疫苗株的复合实时荧光定量RT—PCR检测方法。结果显示，该方法能将我国大陆流行的不同基因亚群的猪瘟病毒强毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株完全区分开来，而不与其他猪源病毒发生非特异反应，分别可检测到初始模板中41．8和81．5个拷贝的病毒RNA，与已建立的复合RT-套式PCR的敏感性相近，两种方法对152份样品检测的符合率达96．9％～100％。通过对8份猪瘟兔化细胞疫苗效价的检测，证实本方法与兔体反应热测定法有一定的相关性，可用于猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗的定量和鉴别检测。

猪瘟兔化弱毒E2蛋白A/D区的高效表达和蛋白纯化及其应用

本试验对表达猪瘟E2囊膜糖蛋白的原核表达载体pET-E2的表达条件进行了优化,在此基础上,对表达的蛋白质进行了纯化。在6 mol/L盐酸胍存在的条件下,将包涵体溶解在Tris-HCI中,并直接用于His Band亲和层析。收集过柱产物并透析,在2%SDS条件下,对所得的重组蛋白质进行了定量。重组蛋白质被用来包被96孔ELISA板并应用于免疫猪瘟抗体水平的测定。

苜蓿多糖对猪瘟兔化弱毒疫苗免疫效果的影响

用苜蓿多糖作为猪瘟兔化弱毒疫苗的强化剂对60日龄体重18～20 kg的仔猪进行免疫试验研究.B淋巴细胞和抗体水平监测结果表明,苜蓿多糖可使猪外周血液的B淋巴细胞增多,血清抗体水平提高.攻毒试验表明,参试的2批猪,试验组潜伏期(34～72 h和36～68 h),明显长于对照组(12～48 h和14～48 h),发热温度试验组为(40.5～40.9℃和40.6～40.8℃)低于对照组(41.4～42.0℃和41.2～41.7℃),高热期试验组为(30～96 h和46～98 h)低于对照组(72～148 h和72～146h).说明苜蓿多糖对猪瘟疫苗免疫效果具有明显的强化作用.

中国猪瘟兔化弱毒株(C-株)兔脾组织毒主要保护性抗原E2(gp55)基因序列分析

利用反转录 (RT)及套式PCR(N PCR)方法扩增了中国猪瘟兔化弱毒株 (C 株 )兔脾组织毒主要保护性抗原E2 (gp55)基因 ,成功地将其克隆并测定了核苷酸序列 ,与国内外已发表的猪瘟病毒 (HCV)E2基因序列比较的结果是 :C 株兔脾毒与C 株细胞 (SK6)毒、C 株疫苗 (犊牛睾丸细胞 ,HCLV C)毒、HCV SM株 (石门 )毒、Brescia株 (荷兰 )毒、Alfort株 (德国 )毒的E2核苷酸序列同源性分别为 98 87%、98 34 %、94 58%、91 0 0 %、80 78% ;氨基酸同源性分别为 98 95%、97 37%、94 2 2 %、91 60 %、89 2 3%。对C 株兔脾毒与C 株细胞毒、经典强毒及国内流行野毒E2上的A、B、C三个中和性抗原区的氨基酸组成进行了比较 ,其结果为 :C 株兔脾毒与C 株细胞毒的差异很小甚至没有差异 ,而与流行野毒及经典强毒在B、C区有较大的差异。我国经典强毒石门毒与国内80年代和 90年代流行毒之间有明显的差异 ,表明我国猪瘟流行毒株发生了变化。

RT-LAMP可视化检测猪瘟病毒及特异性鉴别猪瘟兔化弱毒疫苗

【目的】建立可视化检测猪瘟病毒(CSFV)及特异性鉴别猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)的逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),为临床检测CSFV野毒株及特异性鉴别HCLV毒株提供技术支持。【方法】根据Gen Bank中CSFV非结构蛋白NS5B基因的保守序列,设计两套针对CSFV和HCLV的特异性引物,并优化RT-LAMP反应条件,同时用LA-320C浊度仪实时监测其浊度变化。【结果】优化的RT-LAMP仅需在63℃水浴锅中反应50 min即可完成检测,且能通过肉眼观察反应液的颜色变化直接判定结果;所有CSFV样本的检测结果均为阳性(翠绿色),其他非CSFV样本的检测结果均为阴性(桔红色),且能特异性鉴别HCLV毒株,与实时浊度监测结果一致。该方法对CSFV和HCLV的最小检测限分别是100和101 copies,敏感度分别是常规RT-PCR的100倍和10倍。【结论】建立的RT-LAMP特异性强、灵敏度高、方法简便,尤其适合基层进行CSFV感染的快速检测及特异性鉴别HCLV,对有效防控CSF具有重要意义。

猪瘟病毒兔化弱毒(HCLV)疫苗株基因组全长cDNA的克隆与序列分析

根据猪瘟病毒基因组的序列设计合成了覆盖HCLV基因组全部序列的5对引物,通过RT-PCR从感染家兔脾脏中扩增获得了包含HCLV(bog cholera lapinized virus,HCLV)基因组全序列的5个cDNA片段,并将它们分别克隆至pGEM-T vector中。然后将这5个cDNA片段按它们在HCLV基因组上的位置从5’端至3’端的顺序依次通过酶切连接,一并克隆到pPoly2载体中得到HCLV基因组全长cDNA的质粒pPOHCLV。序列分析表明,HCLV基因组长度共12310bp,有一个大的ORF,编码一3898个氨基酸的多聚蛋白。其5'-NCR和3’-NCR长度分别是374nt和239nt。与非兔化毒株相比较,HCLV基因组在12133nt处有12个碱基的插入CTTTTTTCTTTT,该序列可能是病毒在适应兔体增殖过程中形成的。基于基因组全序列及其所推导的氨基酸序列的同源性分析表明,毒株的亲缘关系的远近与它们的毒力之间并没有相关性。

猪瘟兔化弱毒抗体对不同野毒株体内外中和保护试验的相关性研究

将猪瘟兔化弱毒疫苗阳性血清与猪瘟野毒株HeBZJK1.95、GZGD1.95、HeBHH2.95、BJXC1.95、HeNBY1.96、BJCY1.96、BJSY2.96、BGTX3.96、HeNXH2.98、FJFQ1.99、JL1.94和标准石门株在PK-15单层细胞上进行中和试验,测定了猪瘟病毒抗体在体外对野毒株的中和作用能力.结果表明,阳性血清对HeBZJK1.95、GZGD1.95、B.JSY2.96、JL1.94和石门株的中和效价为1:256,对BGTX3.96株为1:128,对HeBHH2.95、BJCY1.96、HeNXH2.98株为1:64,对BJXC1.95株为1:16,对FJFQ1.99株为1:8,对HeNBY1.96株为1:4.由此表明,对不同毒株血清中和效价不同.另外测定了猪体内免疫抗体与免疫保护力的关系.采用1头份猪瘟兔化弱毒疫苗主动免疫没有母源抗体的猪,免疫后14 d和192 d抗体滴度<1:16,攻击野毒HeNXH2.98株,仔猪能够完全保护.采食初乳的2组仔猪,母源抗体滴度为<1:16～1:64,分别免疫2头份和4头份猪瘟兔化弱毒疫苗,免疫后抗体滴度均下降1～2个滴度(1头母源抗体滴度低的仔猪,免疫4头份后由<1:16达到1:16).攻击野毒HeNXH2.98株后,免疫2头份的仔猪,不管免疫后抗体水平多高(<1:16～1:64),均不完全保护;免疫4头份的仔猪,免疫后抗体滴度较低(1:8)时,不完全保护;抗体滴度≥1:16时,能够完全保护.动物免疫保护试验表明,1头份疫苗免疫抗体水平能起到良好攻毒保护作用,但母源抗体会影响疫苗免疫抗体水平和攻毒保护效果.

猪瘟强毒株与兔化弱毒疫苗株的LAMP鉴别检测

为了鉴别猪瘟病毒(CSFV)野毒感染和疫苗接种,系统比较分析CSFV标准强毒株、疫苗株、不同基因亚型的野毒株的全基因组序列差异,设计一套分别针对猪瘟强毒与弱毒NS5B基因的环介导等温扩增(LAMP)引物,建立特异性的猪瘟强毒株与疫苗株的LAMP检测方法.LAMP扩增产物用罗丹明B指示剂或者琼脂糖凝胶电泳进行检测.该方法特异性好,比RT-PCR灵敏度高出1 000倍,且重复性稳定性良好,为快速准确地鉴别CSFV野毒感染和疫苗接种提供了有效的方法.

猪瘟病毒兔化弱毒株全长cDNA克隆的感染性鉴定

用SrfⅠ限制性内切酶将构建的猪瘟病毒兔化弱毒株(C 株)全长cDNA线性化,体外转录获得其基因组RNA,利用脂质体将基因组RNA转染至SK 6细胞系,连续传代,收集5代以后培养细胞,采用RT PCR、荧光抗体直接法、夹心ELISA进行鉴定。结果表明,所构建的全长cDNA具有感染性。猪瘟病毒C 株全长感染性cDNA的成功构建,为在分子水平上进一步研究中国猪瘟病毒兔化弱毒株提供了极有价值的研究工具。

猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR快速鉴别检测方法的建立

【目的】建立猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR快速鉴别检测方法。【方法】根据Gen-Bank中36株猪瘟病毒(CSFV)强毒株和兔化弱毒疫苗株的基因序列,分别设计了针对CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的特异性引物,建立了一种能区分CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR检测方法。【结果】建立的RT-PCR检测方法可以从CSFV强毒株和兔化弱毒疫苗株中分别扩增出大小为187和492 bp的特异性片段,对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等猪源性病毒的检测结果均为阴性,说明该方法具有较好的特异性。对10份疑似猪瘟临床样品进行检测后发现,利用该方法可以从中分别检测出CSFV强毒和疫苗毒。【结论】建立了可鉴别检测CSFV强毒株和弱毒疫苗株的RT-PCR方法,为猪瘟的早期诊断及疫苗免疫猪和野毒感染猪的鉴别提供了技术参考。

荧光定量RT-PCR方法与兔体定型热试验对于检测猪瘟兔化弱毒疫苗的平行关系

为探讨荧光定量RT-PCR技术与传统兔体定型热试验对于检测猪瘟兔化弱毒疫苗的平行关系,本研究采用荧光定量RT-PCR方法与兔体定型热试验对5份猪瘟兔化弱毒细胞苗成品和6份半成品样品进行平行检测。结果表明,两种检测方法存在正相关性,最低105个病毒拷贝可以使家兔产生定型热反应,最低103个病毒拷贝可以使家兔产生轻热反应。荧光定量RT-PCR检测方法的检测过程仅需3.5 h,大大缩短了猪瘟疫苗的检测时间,该方法可以补充传统的兔体定型热反应用于猪瘟兔化弱毒疫苗半成品与成品的检验。

苜蓿多糖对猪瘟兔化弱毒疫苗免疫应答强化作用的研究

用苜蓿多糖作为猪瘟兔化弱毒疫苗的强化剂 ,对 6 0日龄体重 1 8～ 2 0kg的仔猪进行免疫试验。结果表明 ,苜蓿多糖可使猪外周血液的B淋巴细胞增多 ,IgG水平提高 ,可显著增强猪瘟疫苗的免疫效果。

中国猪瘟兔化弱毒兔脾毒NS2-3基因的序列分析

根据已发表的猪瘟病毒序列 ,设计并合成了覆盖有 NS2 - 3全基因的 4对引物 ,应用RT -PCR技术从接种了猪瘟兔化弱毒 (hogcholeraviruslapinizedChinesestrain ,HCLV)的兔脾组织中 ,成功地扩增了 NS 2 - 3基因 ,将其克隆到T载体后 ,测定了其核苷酸序列。结果显示 ,所克隆的NS 2 - 3基因长 2 96 4个核苷酸 ,编码 988个氨基酸。用DNASIS和PROSIS软件分析表明 ,该基因具有丝氨酸类蛋白酶活性及含有解旋酶超家族特征性保守序列。核苷酸序列同源性分析表明 ,HCLV与国外报导的 8株HCV毒株“C”、Riems、ALD、GPE、Glentorf、CAP、Brescia和Alfort株NS 2 - 3基因核苷酸序列同源性分别为 99%、99%、96 %、96 %、95 %、95 %、94%和 86 % ,推导的氨基酸序列同源性分别为 99%、99%、98%、98%、98%、97%、97%和 95 % ,氨基酸序列的高度同源性表明了NS 2 - 3是猪瘟病毒中高度保守的蛋白质之一 ,这与该基因产物参与病毒复制及多聚蛋白前体加工过程中的重要作用相对应。

建立快速定量检测猪瘟兔化弱毒苗的荧光定量PCR技术

在猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株的5挿潜嗦肭杓埔欢砸锖鸵惶跤馓秸?利用荧光定量PCR原理,结合LightCycler检测系统,首次建立了定量检测猪瘟兔化弱毒苗方法。结果表明,该方法的灵敏度为102拷贝数,线性范围为107-102,达6个数量级;标准样品的变异系数为2.3%-5.1%(n=10),疫苗样品组内实验变异系数为0.85%-2.8%(n=5)、组间实验为2.5%-7.3%(n=5),对同一样品分5次RNA提取和逆转录,其变异系数为5.0%;对9份疫苗样品进行了检测,与兔体定型热反应方法相比较,有很好的相关性;整个检测过程仅需4h。该法可望取代传统的兔体定型热反应用于疫苗生产过程中的效价测定及指导疫苗的配制,也为猪瘟病毒分子生物学研究提供了一种新的、简捷有效的工具。

猪瘟兔化弱毒疫苗株TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速鉴定猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)的方法,本研究根据GenBank中登录的HCLV株基因组序列,在Erns基因序列区内设计一对引物和一条TaqMan探针,建立了检测HCLV的荧光定量RT-PCR(FQRT-PCR)方法。该方法检测的灵敏度可达3.84拷贝/μL;而对猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、牛病毒性腹泻病毒基因组扩增结果均为阴性。实验组批内变异系数为1.05%～1.84%,批间变异系数为3.70%～5.43%。通过对32批HCLV半成品抗原和9批成品疫苗,分别用经典的兔检法测定兔体感染量(RID)和新建立的FQRT-PCR方法进行检测比较,两者有较好的相关性。结果表明,该方法具有快速、敏感、特异性强、稳定性好等优点,对HCLV生产配制及成品检验具有指导作用。

猪瘟病毒石门株与兔化弱毒株E0糖蛋白基因的克隆及序列分析

参考已发表的猪瘟病毒序列，设计并合成了一对引物，应用ＲＴＰＣＲ 技术，扩增了猪瘟兔化弱毒（Ｈｏｇ ｃｈｏｌｅｒａ ｖｉｒｕｓ ｌａｐｉｎｉｚｅｄ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｓｔｒａｉｎ ， ＨＣＬＶ） 和石门强毒株的Ｅ０ 糖蛋白基因，并将其克隆到ｐＧＥＭＴ 载体中，测定了其核苷酸序列，并推导了其氨基酸序列。结果表明我国这两株强弱不同毒株Ｅ０ 糖蛋白核苷酸序列同源性和推导的氨基酸序列同源性分别为９５－０ ％ 和９４－３ ％ ，有１３ 个氨基酸的差异，ＨＣＬＶ 比石门株多了一个潜在的Ｎ糖基化位点。将我国这两株病毒与国外已报导的ＨＣＶ 毒株Ｅ０ 基因序列进行了比较，发现石门株与日本的两株毒株ＡＬＤ 和ＧＰＥ－ 同源性较高，核苷酸序列同源性分别为９７－４ ％ 和９６－５ ％ ，氨基酸同源性分别为９７－４ ％ 和９６－０ ％ ，而与欧洲Ｂｒｅｓｃｉａ 株和Ａｌｆｏｒｔ 株同源性较低，核苷酸同源性分别为９２－２ ％ 和８６－５ ％ ，氨基酸同源性为９５－２ ％ 和９２－５ ％ ， ＨＣＬＶ 与ＡＬＤ、ＧＰＥ－ 、Ｂｒｅｓｃｉａ、Ａｌｆｏｒｔ 株核苷酸同源性分别为９５－６ ％ 、９４－９ ％ 、９１－３ ％ 、８５－５ ％ ，推导的氨基酸同源性分别为９３－４ ％ 、９２－５ ％