黄鳍棘鲷血清IgM的纯化及兔抗血清的制备

分别采用Sepharose-6B凝胶过滤层析、Phenyl Sepharose FF疏水作用层析和rProtein A Sepharose亲和层析技术纯化黄鳍棘鲷(Acanthopagrus latus)血清IgM,并将这3种层析纯化方法进行了比较。纯化产物进行SDS-PAGE,电泳结果扫描后经Band Scan5.0软件分析显示,单独使用Sepharose-6B凝胶过滤层析或Phenyl Sepharose FF疏水作用层析得到的IgM纯度只有56%左右;二者联合使用纯度可以达到69%,而rProtein A Sepharose亲和层析一步就可以达到89%的纯度;纯化得到的黄鳍棘鲷血清IgM的重链和轻链分子量分别为73.6kD和26.5kD。本研究还以rProtein A Sepharose亲和层析纯化的黄鳍棘鲷血清IgM为抗原,制备其兔抗血清,采用WesternBlot和双向琼脂扩散检测抗血清免疫学活性,并用间接ELISA检测其效价达到1∶25600,为进一步开展黄鳍棘鲷免疫学方面的研究奠定了基础。

VZV糖蛋白E基因胞外域的原核表达及其兔抗血清的制备

目的采用原核表达系统表达水痘-带状疱疹病毒(VZV)糖蛋白E(g E)基因的胞外域,将纯化后的目的蛋白免疫新西兰家兔,制备该蛋白特异性抗血清。方法构建原核表达质粒g E-p ET-32a(+),测序后将其转化至E.coli BL21,以异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导,获得VZV g E融合蛋白。采用SDS-PAGE电泳、Western blot法鉴定其特异性,利用Ni2+-NTA柱对g E蛋白进行纯化,复性后免疫新西兰家兔,获得兔抗VZV g E血清;采用间接免疫荧光、Western blot法和ELISA法检测该血清的特异性和效价。结果成功诱导表达出VZV g E融合蛋白,SDS-PAGE鉴定提示其主要为包涵体表达,浓度约为3.01 mg/ml。蛋白经Ni2+-NTA柱纯化后,纯度约为90%。Western blot法显示,经变性、复性后的该融合蛋白有良好的免疫反应性。用该蛋白免疫新西兰家兔后获得兔抗VZV g E血清。ELISA分析显示,该兔抗血清的效价为1∶6 400。结论成功构建了高效表达VZV g E蛋白的原核表达系统,获得较高纯度的g E蛋白,可以作为VZV亚单位疫苗的候选抗原,制备了特异性及效价均较高的兔抗VZV g E多克隆抗体,为VZV感染的临床诊断及治疗提供了重要的实验工具。

罗非鱼和斑点叉尾鮰血清IgM的纯化及兔抗血清的制备

为深入了解罗非鱼和斑点叉尾鮰免疫机理及建立相关免疫检测方法,采用rProtein A Sepharose亲和层析一步法纯化罗非鱼和斑点叉尾鮰血清免疫球蛋白(IgM),并制备其兔抗血清。结果表明,rProtein A Sepharose亲和层析法可以较好地分离获得高纯度的罗非鱼和斑点叉尾鮰血清IgM,通过SDS-PAGE电泳检测,发现罗非鱼血清IgM重链和轻链分子量分别为88.0、21.0 kDa,斑点叉尾鮰血清IgM重链分子量为101.0 kDa。以纯化的罗非鱼和斑点叉尾鮰血清IgM为抗原,制备其兔抗血清,间接ELISA检测其效价分别为1∶32000和1∶16000;Western blotting检测分析,发现罗非鱼和斑点叉尾鮰的兔抗血清分别在88.0和101.0 kDa附近各出现1条反应条带,说明其兔抗血清具有免疫活性。

鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的融合表达及兔抗血清的制备

以鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)Gt株基因组RNA为模板,通过RT-PCR扩增VP2基因,经EcoR I/SalI酶双酶切处理后与经相同酶切处理的pET30a原核表达载体连接,将酶切、PCR及序列鉴定正确的阳性重组子转化E.coliDE3菌,经IPTG诱导,表达的VP2蛋白通过Ni-NTA树脂纯化后,免疫新西兰白兔,制备兔抗血清,并对其进行间接ELISA、IFA和Western blot分析。SDS-PAGE分析表明,在IPTG诱导下成功表达了约为50kDa的His-VP2融合蛋白;间接ELISA检测制备的兔抗血清效价在1:25 600以上;IFA及Western-blot分析结果表明,其可特异性结合真核表达的VP2蛋白以及IBDV全病毒。研究结果提示,兔抗VP2血清可用于VP2蛋白及病毒的检测,为进一步研究IBDV分子生物学功能提供了物质基础。

提高兔抗血清制备量的措施

抗血清即免疫血清或高免血清．是指含有对某一特异性抗原起作用的抗体的血清。是用同一种抗原物质（菌苗、疫苗、类毒素等）反复多次注射动物体后，机体体液中尤其是血清中产生大量抗体．待抗体效价达到实验要求时，采集全血，析出的血清即为我们所需要的抗血清。制备血清需要一个较长的周期，也需要投入一定的物力和人力，所以尽可能获得多量的抗血清，是实验者们所期望的。实践证明，要想收获更多的抗血清，关键在于采血方法和血清分离两方面。下面就浅谈一下笔者收获兔抗血清的一点心得：

流行性乙型脑炎病毒SA14-14-2株囊膜蛋白的原核表达及其兔抗血清的制备

目的表达流行性乙型脑炎病毒(EEBV)的囊膜蛋白(E蛋白),制备该蛋白特异性兔抗血清,为建立诊断EEBV感染的检测方法奠定基础。方法将pET32a-E质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞,以终浓度为0.5 mmol·L^(-1)的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷于37℃下诱导蛋白表达8 h,在8 mol·L^(-1)尿素变性条件下,采用镍离子金属螯合亲和层析法对重组E蛋白进行纯化。透析复性后,以E蛋白为免疫原免疫新西兰兔制备兔抗血清,采用Western blot、酶联免疫吸附试验和免疫荧光分析法检测免疫血清中EEBV特异性抗体。结果成功表达了重组E蛋白,经纯化、复性后可从1 L培养物中获得23.8 mg具有生物活性的E蛋白,该蛋白能与抗EEBV单抗发生特异反应。免疫制备的兔抗血清能与E蛋白发生特异反应,抗体效价高达1×51 200;兔抗血清能与EEBV感染的细胞发生特异反应。结论成功表达了EEBV E蛋白并制备了特异性强、亲和力高的兔抗血清,为建立诊断EEBV感染的免疫学检测方法、有效防控流行性乙型脑炎奠定了基础。

大黄鱼血清IgM纯化及其兔抗血清的制备

分别用饱和硫酸铵二次盐析法和蛋白A亲和层析法对健康大黄鱼(Pseudosciaena crocea)血清中的免疫球蛋白(IgM)进行分离纯化,所得产物用SDS-PAGE进行检测。结果表明,蛋白A亲和层析法可以较好地分离到高纯度的大黄鱼血清IgM,产物的电泳胶中只有重链和轻链2个条带;饱和硫酸铵二次盐析法除了有这2个条带,还有很多杂带,而且蛋白A亲和层析法更为简便、快速,因此用蛋白A亲和层析法分离纯化IgM优于饱和硫酸铵二次盐析法;大黄鱼免疫球蛋白重链的分子量在76 kD左右;轻链分子量在28 kD左右。用纯化的大黄鱼IgM免疫实验兔,获得效价高达1∶40 960的兔抗鱼IgM血清。本实验所建立的蛋白A亲和层析法提取大黄鱼血清IgM可以方便、快捷地获得高纯度的产物,适合在实验室中纯化鱼类IgM。本研究所制备的兔抗大黄鱼IgM血清可为今后的相关研究工作打下基础。

鸡传染性贫血病毒衣壳蛋白的截短表达及其兔抗血清制备

通过制备原核表达鸡传染性贫血病毒衣壳蛋白(VP1),以进行抗VP1蛋白兔源血清制备。首先以CIAV M9905株基因组DNA为模板,通过PCR扩增N末端截短129个氨基酸的VP1基因片段(VP1Nd129),经EcoRⅠ/SalⅠ酶双酶切处理后与经相同酶切处理的p ET28a(+)载体连接,获得阳性重组子p ET-28a-VP1Nd129,将其转化入E.coli BL21(DE3)菌,经IPTG诱导,表达出VP1Nd129蛋白;后者通过Ni-NTA树脂纯化后,免疫新西兰白兔,制备兔抗血清,用间接免疫荧光试验和Western blot试验检测该血清的特异性,用酶联免疫吸附试验(ELISA)滴定其效价。结果显示,CAV VP1Nd129基因在大肠杆菌中正确表达,并主要以包涵体形式存在;纯化后免疫兔获得的抗血清可与真核细胞表达的全长VP1蛋白特异性反应。表明本试验成功对VP1蛋白进行截短表达,制备的兔抗血清反应性好,为深入开展CIAV的生物学功能奠定基础。

M13噬菌体肽库扩增及兔抗血清制备

为制备M13噬菌体多克隆抗体,将噬菌体十二肽原始文库进行大量扩增,作为免疫原制备兔抗M13的多克隆抗体血清并进行间接ELISA鉴定。结果表明,该多抗效价达1 1 048 576,说明此多抗可与扩增噬菌体文库发生很好的抗原抗体反应。将制备的噬菌体M13多克隆抗体与商业化M13抗体水平比较,制备多抗与商业化M13抗体效果相当。本研究成功制备兔抗M13噬菌体多克隆抗体,为深入研究噬菌体展示技术提供了材料。

1型肺炎兔抗血清的制备及其在多糖含量检测中的质控研究

建立一种新的1型肺炎兔抗血清制备方法,并进行型别特异性和方法专属性分析后,用于1型肺炎球菌多糖结合及结合疫苗制备过程中多糖含量的测定。以确定的免疫程序,用自制肺炎1型多糖结合物免疫新西兰白兔,采血后分离血清,免疫血清以免疫双扩散法和ELISA法与商品诊断血清比较;以速率比浊法分析型特异性和方法专属性。建立了自制家兔兔抗血清的制备方法,且该血清优于商品诊断血清,可达到速率比浊法型特异性和相应方法专属性要求,该方法可用于对1型肺炎球菌结合物及结合疫苗多糖含量测定。研究结果为肺炎球菌结合疫苗中多糖含量的检测提供了有力的保障。

正交设计对A群脑膜炎球菌兔抗血清制备条件的筛选

①目的应用正交设计筛选A群脑膜炎球菌灭活疫苗的免疫条件,为A群脑膜炎球菌灭活疫苗的应用提供实验依据。②方法将灭活A群脑膜炎球菌浓度调整为1×10^8 CFU/mL、1×10^9 CFU/mL、1×10^10 CFU/mL备用;选择家兔皮内注射、皮下注射、肌肉注射3种方式进行免疫,首次免疫与第二次免疫的时间间隔依次为2、3、4周;根据L9(34)正交设计方案对家兔进行免疫,第二次免疫7天后经家兔颈总动脉采血,分离血清,通过玻片凝集试验和ELISA试验测定兔抗A群脑膜炎球菌血清抗体效价。③结果A群脑膜炎球菌灭活疫苗免疫家兔后,抗原浓度为1×10^9 CFU/mL时血清中抗体的几何效价高于其他两组;皮内注射时抗体的凝集效价高于皮下注射和肌肉注射;免疫间隔时间为3周时,抗体的几何效价最高;差异均具有统计学意义(P<0.05)。A群脑膜炎球菌荚膜多糖与兔抗血清反应的抗体滴度在10^6及以上。④结论免疫剂量为1×10^9 CFU/mL、皮内注射、首次免疫与二次免疫时间间隔为3周时,是家兔的最佳免疫条件,为疫苗血清抗体的制备提供了实验依据。

鸡传染性法氏囊病超强毒VP1基因的原核表达及兔抗血清的制备

以鸡传染性法氏囊病超强毒Gx株基因组RNA为模板,通过RT-PCR扩增VP1基因,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切处理后与经相同酶切处理的pET-30a原核表达载体连接,将酶切、PCR及测序鉴定正确的阳性重组子转化BL21(DE3)感受态细胞,融合蛋白His-VP1经IPTG诱导表达后主要以包涵体形式存在。Western blot检测到约97ku的目的蛋白能够与特异性的VP1单克隆抗体反应。将纯化的目的蛋白免疫新西兰白兔后获得了抗VP1蛋白的血清。该血清能够与重组杆状病毒rBacGxVP1感染的sf9细胞发生特异性反应,而且其ELISA抗体效价达到1∶25600。鸡传染性法氏囊病超强毒VP1基因的表达与兔抗血清的制备为病毒的检测及VP1功能的研究提供了有效工具。

兔抗小鼠胚胎干细胞免疫血清对8-细胞胚胎发育的影响

目的制备兔抗小鼠胚胎干细胞免疫血清,观察其对小鼠胚胎发育的影响。方法用小鼠胚胎培养基稀释兔抗血清,分别稀释至50倍、100倍、200倍,用其对小鼠8-细胞胚胎进行培养,通过胚胎致密化、囊胚率、胚胎体外贴壁生长、细胞计数、胚胎移植和免疫荧光染色观察胚胎发育状况。结果形态学上50倍稀释的抗血清能够抑制8-细胞胚胎的发育甚至使其死亡;100倍稀释的抗血清能够延迟8-细胞胚胎的致密化,并使得胚胎在囊胚化过程中出现空泡化的现象;200倍稀释的抗血清作用不明显。未作免疫处理的兔血清与空白对照组差异不显著。100倍稀释的抗血清能够显著抑制囊胚内细胞团(ICM)的发育、囊胚细胞分布紊乱、胚胎细胞数目减少以及囊胚畸形率增加。虽然囊胚的碱性磷酸酶和Oct4均呈阳性,但经胚胎移植后都不能正常发育。结论兔抗小鼠胚胎干细胞免疫血清能够抑制小鼠胚胎致密化过程和囊胚内细胞团的发育,使囊胚出现空泡化,细胞分布紊乱,抑制胚胎着床。

A群脑膜炎球菌兔抗血清的制备及鉴定

目的制备A群脑膜炎球菌兔抗血清内部参考品,并进行鉴定。方法用新鲜培养的A群脑膜炎球菌混悬液按确定的免疫方案免疫日本大耳白兔,免疫完成后,按确定的采血时间点,经颈动脉采血,分离血清,进行凝集试验,观察兔抗血清凝集反应情况;采用免疫双扩散和ELISA法检测兔抗血清效价,同时利用火箭免疫电泳和ELISA法鉴定兔抗血清的血清学特异性。结果确定免疫方案为基础免疫4周后,加强免疫2周;免疫完成后第6天为最佳采血时间点。6份自制A群脑膜炎球菌兔抗血清的凝集试验效价均达到1︰160,与相应的多糖能够产生沉淀线的最大稀释倍数均不低于1︰8,与A群脑膜炎球菌荚膜多糖反应的抗体滴度均在106及以上,与C、Y和W135群脑膜炎球菌荚膜多糖之间无交叉反应。结论自制的A群脑膜炎球菌兔抗血清可作为A群脑膜炎球菌荚膜多糖疫苗的定性和定量检测的内部参考品,同时也为其他多糖类疫苗血清抗体的制备提供了参考。

鸡传染性贫血病毒VP2基因的原核表达及兔抗血清的制备

为了用大肠杆菌原核表达系统表达鸡传染性贫血病毒(CIAV)VP2基因片段,并制备其兔抗血清,试验以CIAV M9905株基因组DNA为模板,通过PCR扩增VP2基因,与p ET28a(+)载体连接后转化DH5α获得阳性重组子,将其转化E.coli BL21(DE3)菌,IPTG诱导表达出His-VP2重组蛋白,经Ni-NTA树脂纯化后免疫新西兰白兔制备兔抗血清,采用IFA和Western-blot检测该血清的特异性,ELISA测定其效价。结果表明:重组His-VP2融合蛋白的分子质量约为36 ku,以包涵体形式存在。制备的兔抗VP2血清效价在1∶6 400以上,可特异性结合真核表达的VP2蛋白,表明其反应原性较好。说明试验成功表达VP2蛋白,并制备出兔抗血清,可用于该蛋白与病毒其他蛋白之间的相互作用的进一步研究。

教学用兔抗人全免疫血清的制备与效价测定

目的探讨制备高效价兔抗人免疫血清的方法。方法将人全血清经弗氏佐剂完全乳化,采用一定的免疫程序免疫家兔,末次加强免疫5d后收集兔免疫血清,利用双向免疫扩散实验、对流免疫电泳和间接酶联免疫吸附法分别测定血清中抗体的效价。结果家兔在全程免疫后产生了高效价抗体,效价分别达到了1∶16、1∶8、1∶64 000。结论用人全血清免疫家兔,可以获得高效价的抗血清,为进一步实验教学和实验研究奠定了基础。

高效价兔抗人免疫血清的制备

动物免疫血清是我们在医学教学、科研及临床检验工作中，经常用到的试剂，高效价免疫血清制备的关键在于佐剂的正确使用，抗原剂量要适中，免疫间隔时间长短要适当等，注意这些方面有利于高效价免疫血清的制备。

免疫微球吸附实验的建立──Ⅰ.兔抗人血清IgG检测

用免疫微球技术来检测抗原抗体是目前免疫诊断试剂研究的一个新方向．本文介绍了兔抗人血清ＩｇＧ的制备和利用彩色微球检测该抗体的检测方法；同时，探讨了影响实验敏感性的温度、浓度和ｐＨ值等主要因素．

以兔抗鼠淋巴细胞血清为非条件刺激的条件性免疫抑制

采用一种生物类免疫抑制剂—兔抗鼠淋巴血清 (rabbitanti ratlymphocyteserum ,ALS)为非条件刺激(UCS)、糖精水为条件刺激 (CS) ,以双瓶给水法置于鼠笼前端饮用偏好侧。在一次性CS—UCS结合训练后 ,单独再次给予CS ,使卵清蛋白 (OVA)免疫过的大鼠表现出脾淋巴细胞对有丝分裂原PWM的增殖反应降低、血抗OVA抗体的总量及脾内抗OVA抗体生成细胞的减少。但动物未表现出条件性味觉厌恶的行为反应。这些结果表明条件性免疫抑制与味觉厌恶性行为条件反射没有必然联系 ,并非是厌恶行为反应或情绪应激的伴随产物 ,UCS也并非必需具有感觉的毒副作用。

SARS-CoV-2非结构蛋白兔抗血清的制备及其在灭活疫苗质量监控中的应用

目的制备SARS-CoV-2非结构蛋白1(non-structure protein 1,NSP1)兔抗血清,并用其检测SARS-CoV-2NSP1在灭活疫苗生产过程中的含量变化,为建立灭活疫苗纯度、工艺质量监控方法奠定基础。方法选择带DE3的E.coli原核表达系统表达SARS-CoV-2 NSP1全长蛋白,纯化后免疫日本大耳白兔,共免疫6次,每次间隔14 d,采集全血,获得NSP1兔抗血清;以纯化的NSP1蛋白为抗原,Western blot法鉴定兔抗血清纯度,同时利用RD细胞表达NSP1-eGFP融合蛋白,裂解后作为抗原对NSP1兔抗血清进行特异性鉴定;以SARS-CoV-2灭活疫苗生产过程中1~4 d细胞裂解液及纯化后病毒颗粒为抗原,NSP1兔抗血清及M、S、E、N兔抗血清为一抗,Western blot法鉴定样品中抗原蛋白的含量变化。结果成功表达带有GST标签的NSP1蛋白,并获得相应的兔抗血清,且抗原纯度较高;制备的兔抗血清能正确识别真核表达的NSP1-eGFP融合蛋白,并能鉴定灭活疫苗生产过程中蛋白含量的变化;灭活疫苗成品中不含NSP,疫苗纯度高;E蛋白与其他3种主要结构蛋白M、S、N的表达时相不同,早期表达晚期下降。结论制备的NSP1兔抗血清可用于NSP1和E蛋白功能的研究,以及灭活疫苗生产过程中纯度和质量的监控。