兔抗人NESTIN抗血清的制备与鉴定(简报)

巢蛋白(nestin)属Ⅵ类中等纤维蛋白[1].最初在神经系统发育早期发现有该蛋白的表达[2].

大黄鱼血清IgM纯化及其兔抗血清的制备

分别用饱和硫酸铵二次盐析法和蛋白A亲和层析法对健康大黄鱼(Pseudosciaena crocea)血清中的免疫球蛋白(IgM)进行分离纯化,所得产物用SDS-PAGE进行检测。结果表明,蛋白A亲和层析法可以较好地分离到高纯度的大黄鱼血清IgM,产物的电泳胶中只有重链和轻链2个条带;饱和硫酸铵二次盐析法除了有这2个条带,还有很多杂带,而且蛋白A亲和层析法更为简便、快速,因此用蛋白A亲和层析法分离纯化IgM优于饱和硫酸铵二次盐析法;大黄鱼免疫球蛋白重链的分子量在76 kD左右;轻链分子量在28 kD左右。用纯化的大黄鱼IgM免疫实验兔,获得效价高达1∶40 960的兔抗鱼IgM血清。本实验所建立的蛋白A亲和层析法提取大黄鱼血清IgM可以方便、快捷地获得高纯度的产物,适合在实验室中纯化鱼类IgM。本研究所制备的兔抗大黄鱼IgM血清可为今后的相关研究工作打下基础。

黄鳍棘鲷血清IgM的纯化及兔抗血清的制备

分别采用Sepharose-6B凝胶过滤层析、Phenyl Sepharose FF疏水作用层析和rProtein A Sepharose亲和层析技术纯化黄鳍棘鲷(Acanthopagrus latus)血清IgM,并将这3种层析纯化方法进行了比较。纯化产物进行SDS-PAGE,电泳结果扫描后经Band Scan5.0软件分析显示,单独使用Sepharose-6B凝胶过滤层析或Phenyl Sepharose FF疏水作用层析得到的IgM纯度只有56%左右;二者联合使用纯度可以达到69%,而rProtein A Sepharose亲和层析一步就可以达到89%的纯度;纯化得到的黄鳍棘鲷血清IgM的重链和轻链分子量分别为73.6kD和26.5kD。本研究还以rProtein A Sepharose亲和层析纯化的黄鳍棘鲷血清IgM为抗原,制备其兔抗血清,采用WesternBlot和双向琼脂扩散检测抗血清免疫学活性,并用间接ELISA检测其效价达到1∶25600,为进一步开展黄鳍棘鲷免疫学方面的研究奠定了基础。

VZV糖蛋白E基因胞外域的原核表达及其兔抗血清的制备

目的采用原核表达系统表达水痘-带状疱疹病毒(VZV)糖蛋白E(g E)基因的胞外域,将纯化后的目的蛋白免疫新西兰家兔,制备该蛋白特异性抗血清。方法构建原核表达质粒g E-p ET-32a(+),测序后将其转化至E.coli BL21,以异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导,获得VZV g E融合蛋白。采用SDS-PAGE电泳、Western blot法鉴定其特异性,利用Ni2+-NTA柱对g E蛋白进行纯化,复性后免疫新西兰家兔,获得兔抗VZV g E血清;采用间接免疫荧光、Western blot法和ELISA法检测该血清的特异性和效价。结果成功诱导表达出VZV g E融合蛋白,SDS-PAGE鉴定提示其主要为包涵体表达,浓度约为3.01 mg/ml。蛋白经Ni2+-NTA柱纯化后,纯度约为90%。Western blot法显示,经变性、复性后的该融合蛋白有良好的免疫反应性。用该蛋白免疫新西兰家兔后获得兔抗VZV g E血清。ELISA分析显示,该兔抗血清的效价为1∶6 400。结论成功构建了高效表达VZV g E蛋白的原核表达系统,获得较高纯度的g E蛋白,可以作为VZV亚单位疫苗的候选抗原,制备了特异性及效价均较高的兔抗VZV g E多克隆抗体,为VZV感染的临床诊断及治疗提供了重要的实验工具。

兔抗MAGEn血清的制备、纯化及鉴定

目的: 制备高效价、特异性的兔抗人MAGE-n血清。方法: 对原核表达的MAGE-n蛋白进行纯化, 与弗氏佐剂混合免疫新西兰兔制备抗血清, 用硫酸铵盐析法及溴化氰活化的Sephrose4B(CNBr-ActivatedSephrose4B)亲和层析柱纯化抗血清, 以双向免疫扩散实验、ELISA、Westernblot和免疫组化对兔抗人MAGE-n血清进行鉴定。结果: 经免疫得到高效价的兔抗人MAGE-n血清, 抗血清能够与MAGE-n特异性结合, 免疫组化结果表明MAGE-n是一种胞质蛋白。结论: 用MAGE-n蛋白与弗氏佐剂混合免疫兔, 制备得到高效价的抗血清, 纯化后的特异性兔抗人MAGE-n血清, 为进一步研究MAGE-n在各种组织中的表达奠定了基础。

罗非鱼和斑点叉尾鮰血清IgM的纯化及兔抗血清的制备

为深入了解罗非鱼和斑点叉尾鮰免疫机理及建立相关免疫检测方法,采用rProtein A Sepharose亲和层析一步法纯化罗非鱼和斑点叉尾鮰血清免疫球蛋白(IgM),并制备其兔抗血清。结果表明,rProtein A Sepharose亲和层析法可以较好地分离获得高纯度的罗非鱼和斑点叉尾鮰血清IgM,通过SDS-PAGE电泳检测,发现罗非鱼血清IgM重链和轻链分子量分别为88.0、21.0 kDa,斑点叉尾鮰血清IgM重链分子量为101.0 kDa。以纯化的罗非鱼和斑点叉尾鮰血清IgM为抗原,制备其兔抗血清,间接ELISA检测其效价分别为1∶32000和1∶16000;Western blotting检测分析,发现罗非鱼和斑点叉尾鮰的兔抗血清分别在88.0和101.0 kDa附近各出现1条反应条带,说明其兔抗血清具有免疫活性。

教学用兔抗人全免疫血清的制备与效价测定

目的探讨制备高效价兔抗人免疫血清的方法。方法将人全血清经弗氏佐剂完全乳化,采用一定的免疫程序免疫家兔,末次加强免疫5d后收集兔免疫血清,利用双向免疫扩散实验、对流免疫电泳和间接酶联免疫吸附法分别测定血清中抗体的效价。结果家兔在全程免疫后产生了高效价抗体,效价分别达到了1∶16、1∶8、1∶64 000。结论用人全血清免疫家兔,可以获得高效价的抗血清,为进一步实验教学和实验研究奠定了基础。

教学用高效价兔抗人免疫血清的制备

目的:制备教学用高效价兔抗人免疫血清。方法:采集健康人混合血清,用混合免疫法免疫健康家兔,一个月后产生高效价免疫血清,并用双向琼脂免疫扩散法测定其效价。结果:制备出效价高于1∶16的兔抗人免疫血清。结论:采用混合免疫法可在较短期内制备出高效价兔抗人免疫血清。

鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的融合表达及兔抗血清的制备

以鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)Gt株基因组RNA为模板,通过RT-PCR扩增VP2基因,经EcoR I/SalI酶双酶切处理后与经相同酶切处理的pET30a原核表达载体连接,将酶切、PCR及序列鉴定正确的阳性重组子转化E.coliDE3菌,经IPTG诱导,表达的VP2蛋白通过Ni-NTA树脂纯化后,免疫新西兰白兔,制备兔抗血清,并对其进行间接ELISA、IFA和Western blot分析。SDS-PAGE分析表明,在IPTG诱导下成功表达了约为50kDa的His-VP2融合蛋白;间接ELISA检测制备的兔抗血清效价在1:25 600以上;IFA及Western-blot分析结果表明,其可特异性结合真核表达的VP2蛋白以及IBDV全病毒。研究结果提示,兔抗VP2血清可用于VP2蛋白及病毒的检测,为进一步研究IBDV分子生物学功能提供了物质基础。

M13噬菌体肽库扩增及兔抗血清制备

为制备M13噬菌体多克隆抗体,将噬菌体十二肽原始文库进行大量扩增,作为免疫原制备兔抗M13的多克隆抗体血清并进行间接ELISA鉴定。结果表明,该多抗效价达1 1 048 576,说明此多抗可与扩增噬菌体文库发生很好的抗原抗体反应。将制备的噬菌体M13多克隆抗体与商业化M13抗体水平比较,制备多抗与商业化M13抗体效果相当。本研究成功制备兔抗M13噬菌体多克隆抗体,为深入研究噬菌体展示技术提供了材料。

以兔抗鼠淋巴细胞血清为非条件刺激的条件性免疫抑制

采用一种生物类免疫抑制剂—兔抗鼠淋巴血清 (rabbitanti ratlymphocyteserum ,ALS)为非条件刺激(UCS)、糖精水为条件刺激 (CS) ,以双瓶给水法置于鼠笼前端饮用偏好侧。在一次性CS—UCS结合训练后 ,单独再次给予CS ,使卵清蛋白 (OVA)免疫过的大鼠表现出脾淋巴细胞对有丝分裂原PWM的增殖反应降低、血抗OVA抗体的总量及脾内抗OVA抗体生成细胞的减少。但动物未表现出条件性味觉厌恶的行为反应。这些结果表明条件性免疫抑制与味觉厌恶性行为条件反射没有必然联系 ,并非是厌恶行为反应或情绪应激的伴随产物 ,UCS也并非必需具有感觉的毒副作用。

高效价兔抗人免疫血清的制备

动物免疫血清是我们在医学教学、科研及临床检验工作中，经常用到的试剂，高效价免疫血清制备的关键在于佐剂的正确使用，抗原剂量要适中，免疫间隔时间长短要适当等，注意这些方面有利于高效价免疫血清的制备。

人血管能抑素免疫兔抗血清制备及其特性测定

纯化的人血管能抑素包涵体进行SDS＿PAGE分离,切胶回收目的蛋白,与弗氏不完全佐剂充分乳化后,进行多点皮下注射免疫新西兰白兔,制备兔抗人血管能抑素抗血清,抗血清去除交叉反应抗体后,进行WesternBlotting分析抗血清与人血管能抑素及其N端和C端片段的抗原抗体反应特性。结果表明,经过4次加强免疫后,获得了高效价的兔抗人血管能抑素抗血清。抗血清去除交叉反应抗体后,WesternBlotting分析表明,它能与人血管能抑素发生特异的抗原抗体反应,同时还能与人血管能抑素的N端片段和C端片段发生特异性较弱的抗原抗体反应。证明制备的兔抗人血管能抑素抗血清能应用于人血管能抑素及其N端和C端片段免疫学研究中。

免疫微球吸附实验的建立──Ⅰ.兔抗人血清IgG检测

用免疫微球技术来检测抗原抗体是目前免疫诊断试剂研究的一个新方向．本文介绍了兔抗人血清ＩｇＧ的制备和利用彩色微球检测该抗体的检测方法；同时，探讨了影响实验敏感性的温度、浓度和ｐＨ值等主要因素．

卵磷脂水解抑制试验测定家兔血清中的抗α毒素水平

以卵磷脂水解试验为基础 ,根据α毒素在被抗毒素完全中和后将出现水解抑制这一原理 ,建立了测定家兔血清抗α毒素水平的卵磷脂水解抑制试验方法。结果显示 ,卵磷脂水解抑制试验可用于测定不同血清样品的抗α毒素水平 ,抗血清完全中和单位剂量α毒素时 ,水解抑制试验结果明显。所能测定出的最小血清抗体量相当于中和 1/ 6 4MLD毒素的量 ,最适毒素中和时间为 30min ,其敏感性和精确性优于小鼠毒素中和试验 ,且操作简单 ,取材经济 。

草原兔尾鼠卵透明带3蛋白的免疫原性及其抗血清对体外精卵结合的影响

目的:大肠杆菌表达的重组草原兔尾鼠透明带3(Recombinant Luguruszone pellucida3,r-LZP3)蛋白的免疫原性直接影响抗体的滴度,通过对r-LZP3免疫原性的分析,获得特异性的抗血清,并探讨r-LZP3和抗血清对体外精卵结合的影响。方法:在大肠杆菌中以包涵体形式表达r-LZP3,经过变性、复性及纯化后作为抗原,用LZP3DNA疫苗初免小鼠后,再用r-LZP3进行免疫加强,产生特异性的LZP3抗血清;通过EL1SA测定抗体应答的水平;蛋白印迹、间接免疫荧光和免疫组化方法检测抗血清同r-LZP3、鼠卵母细胞表面天然ZP的反应性;精卵结合实验观察r-LZP3、抗血清体外对鼠精卵结合能力的影响。结果:用LZP3DNA疫苗免疫制备的抗血清在免疫鼠中产生了较高的抗体滴度,并且可以识别大肠杆菌表达的r-LZP3以及鼠卵细胞表面天然的ZP,抗血清和r-LZP3也都能在体外抑制鼠的精卵结合。结论:大肠杆菌表达的r-LZP3有较好的免疫原性,r-LZP3和抗血清能够在体外阻止鼠的精卵结合。

兔抗猪生长激素抗血清的制备和鉴定

《中国农业百科全书·兽医卷》在中国畜牧兽医学会陈凌风理事长的主持下有些条目已写出,本刊选登部分条目,以广泛征求修改意见。

兔抗猪α_1－AT抗血清的制备及其效价测定

采用完全弗氏佐剂乳化抗原，成功地制备了兔抗猪α＿１－ＡＴ抗血清，经免疫双扩散反应为单一沉淀线，抗血清的效价为１：１．６。

提高兔抗血清制备量的措施

抗血清即免疫血清或高免血清．是指含有对某一特异性抗原起作用的抗体的血清。是用同一种抗原物质（菌苗、疫苗、类毒素等）反复多次注射动物体后，机体体液中尤其是血清中产生大量抗体．待抗体效价达到实验要求时，采集全血，析出的血清即为我们所需要的抗血清。制备血清需要一个较长的周期，也需要投入一定的物力和人力，所以尽可能获得多量的抗血清，是实验者们所期望的。实践证明，要想收获更多的抗血清，关键在于采血方法和血清分离两方面。下面就浅谈一下笔者收获兔抗血清的一点心得：

兔抗羊免疫血清的制备

目的:为学生进行沉淀反应自制实验材料。方法:用羊血清免疫家兔制备兔抗羊免疫血清。结果:自制兔抗羊免疫血清和羊血清经环状沉淀、琼脂扩散多种沉淀反应试验,验证均与兔抗人血清和人血清的反应结果相近。结论:自制兔抗羊免疫血清与羊血清可替代抗人血清与人血清,作为学生进行沉淀反应的实验材料。